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Resumo

A triagem de RNA inibitória pequena de alta taxa de transferência é uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e validação de modelos de exposição e métodos para o rastreio de alto rendimento de fluoreto de hidrogênio e cloropicrina-induzido por lesão epitelial de córnea.

Resumo

Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. Nos esforços para desenvolver tratamentos e terapias para cuidar de exposição, pode ser importante para compreender os mecanismos moleculares e celulares destes ferimentos. Propomos que a utilização dos rastreio pequena de RNA (siRNA) inibitório alto throughput pode ser uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. siRNA são dobro encalhadas moléculas de RNA que são 19-25 nucleotides longos e utilizam o silenciamento caminho para degradar o mRNA do gene pós-transcricional que tem homologia com o siRNA. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. O desenvolvimento e validação de modelos de exposição em vitro e métodos para o alto throughput screening (HTS) de fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina-(CP) induzido por lesão ocular são apresentados neste artigo. Embora nós selecionamos essas duas substâncias tóxicas, nossos métodos são aplicáveis ao estudo de outras substâncias tóxicas, com pequenas modificações para o protocolo de exposição tóxica. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e produção de IL-8 foram selecionados como pontos de extremidade no protocolo de triagem. Diversos desafios associados ao desenvolvimento de exposição tóxica e métodos de cultura celular adequados para estudos HTS são apresentados. Permite a criação de modelos HTS para estas substâncias tóxicas mais estudos entender melhor o mecanismo da lesão e a tela para terapêutica potencial para lesão ocular química.

Introdução

Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Infelizmente, tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea só são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. A atual estratégia de tratamento é específico e principalmente inclui tratamentos terapêuticos tópicos tais como os lubrificantes, antibióticos, e cycloplegics seguido por anti-inflamatórios (por exemplo, esteroides) uma vez a córnea tem re-epithelialized1 ,2. Apesar das melhor tratamento terapêutico opções atuais disponíveis, prognóstico a longo prazo é geralmente pobre devido à turvação corneal progressiva e neovascularização2,3.

Modelos animais tem sido tradicionalmente usados para investigar a toxicidade química e compreender os mecanismos de lesão. No entanto, estudos em animais são demorado e caro. Existem também os esforços para reduzir a experimentação animal. Por exemplo, a legislação REACH (1907/2006 CE) na União Europeia tem disposições destinadas a reduzir a experimentação animal. As disposições incluem uma exigência que as empresas compartilham dados para evitar testes animais e obtenção de aprovação da Agência Europeia dos produtos químicos, antes de realizar os testes propostos em animais. Ao abrigo das disposições do REACH, a experimentação animal deve ser um último recurso. Há também o regulamento europeu de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminadas a testes de cosméticos em animais. Quando são realizados estudos em animais, eles são guiados pelos princípios do 3Rs (refinamento, redução e substituição), que fornecem uma estrutura para a realização de pesquisas com animais mais humana, reduzindo o número de animais utilizados e usando alternativas não-animais sempre que possível. Por estas razões, o campo de toxicologia tem procurado adoptar em vitro ensaios que podem fornecer a introspecção do mecanismo molecular de toxicidade e podem ser feitos em maior taxa de transferência4. Esta é uma abordagem de toxicologia funcional onde substâncias tóxicas são definidas por sua função em vez de unicamente por sua química. Levou um passo adiante, funcional toxicogenomics procurar compreender as funções que desempenhar os efeitos de substâncias tóxicas5genes específicos. Com a aplicação da tecnologia siRNA, telas para investigar a função do gene nas respostas moleculares e celulares a substâncias tóxicas podem ser feitas com alto rendimento. siRNA são moléculas de RNA encalhadas dobro que são 19-25 nucleotides longos que aproveitar o post transcriptional gene silencioso caminho presente em todas as células de mamíferos6. Estes são sinteticamente feitos e projetados para atingir um gene específico. Quando introduzido em uma célula, o siRNA é processado e um fio, o fio guia, é carregado no complexo silencioso induzido por RNA (RISC). O siRNA direciona o RISC para uma região complementar em uma molécula de mRNA, e o RISC degrada o mRNA. Isso resulta na redução da expressão do gene específico. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. Esta abordagem tem sido usada para entender os mecanismos de susceptibilidade de ricina e a indução de AHR-dependente de CYP1A17,8.

