فحص SiRNA الإنتاجية العالية لإصابة الخلايا الظهارية الكلوروبيكرين والقرنية المستحثة بفلوريد الهيدروجين

Summary

فحص الحمض النووي الريبي المثبطة صغيرة إنتاجية عالية هو أداة هامة يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية لإصابة الظهارة القرنية الكيميائية أكثر سرعة. وهنا، نقدم التنمية والتحقق من التعرض لنماذج وأساليب لفحص إنتاجية عالية من فلوريد الهيدروجين وبكرين-الناجمة عن إصابة القرنية الظهارية.

Abstract

المستحثة بأنها سامة لإصابة العين حالة طوارئ العين حقيقية لأن المواد الكيميائية لديها القدرة على سرعة إلحاق أضرار كبيرة من الأنسجة. علاجات لإصابات القرنية المستحثة بأنها سامة مؤيدة بصفة عامة نظراً لعدم وجود لا علاجية محددة لعلاج هذه الإصابات. في الجهود الرامية تطوير علاجات والمداواة للعناية بالتعرض، يمكن أن يكون هاما فهم الآليات الجزيئية والخلوية لهذه الإصابات. ونحن نقترح أن استخدام فحص الحمض النووي الريبي (siRNA) المثبطة صغيرة عالية الإنتاجية يمكن أن تكون أداة هامة يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية لإصابة الظهارة القرنية الكيميائية أكثر سرعة. siRNA هي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي جزيئات النيوكليوتيدات 19-25 طويلة واستخدام الجينات بوستترانسكريبشونال إسكات ممرا للحط من مرناً لها التماثل siRNA. يمكن ثم دراسة تخفيض الناتج من التعبير عن الجينات محددة في الخلايا المعرضة السمية للتأكد من الوظيفة من تلك الجينات في الاستجابة الخلوية لأنها سامة. وترد بالتنمية والتحقق من الصحة في المختبر تعرض نماذج وأساليب إنتاجية عالية فحص (HTS)-فلوريد الهيدروجين (HF) وبكرين-(CP) الناجم عن إصابة العين في هذه المقالة. على الرغم من أن علينا تحديد هذه سميات اثنين، أساليب عملنا وقابلة للتطبيق لدراسة أخرى سميات مع إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول التعرض للسمية. مستضد تي كبيرة SV40 خلد خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 اختيرت للدراسة. اختير بقاء الخلية وإنتاج إيل-8 كنقاط النهاية في البروتوكول الفحص. العديد من التحديات المرتبطة بتطوير للتعرض للسمية وتعرض الخلية الثقافة أساليب مناسبة للدراسات HTS. إنشاء نماذج HTS لهذه سميات يسمح لمزيد من الدراسات فهم أفضل لآلية العلاجات المحتملة لإصابة العين الكيميائية للإصابة وعلى الشاشة.

Introduction

المستحثة بأنها سامة لإصابة العين حالة طوارئ العين حقيقية لأن المواد الكيميائية لديها القدرة على سرعة إلحاق أضرار كبيرة من الأنسجة. ولسوء الحظ، علاجات لإصابات القرنية المستحثة بأنها سامة فقط مؤيدة بصفة عامة نظراً لعدم وجود لا علاجية محددة لعلاج هذه الإصابات. استراتيجية العلاج الحالي غير محددة وتشمل أساسا العلاجات العلاجية الموضعية مثل مواد التشحيم، والمضادات الحيوية، وسيكلوبليجيكس تليها مضادات الالتهاب (مثلاً، المنشطات) مرة القرنية قد أعيد متظهرنه^{1 ،2}. أفضل الحالية العلاج العلاجية الخيارات المتاحة، وعلى الرغم من التوقعات الطويلة الأجل ضعيف عموما بسبب يعكر القرنية التدريجي و^2،نيوفاسكولاريزيشن³.

