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Resumen

Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.

Resumen

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos son generalmente apoyo como no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. En los esfuerzos para el desarrollo de tratamientos y terapias para cuidar de la exposición, puede ser importante comprender los mecanismos moleculares y celulares de estas lesiones. Proponemos que utilización de la detección de RNA (siRNA) inhibitorio pequeño alto rendimiento puede ser una importante herramienta que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. siRNA son doble trenzadas moléculas de ARN que son 19-25 nucleotides largos y utilizan el vía para degradar el mRNA de silenciamiento del gen postranscripcional que tienen homología con el siRNA. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. El desarrollo y validación de modelos de exposición en vitro y métodos para el alto rendimiento (HTS) de detección de fluoruro de hidrógeno (HF) y cloropicrina-(CP) inducida por lesión ocular se presentan en este artículo. Aunque hemos seleccionado estas dos sustancias tóxicas, nuestros métodos son aplicables al estudio de otras sustancias tóxicas, con pequeñas modificaciones en el protocolo de la exposición de sustancias tóxicas. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y la producción de IL-8 fueron seleccionados como puntos finales en el protocolo de investigación. Varios problemas asociaron con el desarrollo de la exposición de sustancias tóxicas y se presentan métodos de cultivo celular adecuados para estudios HTS. El establecimiento de modelos HTS para estas sustancias tóxicas permite estudios adicionales entender mejor el mecanismo de lesión y pantalla para terapéutica potencial para lesión ocular química.

Introducción

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Desafortunadamente, tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos sólo son generalmente apoyo no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. La estrategia actual de tratamiento es inespecífica e incluye principalmente los tratamientos terapéuticos tópicos tales como lubricantes, antibióticos, y ciclopléjicos seguida de antiinflamatorios (por ejemplo, esteroides) una vez la córnea ha re-epithelialized1 ,2. A pesar del mejor tratamiento terapéutico opciones actuales disponibles, pronóstico a largo plazo es generalmente pobre debido a la opacificación corneal progresiva y neovascularización2,3.

Modelos animales se han utilizado tradicionalmente para investigar la toxicidad química y entender los mecanismos de lesión. Sin embargo, los estudios en animales son lentos y caros. También hay esfuerzos para reducir los ensayos con animales. Por ejemplo, la legislación REACH (CE 1907/2006) en la Unión Europea tiene disposiciones destinadas a reducir los ensayos con animales. Las disposiciones incluyen un requisito que las empresas comparten datos con el fin de evitar pruebas animales y obtener la aprobación de la Agencia Europea de sustancias químicas antes de realizar pruebas propuestas en animales. Bajo las disposiciones de REACH, la experimentación con animales deben ser un último recurso. También es el Reglamento Europeo de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminando la prueba de cosméticos en animales. Cuando se llevan a cabo estudios en animales, son guiados por los principios de las 3Rs (refinamiento, reducción y sustitución), que proporcionan un marco para la investigación animal más humano, reduciendo el número de animales utilizados y uso de alternativas sin animales siempre que sea posible. Por estas razones, el campo de la toxicología ha intentado adoptar en vitro ensayos que permiten comprender mejor los mecanismos moleculares de toxicidad y pueden hacerse en el más alto rendimiento4. Se trata de un enfoque funcional Toxicología donde sustancias tóxicas se definen por su función y no únicamente por su química. Dado un paso más, funcional toxicogenómica busca entender el rol que juegan de genes específicos en los efectos de sustancias tóxicas5. Con la aplicación de la tecnología de siRNA, pantallas para investigar funciones de los genes en las respuestas moleculares y celulares a sustancias tóxicas pueden realizarse en el alto rendimiento. siRNA son doble trenzado RNA moléculas de 19-25 nucleotides largos que, aprovechando el post transcripcional gen silenciamiento vía presente en todas las células mamíferas6. Sintéticamente estos están fabricados y diseñados para un gen específico de destino. Cuando se introduce en una célula, el siRNA se procesa y se carga una sola hebra, la hebra guía, en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). El siRNA dirige el RISC a una región complementaria de una molécula de mRNA, y el RISC degrada el ARNm. Esto resulta en la reducción de la expresión del gen específico. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. Este enfoque se ha utilizado para entender más los mecanismos de la susceptibilidad de la ricina y la inducción de AHR-dependiente de CYP1A17,8.