A lista de avaliação de risco de terrorismo químico (CTRA) e as listas de produtos químicos industriais tóxicos (TIC) têm discriminados selecionados produtos químicos com base na sua toxicidade e potencial para ser liberado durante um terrorista, guerra ou acidente industrial evento9. Nós estamos aplicando um alto throughput de siRNA, abordagem de toxicogenomic (HTS) para o estudo de substâncias tóxicas de lista CTRA, que foram identificados com alto risco de utilização em um incidente terrorista de triagem. Toxicologia tradicional procura entender os efeitos adversos que produtos químicos em organismos vivos; no entanto, temos um desejo mais para entender os mecanismos de lesão com a finalidade de informar o desenvolvimento de abordagens terapêuticas e terapêutica e, possivelmente, descobrir moléculas que podem ser direcionadas para o desenvolvimento de terapêutico. Este esforço de certa forma pode ser considerado análogo ao uso de triagem de siRNA alto throughput e ensaios de célula com base na droga descoberta processo10. A principal diferença seria que essa descoberta de drogas normalmente procura um destino singular para descoberta terapêutica Considerando que em nossa abordagem é pouco provável que haja um destino singular com elevado valor terapêutico para o tratamento de exposição tóxica. Antecipamos que qualquer paradigma de tratamento eficaz para a exposição tóxica exigiria uma abordagem multi-facetada para alcançar alto valor terapêutico, e toxicogenomic dados vital podem informar uma paradigma de tratamento eficaz.

Automação de bancada traz metodologia alto throughput para laboratórios fora as indústrias farmacêuticas ou biotecnologia. Os estudos em vitro no nosso Instituto têm sido historicamente ensaios tradicionais que são de baixa taxa de transferência11,12,13. Nos últimos anos, nosso laboratório possui uma transição para o uso da robótica de bancada para realizar a triagem de siRNA alto throughput. Aqui, apresentamos o refinamento dos modelos de célula ocular e o desenvolvimento in vitro métodos de exposição para o fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina (CP) apropriada para triagem de siRNA alto throughput. Nosso objetivo é identificar as moléculas que regulam a lesão celular em resposta a essas substâncias tóxicas. Os alvos da biblioteca siRNA selecionados incluem receptores G proteína quinase de proteína, proteases, fosfatases, canais iônicos e outros alvos potencialmente druggable. HF e CP foram selecionados para o estudo por agentes de lista CTRA com os relatórios de ToxNet dos acidentes industriais a cruzar para encontrar aqueles que apresentam o maior risco de lesão ocular através do vapor exposição9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) foi originalmente usado como um gás lacrimogêneo em WWI15. Atualmente é usado como um fumigante agrícola e funções como um inseticida, fungicida e nematicida16. Fluoreto de hidrogênio (HF) é usado em processos incluindo alquilação em refinarias de petróleo e fluoração eletroquímica de compostos orgânicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) é um gás, mas na sua forma aquosa é o ácido fluorídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Portanto, eleito para usar HFA em nosso celular em modelos de exposição. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e o marcador inflamatório IL-8 foram selecionadas como pontos de extremidade alvos que estão envolvidos na lesão celular devem reflectir-se na morte celular e a resposta inflamatória. Especificamente, se o alvo fosse a desempenhar um papel protetor na exposição tóxica, morte celular e/ou produção de citocinas inflamatórias deve aumentar quando a expressão-alvo é inibida por siRNA. O contrário seria verdadeiro para alvos que desempenham um papel negativo. Além disso, inflamação crônica parece desempenhar um papel na patologia da córnea após exposição e intervenção em caminhos de morte celular podem melhorar os resultados clínicos2,18.

Protocolo

1. manutenção de cultura celular

  1. Crescer a linha de celular SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO2e 90% de umidade em DMEM F-12 com 15% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, µ g/L 10 fator de crescimento epidérmico (EGF) e insulina 5mg/L.
  2. Passagem da linhagem celular a cada 3 a 4 dias (dependendo da densidade de semeadura) para garantir que a confluência nunca excede 80% durante a manutenção da cultura.
  3. Separe as células de balões usando uma solução de destacamento (solução de 14 mL para cada frasco de2 150 cm) e incubação a 37 ° C para não mais do que 8 min.
  4. Neutralizar a solução de desprendimento com igual volume de meio de cultura celular e as células em tubos de Erlenmeyer de 50 mL de pelotas por centrifugação durante 7 min a 160 x g.
  5. Ressuspender o pellet de células no meio (20 mL para cada frasco de2 150 cm).
  6. Conte as células com um contador de celular portátil automatizado e sementes em frascos de novos numa densidade que lhes permitirá crescer por 3 a 4 dias sem exceder 80% confluência.