تقليديا قد استخدمت نماذج حيوانية التحقيق في المواد الكيميائية السمية وفهم آليات الإصابة. بيد أن الدراسات الحيوانية مضيعة للوقت ومكلفة. وهناك أيضا الجهود الرامية إلى الحد من التجارب الحيوانية. على سبيل المثال، قد تصل التشريعات (EC 1907/2006) في الاتحاد الأوروبي أحكاما ترمي إلى الحد من التجارب الحيوانية. وتشمل الأحكام شرط أن الشركات المشاركة في البيانات تجنبا للتجارب الحيوانية والحصول على موافقة من وكالة المواد الكيميائية الأوروبية قبل إجراء الاختبارات المقترحة على الحيوانات. تحت أحكام الوصول، الحيوان اختبار ينبغي أن يكون الملاذ الأخير. وهناك أيضا "اللائحة الأوروبية لمستحضرات التجميل" (EC 1223/2009) أن تدريجيا إلى اختبار مستحضرات التجميل في الحيوانات. عندما يتم إجراء الدراسات الحيوانية، هي تسترشد بمبادئ 3Rs (الصقل والحد، واستبدال)، التي توفر إطارا لإجراء بحوث الحيوانات أكثر إنسانية، وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة، واستخدام البدائل غير الحيوان حيثما كان ذلك ممكناً. لهذه الأسباب، وسعت مجال علم السموم اعتماد فحوصات في المختبر التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية لسمية ويمكن القيام به في أعلى إنتاجية⁴. هذا نهج علم السموم فنية حيث يتم تعريف سميات وظيفتها وليس حصرا بالكيمياء. اتخذت خطوة أخرى، وظيفية التعرضات تسعى إلى فهم الأدوار التي تلعب جينات محددة في آثار سميات⁵. مع تطبيق التكنولوجيا siRNA، يمكن القيام به للتحقيق في وظيفة الجينات في الاستجابات الجزيئية والخلوية سميات شاشات في إنتاجية عالية. siRNA هي مزدوجة جزيئات الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل التي هي 19-25 النيوكليوتيدات طويلة أن الاستفادة من وظيفة الجينات النسخي إسكات المسار الحالي في جميع خلايا الثدييات⁶. هذه هي صناعيا ومصممة لاستهداف جين محددة. عند إدخال في خلية، يتم معالجة في siRNA وواحدة حبلا، حبلا الدليل، يتم تحميلها في المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC). SiRNA يوجه RISC إلى منطقة متكاملة في جزيء مرناً، ويحط RISC مرناً. ينتج عن هذا الحد التعبير عن الجينات المحددة. يمكن ثم دراسة تخفيض الناتج من التعبير عن الجينات محددة في الخلايا المعرضة السمية للتأكد من الوظيفة من تلك الجينات في الاستجابة الخلوية لأنها سامة. وقد استخدمت هذا نهج زيادة فهم آليات قابلية مادة الريسين والتعريفي المعتمدة على فهرس CYP1A1^7،8.

وقد مفصلة قائمة تقييم خطر الإرهاب الكيميائي (كترا) وقوائم المواد الكيميائية الصناعية السامة (عرة) تحديد المواد الكيميائية استناداً إلى السمية واحتمال أن يكون أطلقت أثناء الإرهاب أو الحرب، أو حادث صناعي الحدث⁹. ونحن نطبق إنتاجية عالية siRNA فحص نهج توكسيكوجينوميك (HTS) لدراسة سميات قائمة كترا، التي تم تحديدها للخطر عالية للاستخدام في حادث إرهابي. علم السموم التقليدية يسعى إلى فهم الآثار السلبية للمواد الكيميائية على الكائنات الحية؛ ومع ذلك، يتعين علينا زيادة رغبة في فهم آليات الإصابة غرض إعلام تطوير المداواة والنهج العلاجية، وربما، لاكتشاف الجزيئات التي يمكن أن تكون هدفا للتنمية العلاجية. ويمكن اعتبار هذا الجهد في بعض طرق مماثلة لاستخدام الفحص siRNA عالية الإنتاجية وفحوصات الخلية على أساس في عملية اكتشاف المخدرات¹⁰. وستكون فرق كبير أن اكتشاف المخدرات عادة ما يسعى هدفا المفرد لاكتشاف العلاج بينما من غير المحتمل إلى حد ما أن هناك هدفا فريدة ذات قيمة علاجية عالية لعلاج التعرض للسمية في نهجنا. ونحن نتوقع أن أي نموذج العلاج الفعال للتعرض للسمية ستتطلب اتباع نهج متعدد الأوجه لتحقيق القيمة العلاجية العالية، ويجوز إبلاغ البيانات توكسيكوجينوميك حيوية نموذج علاج فعال.

