Поколение и изоляции арестован клеточного цикла клетки с сложных получен

Резюме

Анеуплоидия приводит к нестабильности генома, который в конечном итоге производит арестован клеточного цикла клетки с сложными получен. Этот документ предоставляет простой и удобный метод для изоляции анеуплоидных клеток с сложных получен, которые перестают разделить.

Аннотация

Хромосома неправильного сегрегации приводит к анеуплоидии, условие, в котором клетки гавани несбалансированным хромосома номер. Несколько линий доказательств настоятельно указывают, что анеуплоидия вызывает нестабильность генома, в конечном счете генерации клеток с сложных получен, которые арестовать их распространения. Выделение и характеристика клетки укрывательство комплекс получен имеют решающее значение для изучения последствий несбалансированной хромосома номер на физиологии клетки. На сегодняшний день, были созданы методы не надежно изолировать таких анеуплоидных клеток. Этот документ предоставляет протокол для обогащения и анализ анеуплоидных клеток с сложных получен, используя методы стандартных, недорогой техники культуры тканей. Этот протокол может использоваться для анализа нескольких функций анеуплоидных клеток с сложными получен, включая их искусственное старение связанные секреторной фенотип, про воспалительные свойства и способность взаимодействовать с иммунных клеток. Поскольку раковые клетки часто гавани диспропорций в число хромосом, важно расшифровать как анеуплоидия влияет физиологии клетки в нормальных клеток, с конечной целью раскрытие обоих его про - и анти - tumorigenic эффект.

Введение

Ошибки в процессе хромосома сегрегация приведет к анеуплоидии, состояние, характеризующееся хромосома номер, который не является кратной гаплоидным дополнение^1,2,3,4. Анеуплоидных получен триггера репликации стресс, который генерирует далее геномная нестабильность^5,6,,78,9,10, увеличивает кариотип сложности и, в конечном счете, приводит к арест клеточного цикла субпопуляции клеток¹⁰. Цель метода, представленные здесь — для создания и отделить такого субпопуляция от Велоспорт клетки. Применяя методы недорогой культуры ткани, этот протокол облегчает изоляции и характеристика клеточного цикла арестован анеуплоидных клеток с сложными получен. Эти клетки называются ArCK (арестован с сложными кариотипа) клеток и их euploid Велоспорт коллегами как элементы управления.

Этот протокол является первым должен быть создан для этой цели и позволяет для изоляции и дальнейшего изучения ArCK линий, включая, но не ограничиваясь, их искусственное старение и связанные старение секреторной фенотип (SASP), их про воспалительных особенности и их способности взаимодействовать с иммунных клеток. Представленные здесь метод был разработан в клетках человека непреобразованной, увековечен, но еще не были протестированы в линиях рака. Некоторые трансформированных клеток могут быть чувствительны к арест клеточного цикла из-за подавления одного или нескольких путей; Таким образом дальнейшие проверки должны выполняться в других клеточных линий.

протокол

Состояния культуры

HTERT ПЭС-1 клеточная линия была культивировали в Дульбекко изменение Eagle среднего (Таблица материалов) с 10% плода Bovine сыворотки, 2 мм L-глютамина и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки инкубировали при 37 ° C с 5% CO₂ в увлажненной среде. Описанные ниже протокол был разработан с помощью 10-см блюда и все технические детали сообщили коснуться тех блюд. При использовании различных блюд, масштабирование вверх или вниз соответственно.