2. placa células para experimentação

  1. Balões de seleção de SV40-HCECs por microscopia de luz contraste fase para garantir essa confluência é menor que 80% e para avaliar a saúde geral da célula.
  2. Desanexar, pelota, resuspenda e contar SV40-HCECs de frascos, conforme descrito nas etapas de 1.3 para 1.6 de manutenção de cultura celular. Use meio de SV40-HCEC contendo hidrocortisona 0,5 µ g/mL (média HCORT) para Ressuspender as células.
  3. Numa garrafa descartável média, prepare uma suspensão de SV40-HCECs em células/mL 17.857 médio pré-aquecido e HCORT.
    1. Prepare um volume suficiente de suspensão de células para o número de placas para ser semeado.
    2. Sementes de um mínimo de 14 x 96 poços de placas com células para cada placa de biblioteca de siRNA ser estudado.
  4. Agite o frasco para suspender as células uniformemente, despeje um volume suficiente de suspensão de células em um reservatório no ninho agitador orbital de um manipulador de líquido automático e armazenar o frasco contendo a suspensão de células em um 37 ° C placa de aquecimento durante o chapeamento de célula processo.
  5. Use o manipulador de líquido automático para adicionar células à placas em uma densidade de 1000 células por poço (5000 células/cm2) em 70 µ l de meio por alvéolo de uma placa de 96 poços. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
    1. Execute o agitador orbital a 100 rpm constantemente durante o processo de preparação.
    2. Misturar a suspensão celular três vezes (140 µ l de volume de mistura) usando o manipulador de líquido automático.
    3. Aspirar a 140 µ l da suspensão celular e dispense 70 µ l em cada poço de duas placas de cultura de células.
    4. Repita as etapas 2.5.3 e 2.5.4 até que todas as placas têm sido inoculadas com células.
    5. Encha novamente o reservatório de suspensão de célula conforme necessário durante o processo de preparação.
  6. Depois que as placas têm sido semeadas, removê-los do manipulador de líquido automático e incube-os por 30 min à temperatura ambiente antes de transferi-los para uma incubadora de cultura de células.
  7. Avalie a densidade de células de cada poço por cada placa na manhã seguinte, usando um sistema automatizado de imagens que está alojado em uma incubadora de cultura celular e excluir quaisquer placas de estudo que têm poços interiores que não estão entre 15% e 22% de Confluencia.