أتمتة Benchtop يجلب منهجية عالية الإنتاجية إلى مختبرات خارج الصناعات الصيدلانية أو التكنولوجيا الحيوية. الدراسات في المختبر في معهد بلدنا تاريخيا فحوصات التقليدية التي هي منخفضة الإنتاجية^11،،من¹²¹³. في السنوات القليلة الماضية، انتقلت المختبر باستخدام الروبوتات benchtop إجراء فحص siRNA عالية الإنتاجية. هنا، نحن نقدم صقل نماذج خلية العين ووضع في المختبر طرق التعرض لفلوريد الهيدروجين (HF) وبكرين (CP) مناسبة لفحص siRNA عالية الإنتاجية. وهدفنا هو تحديد الجزيئات التي تنظم الضرر الخلوي استجابة لهذه السموم. وتشمل أهداف المكتبة siRNA اخترنا ز إلى جانب البروتين مستقبلات البروتين مؤنزم، البروتياز، phosphatases، قنوات أيون وأهداف أخرى يحتمل أن تكون دروجابل. التردد و CP اختيرت للدراسة بالإسناد الترافقي كترا قائمة وكلاء مع تقارير الحوادث الصناعية توكسنيت للعثور على تلك التي تقدم أعظم خطر الإصابة العينية عبر بخار التعرض^9،14. CP (الصيغة الكيميائية Cl₃CNO₂، رقم 76-06-2) أصلاً كغاز المسيل للدموع في الحرب العالمية الأولى¹⁵. حاليا استخدامه تبخير زراعية والوظائف ك الخيطيات، ومبيد للفطريات والمبيدات الحشرية¹⁶. فلوريد الهيدروجين (HF) يستخدم في العمليات بما في ذلك الألكلة في مصافي النفط والفلوره الكهروكيميائية للمركبات العضوية¹⁷. التردد (الصيغة الكيميائية ذات التردد العالي، CAS رقم 62778-11-4) غاز ولكن في شكله مائي من حمض الهيدروفلوريك (الصحة، CAS رقم 7664-39-3). ولذلك، انتخبنا لاستخدام هيئة في أعمالنا في الخلية نماذج التعرض. مستضد تي كبيرة SV40 خلد خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 اختيرت للدراسة. بقاء الخلية وعلامة التهاب إيل-8 اختيرت كنقاط النهاية نظراً للأهداف التي تشارك في الضرر الخلوي ينبغي أن تنعكس في موت الخلية والاستجابة الالتهابية. على وجه التحديد، إذا كانت هدفا تقوم بدور وقائي في التعرض للسمية، موت الخلية و/أو إنتاج سيتوكين التحريضية ينبغي زيادة عندما يتم تثبيط التعبير الهدف قبل siRNA. على العكس سيكون صحيحاً للأهداف التي تقوم بدور سلبي. التهاب مزمن يظهر أيضا، أن تلعب دوراً في أمراض القرنية بعد التعرض، والتدخل في مسارات موت الخلية قد يحسن النتائج السريرية^2،18.

Protocol

1-خلية ثقافة الصيانة

1. تنمو الخلية خط هسيك SV40 في 5% CO₂, 37 درجة مئوية والرطوبة 90% في 12 و دميم مع 15% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% ل الجلوتامين، 10 عامل نمو البشرة من ميكروغرام/لتر (مماثلة)، والإنسولين 5 مغ/لتر.
2. مرور خط الخلية كل 3 إلى 4 أيام (اعتماداً على كثافة البذر) التأكد من أن كونفلوينسي لم يتجاوز 80% أثناء صيانة الثقافة.
3. فصل الخلايا من قوارير باستخدام حل مفرزة (14 مل الحل لكل قارورة² 150 سم) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 8 دقيقة.
4. تحييد الحل مفرزة مع زيادة حجم الخلية الثقافة المتوسطة متساوية وبيليه الخلايا في أنابيب مخروطية 50 مل بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 160 x ز.
5. إعادة تعليق بيليه خلية في المتوسط (20 مل لكل قارورة² 150 سم).
6. عد الخلايا بالعداد الآلي خلية يده والبذور في قوارير جديدة في كثافة التي تسمح لها بأن تنمو لمدة 3 إلى 4 أيام دون تجاوز 80% كونفلوينسي.