1. Синхронизация клеток ПЭС-1

1. Использование свежей талой клетки, которые не прошли более чем 15 ходов для всех экспериментов. День 1 оттепель и обойтись ~2.5 - 5.0 x 10⁵ ПЭС-1 hTERT клеток в культуре ткани 10 см блюдо. Добавить 8 мл стандартного роста средних и инкубировать на ночь. Определите номер ячейки, используя счетчик стандартная ячейка (например Горяева).
   Примечание: Плотность ячеек относится к условиям роста клеток ПЭС-1. Условия роста может варьироваться среди различных клеточных линий; Рассмотрим, регулируя их соответственно.
2. На 2 день синхронизируйте клетки на границе G1/S аспирационных постоянный рост средних и добавляя среднего 8 мл, содержащих тимидина 5 мм.
   Примечание: Тимидина концентрации и продолжительности лечения могут различаться различных клеточных линий. Рекомендуется выполнять экспериментальные экспериментов для определения наилучшие условия для строки ячейки для проверки.
3. День 3, 24 ч после добавления тимидина среднего (шаг 1.2), освобождение от блока тимидина аспирационных средних и стиральные клетки три раза с ПБС. Добавить 8 мл постоянный рост средних и вернуть инкубатора пластины.

2. поколение анеуплоидных клеток путем вмешательства в деятельность митотическая киназы Mps1

1. На 3 день, 6 ч после освобождения от блока тимидина (шаг 1.3; это около 3-6 ч, прежде чем вводить клетки митоз), аспирационная среднего, мыть раз с ПБС и замените носитель, содержащий 500 Нм reversine (ингибитор Mps1).
   Примечание: Введите ПЭС-1 клетки митоз 9-12 ч после тимидина вымывания^10,11. Однако кинетика клеточного цикла различаются среди различных клеточных линий. Таким образом важно определить те Кинетика в пилотных опытов, выполняя анализ клеточного цикла установленными методами (например, путем измерения содержания через СУИМ анализ ДНК). Кроме того оптимальные рабочие концентрации ингибитора Mps1 может варьироваться между клеточных линий. Предыдущие эксперименты с использованием RPE1 клетки были успешными с помощью reversine в рабочей концентрации 500 Нм^10,,11-¹². Рекомендуется выполнять экспериментальные экспериментов для определения оптимальной концентрации для линии клетки для проверки.
2. День 4, 12 ч после reversine лечения (около 6 ч после того, как клетки были в митозе) аспирационная reversine среднего и вымыть клетки три раза с ПБС. Добавить 8 мл постоянный рост среднего к пластине и возвращение клетки в инкубаторе.

3. Удаление анеуплоидных клеток Велоспорт и обогащения ArCK населения

1. День 6, около 72 ч после того, как ячейки введите первый митоз (шаг 2,2; это около 66 h после вымывания reversine, что соответствует примерно 2-3 цикла клетки), аспирационная среднего, мыть раз с ПБС и заменить средства, содержащие 300 Нм Нокодазол.
   Примечание: Последние работы показал, что НПП-1 клетки укрывательство анеуплоидных получен genomically неустойчивы и арестовать их распространения о 2-3 циклов клеток после первого неисправный митоз¹⁰. Однако этот кинетики могут отличаться между различных клеточных линий. Таким образом крайне важно для выполнения экспериментальных экспериментов для определения правильного времени для удаления анеуплоидных клеток Велоспорт.
2. День 7, 12 ч после Нокодазол лечения аспирационная среднего и добавить 3 мл ПБС к пластине. Стряхните митотическая клетки путем выстукивать стороне пластины. Поверните пластину между каждой нажмите Разрешить даже удаление митотическая клеток.
3. Чтобы обеспечить полное удаление митотическая клеток, повторите процесс трясти off для нескольких раундов (рекомендуется 3 - 5 раз), аспирационных и добавление 3 мл ПБС между каждого раунда.
4. После сотрясения нежно аспирационная любой жидкости, которые присоединились к крышке или края плиты. Вкратце проверьте пластины под микроскопом, при 10-кратном. Убедитесь, что наблюдаются несколько митотическая клетки. Если более пяти митотическая клетки видны под 10 X цели, повторите еще один раунд трясти-Off.
   Примечание: Митотическая клетки представляется округлые и может быть частично отдельностоящий после сотрясения off. Важно обеспечить полное удаление митотическая клетки прежде чем подвергать клетки в следующий раунд лечения Нокодазол. Неспособность сделать это может привести к смерти митотическая клетки или привести к генерации тетраплоидные клеток.
5. После окончательного трясти off Вымойте клетки один раз с 5 мл ПБС. Добавить 8 мл среды, содержащие 330 Нм Нокодазол в пластину и инкубировать в течение 12 ч.
6. Повторите Нокодазол лечения трясти выключено (шаги 3.1-3.5) каждые 12 ч до тех пор, пока не митотическая клетки наблюдаются после инкубации. Как правило рекомендуется 4-5 раундов лечения трясти выключено.
   Примечание: Информация, представленная здесь ссылки на ячейки ПЭС-1. Количество раундов лечения/трясти-OFF может варьироваться среди различных клеточных линий. Чтобы избежать длительного и ненужного воздействия Нокодазол важно тщательно определить, в эксперимент, количество раундов, необходимых для эффективного и полного удаления анеуплоидных клеток Велоспорт.
7. После 4-5 раундов Нокодазол лечения трясти выключено (шаги 3.1-3.6) добавляют 10 мл постоянный рост средних и инкубировать. Позволяют клеткам отдых для 12-24 ч до манипуляции или анализа использования в будущем.
   Примечание: После окончательного трясти, клетки оставшиеся на табличке клеточного цикла арестован и, как недавно показано¹⁰, гавань комплекс получен. Эти клетки называются ArCK (арестован с сложными кариотипа) клетки. Рекомендуется выполнять анализы на ArCK населения в течение недели изоляции.
8. При необходимости оценить процент арестованных клеток с сложными получен, собирать и подсчитать ячейки от каждого встряхнуть off с использованием стандартной ячейки счетчика.