3. transfect células com siRNA

  1. Adquirir placas de biblioteca siRNA do fornecedor pré-configurado para conter 80 alvos de siRNA por placa (ver Figura 4), com colunas 1 e 12 deixou vazio.
  2. Reconstitua a placa de biblioteca de siRNA com buffer de siRNA para uma concentração final de 2 pmol / µ l para cada poço de siRNA de acordo com instruções19 as indicações do fabricante.
  3. Transfect as células 24 h após a semeadura com 4 pmol/poço de siRNA e 0,3 µ l/poço de reagente de transfeccao. Executar todas as etapas de acordo com o protocolo do fabricante reagente de transfeccao (ver Figura 4 para layout de placa)20.
    1. Executar todas as transfections usando um manipulador de líquido automático e usar um 25 µ l/s de velocidade de pipetagem para todas as etapas. Use caixas de ponta pré-configurado para abordar apenas os poços que serão transfected.
    2. Usamos a parte superior metade da placa da biblioteca de transfect um conjunto de seis pratos replicar referido como o "Top Plate Set" (seis réplicas por siRNA, n = 6).
    3. Use o fundo metade da placa da biblioteca de transfect um conjunto diferente de seis placas replicar referido como o "fundo Plate Set" (seis réplicas por siRNA, n = 6).
    4. Use o termo "Conjunto de prato cheio" para descrever as 12 placas de célula que tem sido transfected com biblioteca siRNA.
    5. Transfect poços B2-B6 de todas as placas na placa completo conjunto com siRNA piscina negativo depois de todos os conjuntos de chapa superior e inferior tem sido transfected com biblioteca siRNA.
    6. Também transfect poços B2-B6 de outra duas placas, que não recebem biblioteca siRNA e servirão como controles não expostos (um para o conjunto da placa superior) e outro para o conjunto de placa de fundo, com piscina negativo siRNA.
  4. Incube todas as placas de célula em uma incubadora de cultura de células 4 horas depois de todas as misturas de transfeccao foram adicionadas e a mistura de gentil tocando a cada hora.
  5. Uso um manipulador de líquido automático para lavar todos os poços das placas duas vezes com o medium HCORT diluído 1:5 em PBS. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
    1. Aspirar a 100 µ l de cada poço e descarte o que dentro de um reservatório de resíduos.
    2. Adicionar a cada bem 100 µ l/poço previamente aquecido médio HCORT diluído 1:5 PBS em que está contido em um reservatório diferente em um volume suficiente para o número de placas de.
    3. Repita as etapas 3.5.1 e 3.5.2 para cada placa.
      1. Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.
      2. Encher o reservatório com média HCORT diluído 1:5 em PBS, conforme necessário.
    4. Aspirar a 100 µ l de cada poço e descartar que no reservatório de resíduos.
  6. Refeed todos os poços das placas com 100 µ l/poço HCORT medium, que está contido em um reservatório diferente em um volume suficiente de média para o número de placas.
    1. Encha novamente o reservatório com médio conforme necessário.
  7. Use poços C6-C2 de todas as placas como controles não-transfectadas.
  8. Mantenha poços B7-B11 e C11-C7 de todas as placas não-transfectadas para serem utilizados como controles de droga e o veículo para a exposição tóxica.

4. refeed as células o seguinte dia

  1. Use um manipulador de líquido automático para refeed todos os poços das placas. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
    1. Aspirar a 100 µ l de cada poço e descarte o que dentro de um reservatório de resíduos.
    2. Cada um refeed bem com 100 µ l/poço HCORT medium que está contido em um reservatório diferente e tem um volume suficiente de média para o número de placas para ser entrarão.
    3. Repita as etapas 4.1.1 e 4.1.2 conforme necessário para refeed todas as placas da célula.
      1. Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.
      2. Encha novamente o reservatório com médio conforme necessário.

5. adição de controle positivo

  1. Dois dias depois do transfection e duas horas antes da exposição, preparar uma solução µM 62,5 do controlo positivo cardamonin médio HCORT ser usado para exposições do HFA e adicionar a linha B de um reservatório de 8-linha de diluição.
    1. Para a exposição de CP, preparar e usar uma solução de 25 µM de SKF 86002.
    2. Prepare um volume de controle positivo suficiente para o número de placas para ser testado.
  2. Preparar uma solução de 0.625% de DMSO em meio HCORT (controle de veículo) e adicione a linha C do mesmo reservatório.
    1. Para a exposição de CP, preparar e usar uma solução de 0,5% de DMSO.
    2. Prepare um volume de controle do veículo suficiente para o número de placas para ser testado.
  3. Uso o manipulador de líquido automático adicionar controles positivo e veículo para poços B7-B11 e C11-C7 de cada placa de células e usar um 50 µ l/s pipetagem velocidade para todas as etapas. Use caixas de ponta pré-configurado para abordar apenas os poços que receberão os controles positivo e veículo.
    1. Remover 10 µ l de meio de poços B7-B11 e C11-C7 de cada placa de células e descartá-lo em linhas G e H do reservatório 8-linha de diluição.
    2. 10 µ l dos controles positivo e veículo de transferência para esses poços e misture 3 vezes.
  4. Retorne estas placas de célula para a incubadora.
  5. Repita etapas 5.3 para 5.4 até ter recebido todas as placas da célula positivo e controles do veículo.

6. HF exposição de culturas de células

Cuidado: HFA é extremamente tóxico e corrosivo.