2-لوحة خلايا للتجريب

1. تحقق من قوارير SV40-هسيكس بالضوء الطوري لضمان أن كونفلوينسي أقل من 80% وتقييم الصحة العامة الخلية.
2. فصل وبيليه، ريسوسبيند، وتعول SV40-هسيكس من قوارير كما هو موضح في الخطوات 1، 3 إلى 1، 6 خلية ثقافة الصيانة. استخدام هسيك SV40 المتوسطة التي تحتوي على الهيدروكورتيزون 0.5 ميكروغرام/ملليلتر (المتوسط هكورت) إلى ريسوسبيند الخلايا.
3. في زجاجة متوسطة الحجم المتاح، وإعداد تعليق SV40-هسيكس في خلايا/مل 17,857 في حرارة قبل هكورت المتوسطة.
   1. إعداد كمية كافية من تعليق خلية لعدد اللوحات يكون المصنف.
   2. البذور الحد ني لوحات 14 × 96-جيدا مع خلايا لكل لوحة مكتبة siRNA دراستها.
4. دوامة الزجاجة تعليق الخلايا بالتساوي وصب كمية كافية من تعليق خلية في خزان في العش شاكر المداري معالج السائل الآلي وتخزين الزجاجة التي تحتوي على تعليق خلية على 37 درجة مئوية الاحترار لوحة أثناء الطلاء الخلية عملية.
5. استخدام معالج السائل الآلي لإضافة خلايا إلى لوحات في كثافة الخلايا 1000 في البئر (5000 خلايا/سم²) في 70 ميليلتر من المتوسطة كل من صفيحة 96-جيدا جيدا. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
   1. تشغيل شاكر المداري 100 لفة في الدقيقة باستمرار أثناء عملية البذر.
   2. مزيج تعليق خلية ثلاث مرات (140 ميليلتر ميكس وحدة التخزين) باستخدام معالج السائل الآلي.
   3. نضح ميليلتر 140 تعليق خلية والاستغناء عن 70 ميليلتر في كل بئر من لوحات ثقافة الخلية اثنين.
   4. كرر الخطوتين 2.5.3 و 2.5.4 إلى كل الألواح قد تم المصنف مع الخلايا.
   5. إعادة ملء الخزان تعليق خلية حسب الحاجة أثناء عملية البذر.
6. بعد قد تم تبذر اللوحات، إزالتها من معالج السائل الآلي واحتضانها لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل نقلهم إلى حاضنة ثقافة خلية.
7. تقييم كثافة الخلية لكل بئر لكل لوحة في صباح اليوم التالي باستخدام نظام تصوير الآلي الذي يقع في حاضنة ثقافة خلية واستبعاد أي ألواح من الدراسة التي الآبار الداخلية التي ليست بين 15 في المائة و 22 في المائة روافد.

3-ترانسفيكت الخلايا مع siRNA

1. الحصول على لوحات مكتبة siRNA من البائع قبل تهيئتها لتحتوي على 80 أهداف siRNA للوحة الواحدة (انظر الشكل 4)، مع الأعمدة 1 و 12 ترك فارغاً.
2. إعادة تشكيل لوحة مكتبة siRNA مع المخزن المؤقت siRNA بتركيز نهائي 2 pmol/ميليلتر لكل بئر siRNA وفقا لإرشادات الشركة المصنعة¹⁹.
3. ترانسفيكت الخلايا ح 24 بعد البذر مع 4 pmol/بئر siRNA ومن تعداء كاشف 0.3 ميليلتر/جيدا. تنفيذ كافة الخطوات وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة كاشف تعداء (انظر الشكل 4 لتخطيط اللوحة)²⁰.
   1. أداء جميع ترانسفيكشنز استخدام معالج سائل الآلي، واستخدام 25 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات. استخدام مربعات نصيحة قبل تكوين لمعالجة الآبار التي سوف تكون ترانسفيكتيد فقط.
   2. استخدم الجزء العلوي نصف لوحة المكتبة ترانسفيكت مجموعة من ست لوحات تكرار يشار "أعلى لوحة تعيين" (ستة يتطابق كل siRNA, n = 6).
   3. استخدم الجزء السفلي من لوحة المكتبة ترانسفيكت لمجموعة مختلفة من ست لوحات تكرار نصف المشار إليها كما "أسفل لوحة تعيين" (ستة يتطابق كل siRNA, n = 6).
   4. استخدام مصطلح "تعيين لوحة كاملة" لوصف لوحات الخلية 12 أنه قد تم transfected مع siRNA مكتبة.
   5. ترانسفيكت الآبار B2-B6 من كل الألواح في "تعيين لوحة كاملة" مع siRNA تجمع سلبية بعد جميع مجموعات اللوحة العلوية والسفلية وقد تم transfected مع siRNA مكتبة.
   6. كما ترانسفيكت الآبار B2-B6 آخر لوحات اثنين، والتي لا تتلقى مكتبة siRNA وستكون بمثابة الضوابط غير مصورة (واحد لمجموعة اللوحة العلوية) وواحدة لمجموعة اللوحة السفلي، مع siRNA تجمع السلبية.
4. احتضان كل ألواح الخلية في حاضنة ثقافة خلية لمدة 4 ساعات بعد أن تم إضافة جميع تعداء يمزج ومزيج من لطيف التنصت على كل ساعة.
5. استخدام معالج سائل الآلي لغسل جميع الآبار اللوحات مرتين بحرارة قبل هكورت المتوسطة المخفف 1:5 في برنامج تلفزيوني. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
   1. نضح 100 ميليلتر من كل بئر وتجاهل ذلك إلى مستودع لنفايات.
   2. إضافة إلى كل جيدا 100 ميليلتر/بئر المعالجون مسبقاً هكورت المتوسطة المخفف 1:5 في برنامج تلفزيوني الذي يرد في خزان مختلفة في حجم كاف من عدد من اللوحات.
   3. كرر الخطوتين 3.5.1 و 3.5.2 لكل لوحة.
      1. إفراغ خزان النفايات حسب الحاجة.
      2. إعادة ملء الخزان بالمتوسطة هكورت المخفف 1:5 في برنامج تلفزيوني حسب الحاجة.
   4. نضح 100 ميليلتر من كل بئر وتجاهل أن خزان النفايات.
6. ريفيد الآبار جميع اللوحات مع 100 ميليلتر/جيدا قبل حرارة هكورت المتوسطة، الذي يرد في خزان مختلفة في كمية كافية من المتوسطة لعدد اللوحات.
   1. إعادة ملء الخزان بالمتوسطة حسب الحاجة.
7. استخدام الآبار C2-C6 جميع لوحات كعناصر تحكم غير ترانسفيكتيد.
8. الاحتفاظ بابار B7-B11 و C11 C7 جميع لوحات غير ترانسفيكتيد لاستخدامها كعناصر تحكم المخدرات والمركبات للتعرض للسمية.