Рисунок 1: Общая схема метода, используемого для создания и изолировать анеуплоидных клеток с сложными кариотип (ArCK) и представитель изображений. (A) схема ArCK клеток поколения и изоляции протокол. (B) представитель изображения ПЭС-1 hTERT клеток на каждом этапе лечения. Последняя группа (изложенные в красном) представляет изолированных клеток ArCK. Шкалы и 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. характеристика населения ArCK

1. Подтверждение успешной изоляции населения ArCK, выполнив следующие анализы.
   1. Ослов бета галактозидазы окрашивание (маркер старение) использование коммерчески доступных комплект (см. таблицу материалы).
   2. Мера секрецию провоспалительных цитокинов, таких как CCL2, используя имеющиеся наборы (см. таблицу материалы).
   3. Подтверждают повышение уровня р53 ингибиторов клеточного цикла, p21, p16 на западной помарке.
      Примечание: Надлежащим образом контролировать эти анализы, ArCK населения следует сравнить с euploid и анеуплоидных клеток Велоспорт. Первый является низкий проход, одичал типа ПЭС-1 hTERT клетки экспоненциально растет. Последний может быть получено вызывая хромосома неправильного сегрегации в ПЭС-1 hTERT и уборки клеток 72 ч после первого аберрантных митоз. Для этого, выполните описанные выше от шага 1.1 и хлебоуборка клетки прямо перед началом первого лечения Нокодазол (шаг 3.1) протокол.
2. Выполнение последовательности одной ячейки для оценки кариотипа клеток арестованных.
   Примечание: Одноклеточных последовательности является устоявшейся метод для определения хромосомных и югу хромосомные изменения всей популяции клеток в одну ячейку уровня¹³. Подробные процедуры как для выполнения одной ячейки последовательности можно найти в других¹⁰.

Результаты

Этот метод использует систему культуры ткани в vitro изолировать анеуплоидных клеток с сложных получен, которые арестовать их распространения. Это население называется ArCK (арестован с сложными получен) клетки. На рисунке 1A показана схема эксперимента. Одичал тип Велоспорт ПЭС-1 hTERT клетки синхронизируются на границе G1/S с тимидин и лечение с Mps1 ингибитор побудить хромосома неправильного сегрегации. Яд Нокодазол шпинделя добавляется в клетки 72 ч после индукции хромосома неправильного сегрегации. 12 ч после Нокодазол лечения, анеуплоидных клеток, которые по-прежнему способны размножаться введите митоз и оказались в ловушке в этой стадии клеточного цикла из-за вмешательства с микротрубочек полимеризации. Эти ловушке клетки затем легко снимаются, мягкий с трясти. Процесс трясти офф является повторный 3 - 5 раз для обеспечения полного удаления Велоспорт клетки. Рисунок 1B показывает представитель изображения ПЭС-1 клеток на каждом этапе лечения.

ArCK клетки отображения повышенного уровня ингибиторов клеточного цикла, например, p53, p21 и p16, по сравнению с euploid и анеуплоидных Велоспорт ячеек, как показано на рисунке 2А. Кроме того Рисунок 2B показывает положительные β-галактозидазы пятнать в клетках ArCK по сравнению с клетки euploid управления, устоявшихся маркера для клеточного старения.

Рисунок 2: представитель результаты, используя клетки ArCK. (A) западной помарке оценки уровней ингибитор клеточного цикла в euploid анеуплоидных Велоспорт и ArCK клетки. Западный анализ помаркой были определены уровни p53, p21 и p16. Актин служил загрузки элемента управления. (B) β-галактозидазы пятнать оценки уровня старения в ArCK клетках. Связанные старения β-галактозидазы (β-Gal) деятельности было определено в euploid клетки и клетки ArCK. Шкалы и 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Этот арест клеточного цикла является отличительной особенностью анеуплоидных клеток с сложными получен, как свидетельствует анализ представительных кариотипа от одноклеточного виртуализации в рисунке 3, в котором клетки ArCK отображать несколько случайных хромосома прибылей и убытков. Этот вывод заключается в том, в полном согласии с предыдущих докладов¹⁰.

Рисунок 3: представитель одноклеточных последовательности клеток ArCK. Сегментация участков, показаны кариотипа клеток шести представитель ArCK. Сегментация участки показывают количество всех хромосом от 1 до X относительно euploid ссылку копировать в масштабе₂ журнала (дикого типа ПЭС-1 линия диплоидных клеток женской происхождения). Хромосома успехи выделяются в красный, хромосома потери в зеленый цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот новый метод для создания и обогатить для арестованных клетки с сложными получен (ArCK) позволяет для изучения клеток, которые имеют несколько хромосома прибыли или убытки и прекратить делить. Метод установки был разработан для содействия изоляции ArCK клеток в быстрый и надежный способ.

Наиболее важным этапом в этом assay строго контролировать сроки лечения наркомании и, самое главное, удаление анеуплоидных клеток Велоспорт. Для получения оптимальных результатов сроков лечения Нокодазол и трясти офф имеет особое значение для обеспечения что Велоспорт клетки удаляются из пластины, хотя они все еще округлые и митотического, предотвращая возможность митотическая клеточной гибели или проскальзывания в G1, потенциально создание тетраплоидные населения. Не рекомендуется, что сроки трясти-Off отклоняется более чем в двух часах от инкубации рекомендуется 12-h Нокодазол.

Будущие исследования по ArCK клетки имеют потенциал для содействия более глубокому пониманию как комплекс получен влияют на физиологии клетки. В частности недавнее исследование продемонстрировал, что клетки иммунной системы способны взаимодействовать с и триггер иммунной Распродажа ArCK клеток¹⁰. Метод, описанный здесь обеспечивает отличной отправной точкой для дальнейшей характеризации ArCK ячейки, включая уточнение молекулярных механизмов, лежащих в основе иммунной Распродажа непреобразованной клетки и исследования как онкогенных преобразования может обойти этот механизм наблюдения, важнейший вопрос в поле^14,15.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Thermofisher	11995-073
Thymidine	Sigma Aldrich	T1859
Reversine	Cayman Chemical Company	10004412
Nocodazole	Sigma Aldrich	M1410
Anti-p53 antibody	Santa Cruz	sc-126
Anti-p21 antibody	Santa Cruz	sc-6246
Anti-p16 antibody	BD	554079
Senescence b-Galactosidase Staining Kit	Cell Signaling Technology	9860
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit	R&D Systems	ARY005B