  1. Realizar todas as operações de exposição química em uma coifa química usando luvas de nitrilo duplo, um casaco de laboratório, protetores de manga de polietileno descartáveis e óculos de segurança.
    1. Adquira HFA como uma solução de 48%.
    2. Diluir o HFA para 1% com água ultrapura e armazenar em alíquotas de 5 mL em frascos de polietileno de parede grossa de 10 mL para melhorar a segurança.
    3. Descontaminar pontas de pipetas e reservatórios que tem contacto com HFA e qualquer sobra HFA líquido com gluconato de cálcio 2.5% antes do descarte no fluxo de resíduos perigosos.
  2. Para cada placa de biblioteca de siRNA sob investigação, preparar uma solução de médio de HFA 0.0036% adicionando 288 µ l de 1% HFA para 80 mL de meio de HCORT previamente aquecido em um frasco de 150 mL.
    1. Agite a garrafa e incubar a HFA diluído em uma incubadora de 37 ° C na coifa química por 10 min.
  3. Misture a solução média HFA novamente agitando o recipiente e adicione a solução média HFA para um reservatório de reagente em um prato quente.
  4. Realize a exposição com dois técnicos que trabalham em conjunto.
    1. Ter o técnico sobre o µ l aspirado certa de 100 de cada um dos poços de uma placa de células usando uma pipeta de 12 canais interiores e passar a placa para o técnico à esquerda.
    2. Já o técnico da esquerda Adicione 100 μl por poço da solução médio HFA.
    3. Repita as etapas 6.4.1 e 6.4.2 para todas as placas de células que são para ser exposto a toxicidade.
    4. Também, repita as etapas 6.4.1 e 6.4.2 para placas de controle não expostos, utilizando o meio HCORT fresco em vez da solução médio HFA.
  5. Colocar as placas na incubadora de capa das emanações químicas por 20 min e depois devolvê-las para a incubadora de cultura de células.
  6. Repita a etapa de adição de controlo positivo (etapas 5.1 a 5.5) como anteriormente mostrada uma vez que todas as placas foram expostas e retornadas para a incubadora de cultura de células.

7. CP exposição de culturas de células

Cuidado: CP aguda é tóxico e irritante.

  1. Realizar todas as operações de exposição química em uma coifa química usando luvas de nitrilo duplo, um casaco de laboratório, protetores de manga de polietileno descartáveis e óculos de segurança.
    1. Adquira o CP.
    2. Diluir o CP para 5% em DMSO e armazenar em alíquotas de 10 mL em frascos de 10 mL cintilação para melhorar a segurança.
    3. Descontaminar pontas de pipetas e reservatórios que tem contacto com CP e qualquer sobra líquido CP com bissulfito de sódio 2,5% antes do descarte no fluxo de resíduos perigosos.
  2. Prepare um volume suficiente de pré-aquecido médio HCORT contendo 1 x caneta/Strep e PBS pré-aquecido para o número de placas para ser exposto.
  3. Para cada conjunto de conjunto de placa de topo ou placa de fundo, adicionar 8.04 µ l de 5% CP em DMSO a uma alíquota de 50 mL de pré-aquecido médio HCORT e misture bem para uma concentração final de CP de 0,0008%. Tampar o tubo firmemente e incubar a solução em uma incubadora de 37 ° C na coifa química por 1h.
    1. Tempo a adição de CP para as alíquotas de 50 mL de meio para que cada um exposto superior placa definida e conjunto de placa de fundo recebe toxicant exatamente 1 h depois CP foi adicionado à alíquota de 50 mL de meio.
  4. Remover um conjunto de placa de topo e 1 controlo unexposed placa da incubadora de cultura celular e colocá-los na coifa química perto do final do período de incubação.
  5. Misturar a solução de CP por inversão do tubo e então decantá-lo para um reservatório de reagente no final do período de incubação de 1 h.
  6. Realize a exposição com dois técnicos que trabalham em conjunto.
    1. Ter o técnico sobre o µ l aspirado certa de 100 de cada um dos poços de uma placa de células usando uma pipeta de 12 canais interiores e passar a placa para o técnico à esquerda.
    2. Já o técnico da esquerda Adicione 100 μl por poço da solução CP médio.
    3. Repita as etapas 7.6.1 e 7.6.2 para todas as placas de células da placa Top Set para ser exposto a toxicidade.
    4. Também, repita as etapas 7.6.1 e 7.6.2 para placas de controle não expostos, utilizando o meio HCORT fresco em vez da solução de CP médio.
  7. Coloque as placas em uma incubadora de 37 ° C na coifa química por 10 min.
  8. Adicionar um volume suficiente de PBS e HCORT meio contendo 1 x caneta/Strep a reservatórios de reagente perto do final do período de incubação de 10 min.
  9. Retire a solução CP chapas de célula usando uma pipeta de 12 canais e substituí-lo com 100 µ l por alvéolo de PBS no final do período de incubação de 10 min.
  10. Imediatamente retire a PBS célula chapas e substituí-lo com 100 µ l por alvéolo de meio de HCORT contendo 1 x caneta/Strep.
  11. Também, repita as etapas de 7.9 e 7.10 para as placas de controle não expostos.
  12. Entregue as chapas de célula para uma incubadora de cultura de célula padrão.
  13. Repita as etapas de 7,3 para 7.12 para o conjunto da placa de fundo.
  14. Repita a etapa de adição de controlo positivo (etapas 5.1 a 5.5) como descrita anteriormente uma vez que todas as placas foram expostas e retornadas para a incubadora de cultura de células.