4-ريفيد الخلايا التالية يوم

1. استخدم معالج سائل الآلي ريفيد الآبار جميع اللوحات. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
   1. نضح 100 ميليلتر من كل بئر وتجاهل ذلك إلى مستودع لنفايات.
   2. ريفيد كل جيدا مع 100 ميليلتر/جيدا قبل حرارة هكورت المتوسطة التي ترد في خزان مختلفة ولديها كمية كافية من المتوسطة لعدد اللوحات تكون ريفيد.
   3. كرر الخطوتين 4.1.1 و 4.1.2 حسب الحاجة إلى ريفيد كل خلية الألواح.
      1. إفراغ خزان النفايات حسب الحاجة.
      2. إعادة ملء الخزان بالمتوسطة حسب الحاجة.

5-إضافة عنصر التحكم إيجابية

1. يومين بعد تعداء وساعتين قبل التعرض، وتعد حلاً ميكرومتر 62.5 من كاردامونين التحكم الإيجابي في المتوسط هكورت وتستخدم للتعرض للصحة، وإضافة إلى صف ب خزان صف 8 إضعاف.
   1. للتعرض لحزب المحافظين، إعداد واستخدام حل SKF 86002 25 ميكرومتر.
   2. إعداد وحدة تحكم إيجابية كافية لعدد اللوحات لفحصها.
2. تعد حلاً 0.625% من [دمس] في هكورت المتوسطة (التحكم بالسيارة) وإضافة إلى صف ج من الخزان نفسه.
   1. للتعرض لحزب المحافظين، إعداد واستخدام حل 0.5% من [دمس].
   2. تحضير وحدة التحكم المركبة كافية لعدد اللوحات لفحصها.
3. استخدام معالج السائل الآلي إضافة عناصر إيجابية والمركبات إلى الآبار B7-B11 و C11 C7 لكل لوح الخلية واستخدام 50 ميليلتر/s بيبيتينج بسرعة لجميع الخطوات. استخدام مربعات نصيحة قبل تكوين لمعالجة الآبار التي ستقوم بتلقي عناصر إيجابية والمركبات فقط.
   1. إزالة 10 ميليلتر من المتوسطة من الآبار B7-B11 و C11 C7 لكل لوح الخلية وتخلص منه في صفوف زاي وحاء في خزان صف 8 إضعاف.
   2. نقل 10 ميليلتر من عناصر إيجابية والمركبات إلى تلك الآبار ومزيج 3 مرات.
4. إرجاع هذه اللوحات خلية للحاضنة.
5. كرر الخطوات 5.3 إلى 5.4 حتى تلقي كل خلية الألواح الإيجابية وعناصر التحكم المركبة.

6-HF التعرض للخلايا المستزرعة

تنبيه: هيئة الأكالة وسمية.