La lista de evaluación de riesgo de terrorismo químico (CTRA) y la lista de productos químicos industriales tóxicos (TIC) ha detallada seleccionadas productos químicos por su toxicidad y potencial para ser lanzado durante un terrorista, guerra o accidente de trabajo evento9. Estamos solicitando un siRNA alto rendimiento proyección enfoque de toxicogenomic (HTS) para el estudio de sustancias tóxicas de Ctra lista, que han sido identificados en riesgo alto de uso en un incidente terrorista. La toxicología tradicional intenta comprender los efectos adversos que tienen sustancias químicas sobre organismos vivos; sin embargo, tenemos un deseo de comprender los mecanismos de la lesión con el fin de informar el desarrollo de terapias y enfoques terapéuticos y posiblemente, para descubrir las moléculas que pueden ser objeto de desarrollo terapéutico. Este esfuerzo de alguna manera puede considerarse análoga a la utilización de proyección de alto rendimiento siRNA y análisis celular basado en el descubrimiento de drogas proceso10. Una diferencia importante es que el descubrimiento de medicamentos normalmente busca un destino singular para descubrimiento terapéutico Considerando que nuestro enfoque es un poco improbable que exista un objetivo singular de alto valor terapéutico para el tratamiento de la exposición de sustancias tóxicas. Esperamos que cualquier paradigma de tratamiento eficaz para la exposición de sustancias tóxicas requeriría un enfoque multifacético para alcanzar alto valor terapéutico, y datos de toxicogenomic vital pueden informar a un paradigma de tratamiento eficaz.

Automatización de mesa aporta metodología de alto rendimiento a laboratorios fuera de la industria farmacéutica o biotecnológica. Los estudios en vitro en nuestro Instituto han sido históricamente los análisis tradicionales que son de bajo rendimiento11,12,13. En los últimos años, nuestro laboratorio ha transición al uso de la robótica de sobremesa para realizar proyección de siRNA de alto rendimiento. Adjunto, presentamos el refinamiento de modelos celulares ocular y el desarrollo de in vitro métodos de exposición para el fluoruro de hidrógeno (HF) y la cloropicrina (CP) adecuado para el cribado de alto rendimiento siRNA. Nuestro objetivo es identificar moléculas que regulan el daño celular en respuesta a estas sustancias tóxicas. Los objetivos de la biblioteca de siRNA que se seleccionaron son receptores acoplados a proteína G, proteína quinasas, proteasas, fosfatasas, canales iónicos y otros objetivos potencialmente druggable. HF y CP fueron seleccionados para estudio por agentes de lista CTRA ToxNet informes de accidentes de trabajo de referencias cruzadas para encontrar a los que presentan el mayor riesgo de lesión ocular por medio de vapor exposición9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) fue utilizado originalmente como un gas lacrimógeno en WWI15. Actualmente se utiliza como un fumigante agrícola y funciones como un nematicida, fungicida e insecticida16. Fluoruro de hidrógeno (HF) se utiliza en procesos incluyendo la alquilación en refinerías de petróleo y la fluoración electroquímica de compuestos orgánicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) es un gas pero en su forma acuosa es el ácido fluorhídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Por lo tanto, elegimos utilizar HFA en nuestra celda en modelos de exposición. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y el marcador inflamatorio IL-8 fueron seleccionados como puntos finales porque los objetivos que están implicados en la lesión celular deben reflejarse en la muerte celular y la respuesta inflamatoria. En concreto, si un objetivo debían jugar un papel protector en la exposición de sustancias tóxicas, muerte celular o a la producción de citoquinas inflamatorias debería aumentar cuando se inhibe la expresión de destino por siRNA. Lo contrario sería cierto para blancos que juegan un papel negativo. Asimismo, la inflamación crónica aparece desempeñar un papel en la patología de la córnea después de la exposición y la intervención en las vías de muerte celular pueden mejorar el resultado clínico2,18.

Protocolo

1. célula cultura mantenimiento

  1. Crecer la línea celular SV40 HCEC a 37 ° C, 5% CO2y 90% de humedad en DMEM F-12 con 15% de suero bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, μg/L 10 factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la insulina de 5 mg/L.
  2. Paso de la línea celular cada 3 a 4 días (dependiendo de la densidad de siembra) para asegurar que confluencia nunca supera el 80% durante el mantenimiento de la cultura.
  3. Separar las células de matraces con un desprendimiento (solución 14 mL por cada frasco de 150 cm2 ) e incubación a 37 ° C durante no más de 8 minutos.
  4. Neutralizar la solución de separación con un volumen igual de medio de cultivo celular y de la pelotilla de las células en tubos cónicos de 50 mL por centrifugación durante 7 min a 160 g x.
  5. Resuspenda el precipitado de células en el medio (20 mL en cada frasco de 150 cm2 ).
  6. Contar las células con un contador celular automatizado de mano y semilla en frascos nuevos a una densidad que les permitirá crecer de 3 a 4 días sin superar el 80% de confluencia.