8. recolha e ensaio da viabilidade celular da amostra

  1. Vinte e quatro horas após a exposição, preparar uma solução de substrato MTT 0,5 mg/mL em PBS contendo 10 g/L de glicose e aquecer a 37 ° C21. Prepare-se 10 mL de substrato para cada placa ser analisada.
  2. Para o número de placas para ser analisada, adicione um volume suficiente de solução de substrato MTT para um reservatório em um manipulador de líquido automático.
  3. Uso o manipulador de líquido automático para coletar a amostra e Adicionar substrato MTT usando um 50 µ l/s pipetagem velocidade para todas as etapas. Pré-configure caixas de ponta para atender apenas os poços para ser analisada.
    1. Médio de aspirado 95 µ l dos interna 60 poços da placa de células e depósito 42,5 µ l em cada uma das duas placas de armazenamento 384-bem.
    2. Imediatamente adicionar 100 µ l por poço da solução de substrato de MTT para as placas da célula e incube-os a 37 ° C numa incubadora de cultura celular para 1,5 h.
    3. Encha novamente o reservatório com solução de substrato MTT conforme necessário.
  4. Incube as placas de célula a 37 ° C numa incubadora de cultura celular por 1h.
  5. Selar as placas de armazenamento 384-bem e armazená-los a-80 ° C para posterior análise.
  6. Repita as etapas de 8,3 a 8,5 para todos os conjuntos de chapa superior e inferior e o associado controles não exposto.
    1. Se desejar, mas lavá-los ao adicionar solução de substrato MTT e quando alternar entre placa define, reutilize dicas entre repetições.
  7. Após a incubação de 1 h, adicione um volume suficiente de DMSO para um reservatório em um manipulador de líquido automático.
  8. Uso o manipulador de líquido automático adicionar DMSO e usar um 50 µ l/s pipetagem velocidade para todas as etapas.
    1. Aspirar a 100 µ l de cada um dos poços das placas célula internos e descartar a solução de substrato MTT em um reservatório de resíduos.
      1. Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.
    2. Sobreposição de cada poço com 100 µ l de DMSO.
      1. Encha novamente o reservatório de DMSO conforme necessário.
  9. Agite as placas num agitador de placa por 3 min.
  10. Medir a absorvância a 570 e 690 nm utilizando um Espectrofotômetro de placa.
  11. Subtrair o fundo e calcular a viabilidade celular % dividindo os valores de absorvância expostas pelos controles não expostos. Use o controle de siRNA de média unexposed piscina negativo para calcular a viabilidade de celular % para todos os destinos.