1. أداء جميع عمليات التعرض للمواد الكيميائية في غطاء الأبخرة كيميائية ارتداء القفازات النتريل مزدوجة ومعطف مختبر وحماه الكم المتاح من البولي إيثيلين وسلامة النظارات.
   1. اكتساب الصحة كحل 48%.
   2. تضعف الصحة إلى 1% مع الماء عالي النقاوة وتخزينها في مختبرين مل 5 في 10 مل جدار سميك البولي إثيلين قنينات لتحسين السلامة.
   3. إزالة التلوث من نصائح ماصة والخزانات التي قد تتلامس مع الصحة وأي هيئة بقايا السائل مع غلوكونات الكالسيوم 2.5% قبل التخلص منها في تيار النفايات الخطرة.
2. لكل لوحة مكتبة siRNA قيد التحقيق، وتعد حلاً متوسطة هيئة 0.0036% بإضافة ميليلتر 288 1% الصحة إلى 80 مل من قبل حرارة متوسطة هكورت في زجاجة 150 مل.
   1. دوامة الزجاجة واحتضان هيئة مخفف في حاضنة 37 درجة مئوية في غطاء الأبخرة الكيميائية لمدة 10 دقائق.
3. مزيج حل هيئة متوسطة مرة أخرى بدوامات الزجاجة وإضافة حل هيئة متوسطة إلى خزان كاشف على طبق أكثر دفئا.
4. أداء التعرض مع فنيين اثنين يعملان بالترادف.
   1. الفني في ميليلتر aspirate الحق 100 من كل من الآبار الداخلية للوحة الخلية باستخدام بيبيتور قناة 12 وثم تمرير اللوحة للفني على اليسار.
   2. وقد فني على اليسار إضافة 100 ميليلتر كل جيدا لحل هيئة متوسطة.
   3. كرر الخطوتين 6.4.1 و 6.4.2 لكل ألواح الخلية التي عرضه لأنها سامة.
   4. كما كرر الخطوات 6.4.1 و 6.4.2 لوحات التحكم غير مصورة، استخدام الطازجة هكورت المتوسطة بدلاً من حل هيئة متوسطة.
5. وضع اللوحات في الحاضنة غطاء الأبخرة الكيميائية لمدة 20 دقيقة وثم إعادتها إلى حاضنة الثقافة الخلية.
6. كرر الخطوة إضافة مراقبة إيجابية (خطوات 5.1 إلى 5.5) كما سبق تبين متى تم كشفها كل الألواح وعاد إلى حاضنة الثقافة الخلية.

7-CP التعرض للخلايا المستزرعة

تنبيه: هو CP حادة السمية ومصدر إزعاج.

1. أداء جميع عمليات التعرض للمواد الكيميائية في غطاء الأبخرة كيميائية ارتداء القفازات النتريل مزدوجة ومعطف مختبر وحماه الكم المتاح من البولي إيثيلين وسلامة النظارات.
   1. الحصول على CP.
   2. تمييع CP إلى 5% في [دمس] وتخزينها في مختبرين 10 مل في 10 مل التﻷلؤ قنينات لتحسين السلامة.
   3. إزالة التلوث من نصائح ماصة والخزانات التي قد تتلامس مع حزب المحافظين وحزب المحافظين السائلة أي بقايا مع بيكبريتيت الصوديوم 2.5% قبل التخلص منها في تيار النفايات الخطرة.
2. إعداد كمية كافية من قبل حرارة متوسطة هكورت الذي يحتوي على 1 × القلم/بكتيريا وبرنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً لعدد لوحات معرضة.
3. لكل مجموعة تعيين لوحة أعلى أو أسفل لوحة، إضافة ميليلتر 8.04% 5 CP في [دمس] قاسمة 50 مل من قبل حرارة متوسطة هكورت ومزيج جيد لتركيز CP نهائي 0.0008%. كاب الأنبوب محكم واحتضان الحل في حاضنة 37 درجة مئوية في غطاء الأبخرة الكيميائية ح 1.
   1. وقت إضافة حزب المحافظين إلى مختبرين 50 مل من المتوسط حيث أن يتعرض كل "تعيين لوحة أعلى" و "أسفل لوحة مجموعة" يتلقى ح أنها سامة بالضبط 1 بعد CP أضيفت إلى قاسمة 50 مل من المتوسطة.
4. إزالة "تعيين أعلى لوحة" ولوحة التحكم غير مصورة 1 من حاضنة الثقافة الخلية ووضعها في غطاء الأبخرة الكيميائية قرب نهاية فترة الحضانة.
5. مزيج الحل CP بعكس الأنبوب وصب ثم إلى خزان كاشف في نهاية فترة الحضانة ح 1.
6. أداء التعرض مع فنيين اثنين يعملان بالترادف.
   1. الفني في ميليلتر aspirate الحق 100 من كل من الآبار الداخلية للوحة الخلية باستخدام بيبيتور قناة 12 وثم تمرير اللوحة للفني على اليسار.
   2. وقد فني على اليسار إضافة 100 ميليلتر كل من الحل المتوسط CP جيدا.
   3. كرر الخطوتين 7.6.1 و 7.6.2 لكل ألواح الخلية "تعيين لوحة أعلى" للتعرض لأنها سامة.
   4. كما كرر الخطوات 7.6.1 و 7.6.2 لوحات التحكم غير مصورة، استخدام الطازجة هكورت المتوسطة بدلاً من الحل المتوسط CP.
7. وضع اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية في غطاء الأبخرة الكيميائية لمدة 10 دقائق.
8. أضف كمية كافية من المتوسطة برنامج تلفزيوني وهكورت الذي يحتوي على 1 × القلم/بكتيريا للخزانات كاشف قرب نهاية فترة الحضانة 10 دقيقة.
9. إزالة الحل CP من ألواح الخلية باستخدام بيبيتور 12 قناة واستبدله 100 ميليلتر كل من برنامج تلفزيوني جيدا في نهاية فترة الحضانة 10 دقيقة.
10. إزالة برنامج تلفزيوني من ألواح الخلية فورا واستبدالها ب 100 ميليلتر كل بئر المتوسطة هكورت الذي يحتوي على 1 × القلم/بكتيريا.
11. كما كرر الخطوتين 7.9 و 7.10 لوحات التحكم غير مصورة.
12. العودة لوحات الخلية إلى حاضنة ثقافة خلية قياسية.
13. كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.12 "تعيين لوحة أسفل".
14. كرر الخطوة إضافة مراقبة إيجابية (خطوات 5.1 إلى 5.5) كما تم وصفه سابقا عندما تم كشف كل الألواح وعاد إلى حاضنة الثقافة الخلية.