2. placa células para la experimentación

  1. Ver frascos de SV40-HCECs por microscopia ligera de contraste de fase para asegurar esa confluencia es menor al 80% y para evaluar la salud general de la célula.
  2. Separar, pellets, resuspender y contar SV40-HCECs de matraces como se describe en los pasos 1.3 a 1.6 de mantenimiento de la cultura de célula. Utilice medio de HCEC SV40 que contienen hidrocortisona 0.5 μg/mL (medio HCORT) para resuspender las células.
  3. En una botella desechable mediana, preparar una suspensión de SV40-HCECs 17.857 células/ml en medio HCORT precalentado.
    1. Preparar un volumen de suspensión celular suficiente para el número de placas para ser sembradas.
    2. Un mínimo de placas de 14 x 96 pocillos con células para cada placa de la biblioteca de siRNA a estudiar de la semilla.
  4. Agitar la botella para suspender las células uniformemente, verter un volumen suficiente de la suspensión de células en un embalse en el nido de Agitador orbital de un controlador automático de líquido y almacenar la botella que contiene la suspensión de células en a 37 ° C placa de calentamiento durante el recubrimiento de la célula proceso.
  5. Utilizar el controlador líquido automatizado para añadir las células a las placas de una densidad de 1000 células por pocillo (5000 células/cm2) en 70 μl de medio por pozo de una placa de 96 pocillos. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. Ejecute el agitador orbital a 100 rpm constantemente durante el proceso de transferencia.
    2. Mezclar la suspensión tres veces (140 μl mix volumen) utilizando el controlador líquido automatizado.
    3. 140 μl de la suspensión de células de aspirar y dispensar 70 μl en cada pocillo de dos placas de cultivo celular.
    4. Repita los pasos 2.5.3 y 2.5.4 hasta que todas las placas han sido sembradas con las células.
    5. Rellene el depósito de la suspensión de células según sea necesario durante el proceso de transferencia.
  6. Después de que las placas han sido sembradas, eliminarlos desde el controlador de líquido automatizado e Incubar 30 min a temperatura ambiente antes de transferirlas a una incubadora de cultivo celular.
  7. Evaluar la densidad celular de cada pocillo por cada placa a la mañana siguiente con un sistema automatizado de proyección de imagen que se encuentra en una incubadora de cultivo celular y excluir cualquier placa de estudio que tienen pozos interiores que no están entre 15% y 22% confluente.

3. transfectar las células con siRNA

  1. Adquirir placas de siRNA biblioteca del vendedor previamente configurado para contener 80 objetivos de siRNA por placa (véase figura 4), con las columnas 1 y 12 a la izquierda vacía.
  2. Reconstituir la placa de la biblioteca de siRNA con tampón de siRNA a una concentración final de 2 pmol/μl de cada pocillo de siRNA según las instrucciones19 el fabricante.
  3. Transfectar las células 24 h después de la siembra con 4 pmol/pozo de siRNA y 0,3 μL/pocillo de reactivo de transfección. Realizar todos los pasos según protocolo del fabricante de reactivo de transfección (ver figura 4 para el diseño de la placa)20.
    1. Realizar todas las transfecciones con un controlador automático de líquido y utilizar un 25 μl/s de velocidad de pipeteado para todos los pasos. Usar cajas de punta preconfigurado para atender sólo los pozos que serán transfectados.
    2. Utilice la parte superior de la mitad de la placa de la biblioteca para transfectar un conjunto de seis platos repetidos que se refiere como el "conjunto de placa de arriba" (seis repeticiones por siRNA, n = 6).
    3. Utilizar la parte inferior de la mitad de la placa de la biblioteca para transfectar un conjunto diferente de seis platos repetidos que se refiere como el "conjunto de placa de fondo" (seis repeticiones por siRNA, n = 6).
    4. Utilizar el término "Sistema completo de la placa" para describir las 12 placas de células que han sido transfectadas con siRNA library.
    5. Transfectar pozos B2-B6 de todas las placas en el sistema completo de placa con siRNA piscina negativo después de que todos los juegos de la placa superior e inferior han sido transfectados con siRNA library.
    6. También transfectar pozos B2-B6 de otro dos placas, que no recibe biblioteca siRNA y servirán como controles no expuestos (uno para el conjunto de placa superior) y otro para el conjunto de placa de fondo, con piscina negativo siRNA.
  4. Incubar todas las placas de células en una incubadora de cultivo celular de 4 horas después de que se han añadido todos los mixes de transfección y mezcla por suave aprovechando cada hora.
  5. Uso un controlador líquido automatizado para lavar todos los pocillos de las placas dos veces con precalentado medio HCORT diluido 1:5 en PBS. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. 100 μl de cada pocillo de aspirar y descartar en un depósito de residuos.
    2. Añadir a cada pozo 100 μl/pozo con medio HCORT diluido 1:5 PBS en que está contenido en un depósito diferente en un volumen suficiente para el número de placas.
    3. Repita los pasos 3.5.1 y 3.5.2 para cada placa.
      1. Vaciar el depósito de residuos según sea necesario.
      2. Rellenar el depósito con medio HCORT había diluido 1:5 en PBS según sea necesario.
    4. 100 μl de cada pocillo de aspirar y descartar en el depósito de residuos.
  6. Realimentación a todos los pocillos de las placas con 100 μL/pocillo con HCORT medio, que está contenido en un depósito diferente en un volumen suficiente de medio para el número de placas.
    1. Llene el tanque con medio según sea necesario.
  7. Utilizar pocillos C2-C6 de todas las placas como controles no transfectadas.
  8. Mantener pozos B7-B11 y C7-C11 de todas las placas no transfectadas para ser utilizado como controles de drogas y vehículo para la exposición de sustancias tóxicas.

4. realimentación de las células el siguiente día

  1. Utilice un controlador líquido automatizado para realimentación todos los pocillos de las placas. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. 100 μl de cada pocillo de aspirar y descartar en un depósito de residuos.
    2. Alimentar cada pozo con 100 μL/pocillo con HCORT de medio que está contenida en un depósito diferente y tiene un volumen suficiente de medio para el número de placas a ser refed.
    3. Repita los pasos del 4.1.1 y 4.1.2 según sea necesario para la realimentación de todas las placas de la celda.
      1. Vaciar el depósito de residuos según sea necesario.
      2. Llene el tanque con medio según sea necesario.

5. Control positivo además

  1. Dos días después de transfección y dos horas antes de la exposición, preparar una solución de μm 62.5 de la cardamonin de control positivo en medio HCORT se utiliza para exposiciones HFA y añadir a la fila B de un reservorio de 8 hileras de dilución.
    1. Exposición a CP, preparar y utilizar una solución de 25 μm de SKF 86002.
    2. Preparar un volumen de control positivo suficiente para el número de platos a probar.
  2. Preparar una solución de 0.625% de DMSO en medio HCORT (control del vehículo) y añadir a la fila C del embalse mismo.
    1. Exposición a CP, preparar y utilizar una solución de 0,5% de DMSO.
    2. Preparar un volumen de control del vehículo suficiente para que el número de platos a probar.
  3. Uso el controlador automatizado de líquido agregar los controles positivo y vehículo a pozos B7-B11 y C7-C11 de cada placa de celular y utilizar un pipeteo de 50 μl/s de velocidad para todos los pasos. Usar cajas de punta preconfigurado para atender sólo los pozos que se reciben los controles positivo y vehículo.
    1. Saque 10 μl de medio de pozos, B7-B11 y C7-C11 de cada placa de la célula y deseche en filas G y H del tanque de dilución de 8 hileras.
    2. Transferir 10 μl de los controles positivo y vehículo a los pozos y mezcle 3 veces.
  4. Volver estas placas de la celda a la incubadora.
  5. Repita los pasos 5.3 a 5.4 hasta placas de células todos han recibido positivas y controles del vehículo.

6. HF la exposición de las células cultivadas

PRECAUCIÓN: HFA es corrosivo y muy tóxico.

  1. Realizar todas las operaciones de la exposición a sustancias químicas en una campana de vapores químicos, usando guantes de nitrilo doble, una capa del laboratorio, protectores de manga de polietileno desechable y gafas de seguridad.
    1. Adquirir HFA como una solución de 48%.
    2. Diluya el HFA al 1% con agua ultrapura y almacenar en alícuotas de 5 mL en 10 mL frascos de polietileno de pared gruesa para mejorar la seguridad.
    3. Descontaminar las puntas de pipeta y embalses que han entrado en contacto con HFA y cualquier restos líquido HFA con gluconato de calcio 2,5% antes de la eliminación en la corriente de residuos peligrosos.
  2. Por cada placa de la biblioteca del siRNA bajo investigación, preparar una solución de medio de HFA de 0.0036% añadiendo 288 μl de 1% HFA a 80 mL de medio HCORT precalentado en una botella de 150 mL.
    1. Agitar la botella e incubar la HFA diluido en una incubadora de 37 ° C en la campana de vapores químicos durante 10 minutos.
  3. Mezcle la solución de medio de HFA otra vez agitando la botella y añadir la solución de medio de HFA a un reservorio de reactivo sobre una placa caliente.
  4. Realizar la exposición con dos técnicos que trabajan en tándem.
    1. Que el técnico en la derecha aspirado 100 μl de cada uno de los pocillos del interior de una placa celular utilizando una pipeta 12 canales y luego pasar la plancha al técnico a la izquierda.
    2. Que el técnico la izquierda añadir 100 μl por pocillo de la solución de medio de HFA.
    3. Repita los pasos 6.4.1 y 6.4.2 para todas las placas de células que se van a estar expuestos a tóxicos.
    4. También repita 6.4.1 y 6.4.2 de las placas de control no expuestos, utilizando medio HCORT fresco en lugar de la solución de medio de HFA.
  5. Coloque las placas en la incubadora de la campana de vapores químicos durante 20 min y luego devolverlos a la incubadora de la cultura de célula.
  6. Repita el paso de adición de control positivo (pasos 5.1 a 5.5) como se ha demostrado una vez que todas las placas han sido expuestas y volvió a la incubadora de la cultura de célula.

7. CP exposición de las células cultivadas

PRECAUCIÓN: CP es agudo tóxico e irritante.

  1. Realizar todas las operaciones de la exposición a sustancias químicas en una campana de vapores químicos, usando guantes de nitrilo doble, una capa del laboratorio, protectores de manga de polietileno desechable y gafas de seguridad.
    1. Adquirir el CP.
    2. CP de diluir al 5% en DMSO y almacenar en alícuotas de 10 mL en 10 mL viales de centelleo para mejorar la seguridad.
    3. Descontaminar las puntas de pipeta y embalses que han entrado en contacto con CP y cualquier sobrante CP líquido con bisulfito de sodio 2,5% antes de la eliminación en la corriente de residuos peligrosos.
  2. Preparar un volumen suficiente de precalentado medio HCORT que contiene 1 x pluma/Strep y PBS precalentada para el número de placas para ser expuesto.
  3. Para cada conjunto de Tapa placa de sistema o placa base, añadir μl 8.04 5% CP en DMSO a una alícuota de 50 mL de precalentado medio HCORT y mezclar bien para una concentración final del CP de 0.0008%. Cerrar herméticamente el tubo e incubar la solución en una incubadora de 37 ° C en la campana de vapores químicos de 1 h.
    1. Tiempo la incorporación de CP a las alícuotas de 50 mL de medio para que cada uno había expuesto arriba placa Set y Set de placa inferior recibe toxicante exactamente 1 h después de CP fue agregado a la alícuota de 50 mL de medio.
  4. Sacar un Top Set de placa y placa de 1 control no expuesta de la incubadora de cultivo celular y en la campana de humos químicos cerca del final de la incubación.
  5. Mezcle la solución CP por inversión del tubo y luego decantar a un reservorio de reactivo al final del período de incubación de 1 h.
  6. Realizar la exposición con dos técnicos que trabajan en tándem.
    1. Que el técnico en la derecha aspirado 100 μl de cada uno de los pocillos del interior de una placa celular utilizando una pipeta 12 canales y luego pasar la plancha al técnico a la izquierda.
    2. Que el técnico la izquierda añadir 100 μl por pocillo de la solución de medio de CP.
    3. Repita los pasos 7.6.1 y 7.6.2 para todas las placas de la celda del Top placa Set expuestos a tóxicos.
    4. También repita 7.6.1 y 7.6.2 para las placas de control no expuestos, utilizando medio HCORT fresco en lugar de la solución de medio de CP.
  7. Coloque las placas en una incubadora de 37 ° C en la campana de vapores químicos durante 10 minutos.
  8. Añadir un volumen suficiente de medio PBS y HCORT que contiene 1 x pluma/Strep a embalses de reactivo cerca del final de la incubación de 10 minutos.
  9. Retire la solución CP de placas de células utilizando una pipeta 12 canales y reemplazarlo con 100 μl por pocillo de PBS al final de la incubación de 10 minutos.
  10. Quitar inmediatamente el PBS del placas de células y reemplazarlo con 100 μl por pocillo de medio HCORT que contiene 1 x pluma/Strep.
  11. También repita 7.9 y 7.10 para las placas de control no expuestos.
  12. Devolver las placas de la celda a una incubadora de cultivo de célula estándar.
  13. Repita los pasos 7.3 a 7.12 para el conjunto de placa de fondo.
  14. Repita el paso de adición de control positivo (pasos 5.1 a 5.5) como se describió anteriormente una vez que todas las placas han sido expuestas y volvió a la incubadora de la cultura de célula.

8. recolección y análisis de viabilidad de la célula de la muestra

  1. Veinticuatro horas después de la exposición, preparar una solución de sustrato MTT de 0.5 mg/mL en PBS con 10 g/L glucosa y caliente a 37 ° C21. Preparar 10 mL de sustrato de cada placa a ensayarse.
  2. Para el número de placas a ensayar, agregar un volumen suficiente de solución de MTT a un depósito en un controlador de líquido automatizado.
  3. Uso el controlador líquido automatizado para recoger la muestra y añadir substrato MTT usando un pipeteo de 50 μl/s de velocidad para todos los pasos. Preconfigurar cajas de punta para atender sólo los pozos a ensayarse.
    1. Medio de aspirado 95 μl of desde el internos 60 pozos de la placa de la célula y depósito 42.5 μL en cada uno de dos placas de 384 pozos de almacenamiento.
    2. Añadir 100 μl por pocillo de la solución substrato con MTT a las placas de la celda e incubar a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular de 1,5 h.
    3. Llene el tanque con solución de MTT según sea necesario.
  4. Incubar las placas de células a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular durante 1 hora.
  5. Sellar las placas de almacenamiento de 384 pozos y almacenarlas a-80 ° C para posterior análisis.
  6. Repita los pasos 8.3 a 8.5 para los sistemas de placa superior e inferior y los controles no expuestos asociados.
    1. Reutilizar consejos entre repeticiones si lo desea, pero lavarlos al agregar solución de MTT y cuándo cambiar de placa fija.
  7. Después de la 1 h de incubación, añadir un volumen suficiente de DMSO a un depósito en un controlador de líquido automatizado.
  8. Uso el controlador automatizado de líquido agregar DMSO y utilizar un pipeteo de 50 μl/s de velocidad para todos los pasos.
    1. Aspire 100 μl de cada uno de los pozos internos de las placas de la celda y eliminar la solución de sustrato MTT en un depósito de residuos.
      1. Vaciar el depósito de residuos según sea necesario.
    2. Superposición de cada pozo con 100 μl DMSO.
      1. Rellene el depósito de DMSO según sea necesario.
  9. Agitar las placas en un agitador de placa durante 3 minutos.
  10. Medir la absorbancia a 570 y 690 nm usando un espectrofotómetro de placa.
  11. Reste el fondo y calcular el % de viabilidad de la célula dividiendo los valores de absorbancia expuestos entre los controles no expuestos. Utilice el control de siRNA media piscina negativo expuesto para calcular el % de viabilidad celular para todos los objetivos.

9. medida de IL-8 concentración en sobrenadantes de cultivo celular

  1. Medida de la concentración de IL-8 en los sobrenadantes de cultivo celular usando un no lave ensayo basado en grano según las instrucciones22 el fabricante. Crear un diseño de placa de ensayo para dar cabida a muestras y curva estándar.
  2. Retire las placas de almacenamiento de 384 pozos del congelador de-80 ° C, descongelar a temperatura ambiente y centrifugar brevemente las placas para recolectar la muestra en el fondo de los pozos.
  3. El número de las placas de ensayo a ejecutar, hacer un volumen suficiente de granos de aceptador de anti-IL-8 y la del anticuerpo biotinilado anti-IL-8 en tampon de ensayo incluido en el kit. Utilice el cociente de 50 μl de anti-IL8 granos de aceptador y 50 μl de anticuerpo biotinilado anti-IL8 9,9 mL de tampón de ensayo.
    1. Utilizando una pipeta multicanal, agregue la mezcla de grano anticuerpos a una placa de almacenamiento de 384-pozo negro.
      1. Añadir aceptador grano/anticuerpo en los pocillos destinados al uso para las muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
      2. Añadir un volumen suficiente por bien para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
  4. Reconstituir el estándar de la IL-8 a 1000 pg/mL con medio de cultivo celular que contiene 354 μm NaCl. Hacer un volumen suficiente para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
  5. Hacer el ocho doble diluciones seriadas de la curva estándar.
  6. Añadir la curva estándar por triplicado a los pocillos adecuados de una placa de almacenamiento de 384-pozo negro según el diseño de la placa de ensayo. Añadir un volumen suficiente por bien para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
    1. Del mismo modo, agregar medio de cultivo celular que contiene 354 μm NaCl con no IL-8 para la medida de fondo.
  7. Utilizar un controlador de líquido automatizado para realizar el ensayo. Usar cajas de punta preconfigurado para atender sólo los pozos designados por el diseño de la placa de ensayo. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. Transferencia de 8 μl de la mezcla de grano-anticuerpo aceptador en los pocillos de las placas de 384 pozos poco profundos análisis bien blanco.
      1. Añadir sólo a los pocillos para muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
    2. Transferencia de 2 μl de la curva estándar a los pocillos de las placas de ensayo de pozo poco profundas según el diseño de la placa de ensayo adecuados.
    3. Preparar una solución de NaCl de 3,54 M y añadir un volumen suficiente para el número de placas a ensayar a un depósito poco profundo en el controlador de líquido automatizado.
    4. Ajustar la concentración de sal de las muestras para que coincida con la de la curva estándar transfiriendo 4.5 μl de la solución de NaCl a las muestras en las placas de almacenamiento de 384-pozo negro.
    5. Mezclar las muestras tres veces con un volumen de 30 μl de mezcla y transferencia 2 μl de las muestras al blanco superficial análisis bien las placas de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
      1. Cambio de puntas entre las placas de la muestra.
    6. Incubar durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
    7. El número de las placas de ensayo a ejecutar, hacer un volumen suficiente de granos aceptador en tampon de ensayo. Utilice la proporción de 200 μL de granos aceptor secundario a 12,3 mL de tampón de ensayo.
    8. Utilizando una pipeta multicanal, añadir granos secundarios a una placa de almacenamiento de 384-pozo negro.
      1. Añadir cuentas secundarias en los pocillos destinados al uso para las muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
      2. Añadir un volumen suficiente por bien para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
    9. Utilizando el controlador líquido automatizado, transferir 10 μl de las cuentas secundarias en los pocillos de las placas de ensayo bien 384-pozo superficial blanco.
      1. Añadir sólo a los pozos que recibieron muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo y lavar las puntas entre cada placa.
    10. Incubar durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente.
  8. El ensayo de placas con claro sellos de placa y escanear con un lector compatible con el ensayo del sello. Utilizar distancia 0,2 mm entre la placa y detector, 180 ms tiempo de excitación y 550 ms tiempo de medición para el análisis.
  9. Importar los datos en bruto de los ensayos de IL-8 en una hoja de cálculo.
  10. Utilice curva automatizada para la curva estándar de los ensayos de IL-8 y luego convertir los datos en bruto a pg/mL para cada muestra.

Resultados

Desarrollo de métodos de exposición

Había refinado y evaluar la idoneidad de la línea de células epiteliales corneales humanas SV40 HCEC para su uso en estudios HTS. SV40-HCEC se inmortalizó con el antígeno T grande de SV-40 y fueron un regalo de Dhanajay Pal23. Había demasiadas variables exploradas en el desarrollo de la metodología de exposición para presentar concisamente aqu...

Discusión

Adjunto describimos nuestros métodos y resultados en el desarrollo de una célula epitelial de la córnea de alto rendimiento modelo para el estudio de lesiones en HF y CP de detección. También se presentan los resultados de la pantalla de siRNA primario para lesiones de HF. Hubo muchos desafíos para el desarrollo de modelos HTS para el estudio de las lesiones TIC. Métodos que podríamos encontrar en la literatura relacionada con el estudio de HF, HFA o CP en modelos de cultivo celular fueron de poca ayuda. Mayoría...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Descargo de responsabilidad: las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan la política oficial del Departamento del ejército, Departamento de la defensa o el gobierno de Estados Unidos. Esta investigación fue apoyada por un convenio interinstitucional entre NIH/NIAID y el USAMRICD y en parte por una cita para el programa de participación de investigación postgrado en los Estados Unidos Ejército médico investigación Instituto de defensa química administrada por el roble Instituto de Ridge para la ciencia y la educación a través de un acuerdo interagencial entre el Departamento de energía de Estados Unidos y USAMRMC.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el nacional institutos de salud contrarrestar Programa Interinstitucional Convenio # AOD13015-001. Nos gustaría agradecer a Stephanie Froberg y Peter Hurst por sus esfuerzos y conocimientos en producción de vídeo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Bravo liquid handing platformAgilent or equivalentG5409A
Bravo plate shakerAgilent or equivalentOption 159
Bravo 96LT disposable tip headAgilent or equivalentOption 17896-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip headAgilent or equivalentOption 17796-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip headAgilent or equivalentOption 179384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19133-212
EnSpire multimode plate readerPerkin Elmer or equivalent2300-0000AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit Perkin Elmer or equivalentAL224Fno-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplatesPerkin Elmer or equivalent6008359
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen or equivalent13778500Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum MediumInvitrogen or equivalent31985070
TrypLE ExpressGibco or equivalent12605010Cell detachment solution
IncuCyte ZoomEssen Instruments or equivalentESSEN BIOSCI 4473Incubator-housed automated microscope
ChloropicrinTrinity Manufacturing or equivalentN/AAcute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture mediumInvitrogen or equivalent11330-057Contains HEPES
Fetal bovine serumInvitrogen or equivalent1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)Invitrogen or equivalentE9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)Invitrogen or equivalent12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)Invitrogen or equivalent15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)Sigma or equivalentH0888-10G
Glucose  (cell culture grade)Sigma or equivalentG7021
PBS  (cell culture grade)Sigma or equivalentP5493
siRNADharmacon or equivalentvarious
Thiazolyl blue tetrazolium bromideSigma or equivalentM5655MTT assay substrate
siRNA bufferThermo or equivalentB002000
96-well cell culture platesCorning or equivalentCLS3595
T150 cell culture flasksCorning or equivalentCLS430825
BSL-2 cell culture hoodNuaire or equivalentNU-540
300 mL robotic reservoirsThermo or equivalent12-565-572 
96 baffled automation reservoirsThermo or equivalent1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottlesCorning or equivalentCLS430282
Microplate heat sealerThermo or equivalentAB-1443A
Microplate heat sealing foilThermo or equivalentAB-0475
CardamoninTocris or equivalent2509Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002 Tocris or equivalent2008Anti-inflammatory, used as positive control
DMSOSigma or equivalentD8418
48% hydrofluoric acidSigma or equivalent339261Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014382
200 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014391
20 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014392
1000 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17014497
200 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17013810
20 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17013808
Pipettor tips 1000 μLRainin or equivalent17002920
Pipettor tips 200 μLRainin or equivalent17014294
Pipettor tips 20 μLRainin or equivalent17002928
Chemical fume hoodJamestown Metal ProductsMHCO_229
384-well sample storage platesThermo or equivalent262261
Sodium chlorideSigma or equivalentS6191
50 mL conical tubesThermo or equivalent14-959-49A
Serological pipettes 50 mLCorning or equivalent07-200-576
Serological pipettes 25 mLCorning or equivalent07-200-575
Serological pipettes 10 mLCorning or equivalent07-200-574
Serological pipettes 5 mLCorning or equivalent07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cellsN/AN/AThese cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell CounterMillipore or equivalentPHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) InstrumentAffymetrix or equivalent00-0372
Affymetrix 24- and 96-array platesAffymetrix or equivalent901257; 901434
Draegger tube HFDraeger or equivalent8103251
Draegger tube CPDraeger or equivalent8103421
Draegger pumpDraeger or equivalent6400000
Clear Plate sealsResesarch Products International or Equivalent202502
Reagent reservoirsVistaLab Technologies or equivalent3054-1000
XlfitIDBS or equivalentN/AExcel add-in used for automated curve fitting

Referencias

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