9. medida de IL-8 concentração em sobrenadantes de cultura celular

  1. Medida a concentração de IL-8 nos sobrenadantes de cultura de células usando um não lavar ensaio baseado em grânulo de acordo com instruções22 as indicações do fabricante. Crie um layout de placa de ensaio para acomodar amostras e curva padrão.
  2. Retire as placas de 384 poços de armazenamento do freezer-80 ° C, descongelar à temperatura ambiente e brevemente, Centrifugar as placas para coletar a amostra no fundo dos poços.
  3. Para o número de placas de ensaio a ser executado, faça um volume suficiente de grânulos aceitador anti-IL-8 e biotinilado anti-IL-8 em buffer de ensaio incluído no kit. Use a proporção de 50 µ l de grânulos de aceitador de anti-IL8 e 50 µ l de biotinilado anti-IL8 para 9,9 mL de tampão de ensaio.
    1. Usando uma pipeta multicanal, adicione a mistura do grânulo/anticorpo para uma placa de armazenamento de 384-bem preto.
      1. Adicione o aceitador do grânulo/anticorpo aos poços para o uso de amostras e a curva de calibração de acordo com o layout de placa de ensaio.
      2. Adicione um volume suficiente por alvéolo para o número de placas de ensaio a ser executado.
  4. Reconstituir a IL-8 padrão de 1000 pg/mL, utilizando o meio de cultura celular contendo 354 µM NaCl. Fazer um volume suficiente para o número de placas de ensaio a ser executado.
  5. Fazer oito diluições seriais da curva padrão.
  6. Adicione a curva padrão em triplicado aos poços de uma placa de armazenamento de 384-bem preto de acordo com o layout de placa de ensaio adequados. Adicione um volume suficiente por alvéolo para o número de placas de ensaio a ser executado.
    1. Da mesma forma, adicionar o meio de cultura celular contendo 354 µM NaCl com nenhum IL-8 para medição de fundo.
  7. Use um manipulador de líquido automático para realizar o ensaio. Use caixas de ponta pré-configurado para abordar apenas os poços designados pelo layout de placa de ensaio. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
    1. Transferência 8 µ l da mistura do grânulo-anticorpo aceitador aos poços das placas 384-poço raso ensaio bem branco.
      1. Adicione somente nos poços designados para amostras e curva padrão de acordo com o layout de placa de ensaio.
    2. Transferi 2 µ l da curva padrão para os poços apropriados das placas de acordo com o layout de placa de ensaio ensaio bem superficial.
    3. Preparar uma solução de NaCl de 3,54 M e adicionar um volume suficiente para o número de placas para ser analisada para um reservatório superficial no manipulador de líquido automático.
    4. Ajuste a concentração de sal das amostras para coincidir com a curva padrão ao transferir 4,5 µ l da solução de NaCl para as amostras nas placas de armazenamento de 384-poço preto.
    5. Misturar as amostras três vezes usando um volume de 30 µ l de misturando, e transferência 2 µ l das amostras para o branco raso bem do ensaio de placas de acordo com o layout de placa de ensaio.
      1. Trocar dicas entre as placas de amostra.
    6. Incube durante 1 h no escuro à temperatura ambiente.
    7. Para o número de placas de ensaio a ser executado, faça um volume suficiente de grânulos aceitador no buffer de ensaio. Use a proporção de 200 µ l de grânulos secundários aceitador para 12,3 mL de tampão de ensaio.
    8. Usando uma pipeta multicanal, adicione contas secundárias para uma placa de armazenamento de 384-bem preto.
      1. Adicione contas secundárias aos poços para o uso de amostras e a curva de calibração de acordo com o layout de placa de ensaio.
      2. Adicione um volume suficiente por alvéolo para o número de placas de ensaio a ser executado.
    9. Usando o manipulador de líquido automático, transferi 10 µ l dos grânulos secundários aos poços das placas brancas 384-poço raso ensaio bem.
      1. Adicionar somente nos poços que recebeu amostras e curva padrão de acordo com o layout de placa de ensaio e lavar as pontas entre cada prato.
    10. Incube durante mais uma hora no escuro à temperatura ambiente.
  8. Sele o ensaio de placas com limpar selos de chapa e digitalizar usando um leitor de placa compatível com o ensaio. Use 0,2 mm distância entre placa e detector, tempo de excitação de 180 ms e tempo de medição de 550 ms para a verificação.
  9. Importe os dados brutos de ensaios os IL-8 em uma planilha.
  10. Use curva automatizada de encaixe para a curva padrão dos ensaios IL-8 e em seguida, converter os dados brutos para pg/mL para cada amostra.

Resultados

Desenvolvimento do método de exposição

Nós refinado e avaliamos a adequação da linha de células epiteliais da córnea humana SV40-HCEC para uso em estudos HTS. SV40-HCEC foram imortalizados usando o antígeno de T grande SV-40 e foi um presente do amigo Dhanajay23. Havia muitas variáveis exploradas no desenvolvimento de metodologia de exposição para apresentar de forma concisa n...