8-عينة من جمع وتحليل جدوى خلية

1. أربع وعشرين ساعة بعد التعرض، وتعد حلاً الركازة MTT 0.5 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني يتضمن 10 غرام/لتر جلوكوز والحارة إلى 37 درجة مئوية²¹. إعداد 10 مل الركيزة لكل لوحة تكون جزيئي.
2. لعدد اللوحات تكون جزيئي، إضافة كمية كافية من MTT الركازة الحل إلى خزان في معالج سائل الآلي.
3. استخدام معالج السائل الآلي جمع العينات وإضافة الركازة MTT استخدام 50 ميليلتر/s بيبيتينج بسرعة لجميع الخطوات. تكوين مربعات نصيحة لمعالجة فقط تلك الآبار تكون جزيئي.
   1. أسبيراتي 95 ميليلتر من المتوسطة من الآبار الداخلية 60 لوحة الخلية، وإيداع 42.5 ميليلتر في كل من ألواح التخزين 384-جيدا اثنين.
   2. فورا إضافة 100 ميليلتر كل من الحل الركيزة MTT جيدا إلى لوحات الخلية، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة ل 1.5 ح.
   3. إعادة ملء الخزان بمحلول الركازة MTT حسب الحاجة.
4. احتضان لوحات الخلية عند 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة ح 1.
5. ختم ألواح التخزين 384-جيدا وتخزينها في-80 درجة مئوية للتحليل اللاحق.
6. كرر الخطوات من 8.3 إلى 8.5 لكافة مجموعات اللوحة العلوية والسفلية والضوابط غير مصورة المرتبطة بها.
   1. إعادة استخدام تلميحات بين replicates إذا رغبت، ولكن غسلها عند إضافة الحل الركيزة MTT وعند التبديل بين لوحة مجموعات.
7. بعد الاحتضان ح 1، إضافة كمية كافية من [دمس] إلى خزان في معالج سائل الآلي.
8. استخدام معالج السائل الآلي إضافة [دمس]، واستخدام بيبيتينج ميليلتر/s 50 سرعة لجميع الخطوات.
   1. نضح 100 ميليلتر من كل من الآبار الداخلية من ألواح الخلية وتجاهل الحل الركيزة MTT في مستودع لنفايات.
      1. إفراغ خزان النفايات حسب الحاجة.
   2. تراكب كل بئر مع 100 ميليلتر [دمس].
      1. إعادة ملء الخزان [دمس] حسب الحاجة.
9. اهتز اللوحات على شاكر طبق لمدة 3 دقائق.
10. قياس امتصاص في 570 و 690 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي لوحة.
11. طرح الخلفية وحساب % بقاء الخلية بقسمة قيم امتصاص تتعرض الضوابط غير مصورة. استخدام عنصر تحكم siRNA متوسط تجمع السلبية لم يتعرضوا لحساب % خلية السلامة لكافة الأهداف.