Discussão

Neste documento descrevemos nossos métodos e resultados no desenvolvimento de uma célula epitelial de alto throughput córnea triagem modelo para o estudo das lesões HF e CP. Também apresentamos os resultados a partir da tela de siRNA primário para lesão de HF. Havia muitos desafios para o desenvolvimento de modelos HTS para o estudo das lesões TIC. Métodos que encontramos na literatura relacionada ao estudo de HF, HFA ou CP em modelos de cultura de células foram de pouca ajuda. A maioria dos estudos em vitr...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

DISCLAIMER: as opiniões expressadas neste artigo são dos autores e não refletem a política oficial do departamento do exército, departamento de defesa ou o governo dos EUA. Esta pesquisa foi apoiada por um acordo interinstitucional entre NIAID/NIH e o USAMRICD e em parte por uma entrevista para o programa de participação de pesquisa pós-graduação em defesa dos Estados Unidos exército médico pesquisa Instituto de química administrada pelo carvalho Cume Instituto de ciência e educação através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia dos EUA e USAMRMC.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo nacional institutos de saúde neutralizar programa interagências acordo # AOD13015-001. Gostaríamos de agradecer a Stephanie Froberg e Peter Hurst esforços e expertise na produção de vídeo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Bravo liquid handing platformAgilent or equivalentG5409A
Bravo plate shakerAgilent or equivalentOption 159
Bravo 96LT disposable tip headAgilent or equivalentOption 17896-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip headAgilent or equivalentOption 17796-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip headAgilent or equivalentOption 179384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19133-212
EnSpire multimode plate readerPerkin Elmer or equivalent2300-0000AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit Perkin Elmer or equivalentAL224Fno-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplatesPerkin Elmer or equivalent6008359
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen or equivalent13778500Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum MediumInvitrogen or equivalent31985070
TrypLE ExpressGibco or equivalent12605010Cell detachment solution
IncuCyte ZoomEssen Instruments or equivalentESSEN BIOSCI 4473Incubator-housed automated microscope
ChloropicrinTrinity Manufacturing or equivalentN/AAcute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture mediumInvitrogen or equivalent11330-057Contains HEPES
Fetal bovine serumInvitrogen or equivalent1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)Invitrogen or equivalentE9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)Invitrogen or equivalent12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)Invitrogen or equivalent15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)Sigma or equivalentH0888-10G
Glucose  (cell culture grade)Sigma or equivalentG7021
PBS  (cell culture grade)Sigma or equivalentP5493
siRNADharmacon or equivalentvarious
Thiazolyl blue tetrazolium bromideSigma or equivalentM5655MTT assay substrate
siRNA bufferThermo or equivalentB002000
96-well cell culture platesCorning or equivalentCLS3595
T150 cell culture flasksCorning or equivalentCLS430825
BSL-2 cell culture hoodNuaire or equivalentNU-540
300 mL robotic reservoirsThermo or equivalent12-565-572 
96 baffled automation reservoirsThermo or equivalent1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottlesCorning or equivalentCLS430282
Microplate heat sealerThermo or equivalentAB-1443A
Microplate heat sealing foilThermo or equivalentAB-0475
CardamoninTocris or equivalent2509Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002 Tocris or equivalent2008Anti-inflammatory, used as positive control
DMSOSigma or equivalentD8418
48% hydrofluoric acidSigma or equivalent339261Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014382
200 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014391
20 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014392
1000 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17014497
200 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17013810
20 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17013808
Pipettor tips 1000 μLRainin or equivalent17002920
Pipettor tips 200 μLRainin or equivalent17014294
Pipettor tips 20 μLRainin or equivalent17002928
Chemical fume hoodJamestown Metal ProductsMHCO_229
384-well sample storage platesThermo or equivalent262261
Sodium chlorideSigma or equivalentS6191
50 mL conical tubesThermo or equivalent14-959-49A
Serological pipettes 50 mLCorning or equivalent07-200-576
Serological pipettes 25 mLCorning or equivalent07-200-575
Serological pipettes 10 mLCorning or equivalent07-200-574
Serological pipettes 5 mLCorning or equivalent07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cellsN/AN/AThese cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell CounterMillipore or equivalentPHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) InstrumentAffymetrix or equivalent00-0372
Affymetrix 24- and 96-array platesAffymetrix or equivalent901257; 901434
Draegger tube HFDraeger or equivalent8103251
Draegger tube CPDraeger or equivalent8103421
Draegger pumpDraeger or equivalent6400000
Clear Plate sealsResesarch Products International or Equivalent202502
Reagent reservoirsVistaLab Technologies or equivalent3054-1000
XlfitIDBS or equivalentN/AExcel add-in used for automated curve fitting

Referências

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