9-قياس إيل-8 التركيز في Supernatants ثقافة الخلية

1. قياس تركيز إيل-8 في supernatants ثقافة الخلية باستخدام لا تغسل مقايسة على أساس حبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة²². إنشاء تخطيط لوحة بمقايسة لاستيعاب العينات والمنحنى المعياري.
2. إزالة ألواح التخزين 384-جيدا من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة، وإيجاز الطرد المركزي لوحات لجمع العينة في الجزء السفلي من الآبار.
3. لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها، جعل حجم كاف من يقبلون المضادة-إيل-8 حبات والأجسام المضادة-إيل-8 بيوتينيلاتيد في مقايسة العازلة في الطقم. استخدام نسبة 50 ميليلتر لمكافحة IL8 يقبلون الخرز و 50 ميليلتر من جسم IL8 مكافحة بيوتينيلاتيد لمل 9.9 من المخزن المؤقت للمقايسة.
   1. استخدام بيبيتور متعددة القنوات، إضافة الخليط حبة/جسم لوح أسود 384-جيدا تخزين.
      1. إضافة يقبلون حبة/جسم للآبار المخصصة للاستخدام للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
      2. إضافة وحدة تخزين كافية الواحدة وكذلك لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
4. إعادة تشكيل إيل-8 المعيار 1000 بيكوغرام/مل تستخدم المتوسطة ثقافة الخلية التي تحتوي على 354 ميكرومتر كلوريد الصوديوم. جعل حجم كاف لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
5. جعل ثمانية تخفيف التسلسلية ذات شقين للمنحنى المعياري.
6. إضافة المنحنى المعياري في ثلاث نسخ إلى آبار لوحة سوداء 384-جيدا تخزين وفقا لتخطيط لوحة الفحص المناسبة. إضافة وحدة تخزين كافية الواحدة وكذلك لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
   1. وبالمثل، أضف المتوسطة ثقافة الخلية التي تحتوي على 354 ميكرومتر كلوريد الصوديوم مع لا إيل-8 لقياس الخلفية.
7. استخدام معالج سائل الآلي للقيام التحليل. استخدام مربعات نصيحة قبل تكوين لمعالجة الآبار تسميهم تخطيط لوحة الفحص فقط. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
   1. نقل 8 ميليلتر من خليط جسم حبة يقبلون إلى آبار لوحات الفحص جيدا 384-بئر ضحلة بيضاء.
      1. إضافة إلى الآبار المعينة للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط لوحة الفحص فقط.
   2. نقل 2 ميليلتر من المنحنى المعياري لآبار لوحات الضحلة المقايسة جيدا وفقا لتخطيط لوحة الفحص المناسبة.
   3. إعداد حل م 3.54 كلوريد الصوديوم وإضافة وحدة تخزين كافية لعدد اللوحات تكون جزيئي لخزان ضحلة في معالج السائل الآلي.
   4. ضبط تركيز الملح من العينات ليتطابق مع منحنى قياسي بنقل 4.5 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم إلى النماذج في لوحات سوداء 384-جيدا تخزين.
   5. خلط العينات باستخدام ثلاث مرات حجم خلط 30 ميليلتر، ونقل 2 ميليلتر من العينات إلى الأبيض الضحلة الاعتداء أيضا لوحات وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
      1. تغيير نصائح ما بين لوحات عينة.
   6. احتضانها ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
   7. لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها، جعل حجم كاف من حبات يقبلون في المخزن المؤقت للمقايسة. استخدام نسبة 200 ميليلتر من حبات يقبلون الثانوية لمل 12.3 من المخزن المؤقت للمقايسة.
   8. استخدام بيبيتور متعددة القنوات، إضافة الخرز الثانوية إلى لوحة سوداء 384-جيدا تخزين.
      1. إضافة الخرز الثانوية للآبار المخصصة للاستخدام للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
      2. إضافة وحدة تخزين كافية الواحدة وكذلك لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
   9. باستخدام معالج السائل الآلي، نقل 10 ميليلتر من الخرز الثانوية لآبار لوحات بيضاء المقايسة جيدا 384-بئر ضحلة.
      1. إضافة إلى الآبار التي تلقي عينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط لوحة الفحص فقط وتغسل النصائح بين كل لوحة.
   10. احتضان لمدة ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
8. ختم المقايسة لوحات مع مسح لوحة الأختام والمسح الضوئي باستخدام قارئ لوحة متوافقة مع المقايسة. استخدم مسافة 0.2 مم بين لوحة وكاشف ووقت الإثارة 180 مرض التصلب العصبي المتعدد 550 ms قياس الوقت للمسح الضوئي.
9. استيراد البيانات الخام من فحوصات إيل-8 في جدول بيانات.
10. استخدام منحنى الآلي المناسب للمنحنى المعياري لفحوصات إيل-8، ومن ثم تحويل البيانات الخام إلى بيكوغرام/مل لكل عينة.

النتائج

تطوير أسلوب التعرض

المكررة، وتقييم مدى ملاءمة خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 لاستخدامها في الدراسات HTS. تم تخليد استخدام مستضد تي كبيرة SV-40 هسيك SV40 وكانت هدية من دهاناجاي بال²³. لذلك، فقط بعض عينات من الن...

Discussion

هنا يصف لنا لدينا الأساليب والنتائج في تطوير إنتاجية عالية القرنية الظهارية خلية فحص نموذج لدراسة الإصابات التردد وحزب المحافظين. ونقدم أيضا النتائج من الشاشة siRNA الأولية لإصابة التردد. وهناك العديد من التحديات لتطوير نماذج HTS لدراسة إصابات التشنج. الأساليب التي يمكن أن نجد في الأدبيات ذ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting