Hoher Durchsatz SiRNA Screening für Chlorpikrin und Fluorwasserstoff-induzierte Hornhaut Epithelzelle Verletzungen

Zusammenfassung

Hoher Durchsatz kleine hemmende RNA-Screening ist ein wichtiges Instrument, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. Hier präsentieren wir Ihnen die Entwicklung und Validierung der Expositionsmodelle und Methoden für das Hochdurchsatz-Screening von Fluorwasserstoff und Chlorpikrin induzierte Hornhaut epitheliale Schädigung.

Zusammenfassung

Schlüpfzeit-induzierte augenfällige Verletzungen ist ein wahre okuläre Notfall weil Chemikalien das Potenzial haben, schnell erheblichen Gewebeschäden verursachen. Behandlungen für Schlüpfzeit-induzierte Verletzung der Hornhaut sind generell unterstützt, da es keine spezifische Therapie gibt um diese Verletzungen zu behandeln. Bei den Bemühungen um Behandlungen und Therapeutika zur Betreuung der Exposition zu entwickeln kann es wichtig zu verstehen, die molekularen und zellulären Mechanismen dieser Verletzungen sein. Schlagen wir die Nutzung der hohen Durchsatz kleine hemmende RNA (SiRNA) Screening ein wichtiges Instrument sein kann, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. SiRNA sind doppelte gestrandete RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide lang und nutzen die posttranskriptionelle gen-silencing Weg, um mRNA zu degradieren die Homologie, die SiRNA haben. Die daraus resultierende Verringerung der Expression von bestimmten Genen kann dann im vergiftendes exponierten Zellen zu prüfen, die Funktion dieses Gens in die zelluläre Antwort auf die Schlüpfzeit untersucht werden. Die Entwicklung und Validierung von in-vitro- Expositionsmodelle und Methoden für die Hochdurchsatz-screening (HTS) von Fluorwasserstoff (HF) und Chlorpikrin-(CP) induzierte augenfällige Verletzungen werden in diesem Artikel vorgestellt. Obwohl wir diese zwei Giftstoffe ausgewählt haben, sind unsere Methoden auf die Studie von anderen Schadstoffen mit geringfügigen Änderungen des Protokolls vergiftendes Exposition anwendbar. Das SV40 große T Antigen verewigt menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für die Studie ausgewählt wurde. Zellviabilität und IL-8 Produktion wurden als Endpunkte in der Screening-Protokoll ausgewählt. Mehrere Herausforderungen im Zusammenhang mit der Entwicklung von giftigen Belichtung und Zelle Kulturmethoden geeignet für HTS-Studien werden präsentiert. Die Einrichtung von HTS-Modelle für diese Giftstoffe kann für weitere Studien, den Mechanismus der Schädigung und zum Bildschirm für potenzielle Therapeutika für chemische augenfällige Verletzungen besser zu verstehen.

Einleitung

Schlüpfzeit-induzierte augenfällige Verletzungen ist ein wahre okuläre Notfall weil Chemikalien das Potenzial haben, schnell erheblichen Gewebeschäden verursachen. Leider sind Behandlungen für Schlüpfzeit-induzierte Verletzung der Hornhaut nur generell unterstützt, da es keine spezifische Therapie gibt um diese Verletzungen zu behandeln. Die aktuellen Behandlungsstrategie ist unspezifisch und umfasst in erster Linie topische Therapien wie Schmierstoffe, Antibiotika, und Cycloplegics gefolgt von Antiphlogistika (z.B. Steroide) einmal die Hornhaut hat wieder epithelialized^{1 ,2}. Trotz der besten aktuellen therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung ist Langzeit-Prognose im Allgemeinen schlecht durch progressive Trübung der Hornhaut und Neovaskularisation^2,3.

Tiermodelle haben traditionell verwendet, um chemische Toxizität zu untersuchen und Mechanismen der Schädigung zu verstehen. Tierversuche sind jedoch zeitaufwendig und teuer. Auch gibt es Bestrebungen, Tierversuche zu reduzieren. REACH-Verordnung (EG 1907/2006) in der Europäischen Union hat beispielsweise Vorschriften zur Tierversuche reduzieren. Die Bestimmungen enthalten die Forderung, dass Firmen Daten austauschen, zur Vermeidung von tierischen Prüfung und Billigung der Europäischen Chemikalien Agentur vor dem vorgeschlagenen Tests an Tieren durchführen. Gemäß den Bestimmungen der REACH-Verordnung sollten Tierversuche ein letztes Mittel sein. Außerdem gibt es die Europäische Kosmetik-Verordnung (EG 1223/2009), die die Tests von Kosmetika an Tieren auslaufen. Wenn Tierversuche durchgeführt werden, sie orientieren sich an den Grundsätzen der 3R (Verfeinerung, Minderung und Ersatz), die einen Rahmen für humanere Tierversuche durchführen, Verringerung der Zahl der verwendeten Tiere und mit tierversuchsfreien Alternativen bieten wo möglich. Aus diesen Gründen hat das Gebiet der Toxikologie versucht, in-vitro- Assays beschließen, die können Einblick in die molekularen Mechanismen der Toxizität und kann in höheren Durchsatz⁴durchgeführt werden. Dies ist ein funktioneller Toxikologie Ansatz, wo Giftstoffe werden durch ihre Funktion nicht allein durch ihre Chemie definiert. Genommen einen Schritt weiter, funktionelle basolaterale versuchen, die Rollen zu verstehen, die bestimmte Gene in den Effekten von Schadstoffen⁵spielen. Mit der Anwendung der SiRNA-Technologie können bei hohem Durchsatz Bildschirme Genfunktion in der molekularen und zellulären Reaktionen auf Giftstoffe untersuchen erfolgen. SiRNA sind doppelte gestrandete RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide lang, das Nutzen der Post transkriptionellen Gen-Silencing-Weg in allen Säugetierzellen⁶vorhanden sind. Diese sind synthetisch hergestellt und entwickelt, um ein bestimmtes Gen Ziel. Die SiRNA wird verarbeitet, wenn Sie in einer Zelle eingeführt, und ein Strang, der Führer-Strang in der RNA-induced silencing-Komplex (RISC) geladen wird. Die SiRNA lenkt das Risiko auf eine ergänzende Region in einem mRNA-Molekül und die RISC verschlechtert die mRNA. Dies führt bei der Verringerung der Expression von bestimmten Genen. Die daraus resultierende Verringerung der Expression von bestimmten Genen kann dann im vergiftendes exponierten Zellen zu prüfen, die Funktion dieses Gens in die zelluläre Antwort auf die Schlüpfzeit untersucht werden. Ein solcher Ansatz wurde verwendet, um weiter zu verstehen, die Mechanismen der Ricin Anfälligkeit und die AHR-abhängige Induktion von CYP1A1^7,8.

Die chemische Terrorismus Risk Assessment (CTRA) Liste und toxische Industriechemikalien (TIC) Inserate haben ausgewählte Chemikalien aufgrund ihrer Toxizität und Potenzial, während ein Terrorist, Kriegsführung oder Arbeitsunfall Event⁹freigegeben werden aufgeschlüsselt. Wir wenden eine SiRNA Hochdurchsatz screening (HTS) toxikogenomische Ansatz für die Untersuchung von CTRA Liste Schadstoffen, die mit hohem Risiko für Gebrauch in einem terroristischen Anschlags sein identifiziert wurden. Traditionelle Toxikologie versucht, die negativen Auswirkungen zu verstehen, die Chemikalien auf lebende Organismen haben; Allerdings haben wir einen weiteren Wunsch zu verstehen, die Mechanismen der Schädigung zur Information der Entwicklung von Therapeutika und therapeutische Ansätze und möglicherweise, entdecken Sie Moleküle, die für die therapeutische Entwicklung ausgerichtet werden können. Diese Anstrengung in gewisser Weise kann analog zu den Einsatz von Hochdurchsatz-SiRNA-Screening und zellbasierte Assays in Drug Discovery Prozess¹⁰angesehen werden. Ein wesentlicher Unterschied wäre, dass diese Drogeentdeckung in der Regel ein einzigartiges Ziel für therapeutische Entdeckung sucht, in unserem Ansatz ist es eher unwahrscheinlich, daß wäre ein einzigartiges Ziel mit hohem therapeutischen Wert für die Behandlung von giftigen Belichtung. Wir gehen davon aus, dass wirksame behandlungsparadigma für vergiftendes Exposition einen vielschichtigen Ansatz erfordern würde, hohen therapeutischen Wert zu erreichen, und toxikogenomischen Daten können eine wirksame behandlungsparadigma von entscheidender informieren.

Benchtop Automatisierung bringt Hochdurchsatz-Methodik in Laboratorien außerhalb der Pharma- oder Biotech-Industrie. Die in-vitro- Studien an unserem Institut wurden historisch traditioneller Assays sind niedriger Durchsatz^11,12,13. In den letzten Jahren hat unser Labor die Verwendung der Benchtop-Robotik, hoher Durchsatz SiRNA Screening durchzuführen umgestellt. Hier präsentieren wir die Verfeinerung der okulären zellmodelle und die Entwicklung von in-vitro- Belichtungsmethoden für Fluorwasserstoff (HF) und Chlorpikrin (CP) für hohen Durchsatz SiRNA Screening geeignet. Unser Ziel ist es, Moleküle zu identifizieren, die zelluläre Verletzungen als Reaktion auf diese Giftstoffe zu regulieren. Die SiRNA-Bibliothek von die uns ausgewählten Gehören G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Proteinkinasen, Proteasen, Phosphatasen, Ionenkanäle und andere potenziell druggable Ziele. HF und CP wurden für die Studie von Querverweise CTRA Liste Agenten mit den ToxNet Berichten von Arbeitsunfällen, diejenigen zu finden, die das größte Risiko der okulären Verletzung über Dampf Exposition^9,14präsentieren. CP (chemische Formel Cl₃CNO₂, CAS-Nummer 76-06-2) wurde ursprünglich als ein Tränengas in WWI¹⁵verwendet. Es wird derzeit als eine landwirtschaftliche Räuchermittel und Funktionen als ein Nematizide, Fungizid und Insektizid¹⁶verwendet. Fluorwasserstoff (HF) wird in Prozesse einschließlich der Alkylierung in Ölraffinerien und elektrochemische Fluorierung von organischen Verbindungen¹⁷verwendet. HF (chemische Formel HF, CAS-Nummer 62778-11-4) ist ein Gas, aber in ihrer wässrigen Form ist Flusssäure (HFA, CAS Nr. 7664-39-3). Daher wir gewählt, um HFA in unserer in Zelle Expositionsmodelle. Das SV40 große T Antigen verewigt menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für die Studie ausgewählt wurde. Zellviabilität und entzündlichen Marker IL-8 wurden als Endpunkte ausgewählt, weil Ziele, die zelluläre Verletzungen beteiligt sind in den Zelltod und die entzündliche Reaktion niederschlagen sollte. Insbesondere sollte ein Ziel in vergiftendes Exposition eine schützende Rolle spielen, sollten Zelltod und/oder Produktion von inflammatorischen Zytokinen erhöhen, wenn der Zielausdruck von SiRNA gehemmt wird. Das Gegenteil wäre auch für Ziele, die eine negative Rolle spielen. Chronischer Entzündung scheint auch eine Rolle in der Pathologie der Hornhaut nach Exposition und Intervention in der Zelle Tod wegen Therapieergebnis^2,18verbessern kann.

Protokoll

(1) Zelle Kultur Wartung

1. Wachsen die Zellinie SV40-HCEC bei 37 ° C, 5 % CO₂und 90 % Luftfeuchtigkeit in DMEM F-12 mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 10 µg/L epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 5 mg/L Insulin.
2. Durchgang der Zell-Linie alle 3 bis 4 Tage (je nach Aussaatdichte) um sicherzustellen, dass Konfluenz nie größer 80 % bei der Wartung der Kultur als.
3. Die Zellen von Flaschen mit einem Detachement (14 mL Lösung für jede 150 cm² Kolben) und Inkubation bei 37 ° C für nicht mehr als 8 min zu lösen.
4. Die Ablösung Lösung mit einem gleichen Volumen Zellkulturmedium zu neutralisieren und pellet-Zellen in 50 mL konische Röhrchen durch Zentrifugation für 7 min bei 160 X g.
5. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in Medium (20 mL für jede 150 cm² Kolben).
6. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten handheld Handy Zähler und Samen in neuen Flaschen in einer Dichte, die ihnen ermöglichen, für 3 bis 4 Tagen zu wachsen, ohne mehr als 80 % Konfluenz.

2. Platte Zellen für Experimente

1. Überprüfen Sie, Fläschchen des SV40-HCECs durch leichte Phasenkontrastmikroskopie um sicherzustellen, dass Konfluenz ist weniger als 80 % und allgemeine Zellgesundheit zu bewerten.
2. Lösen, pellet, aufschwemmen und zählen SV40-HCECs aus Kolben wie in 1,3 bis 1,6 Zelle Kultur Wartung beschrieben. Verwenden Sie SV40-HCEC 0,5 µg/mL Hydrocortison (HCORT Mittel)-haltigem Medium, um Zellen zu Aufschwemmen.
3. Bereiten Sie in einer Einweg-mittlere Flasche eine Aussetzung der SV40-HCECs bei 17.857 Zellen/mL in vorgewärmten HCORT Medium.
   1. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension für die Anzahl der Platten gesät werden.
   2. Säen Sie ein Minimum von 14 x 96-Well-Platten mit Zellen für jedes SiRNA-Bibliothek-Platte untersucht werden.
4. Schwenken Sie die Flasche, um gleichmäßig Anhalten der Zellen, Gießen ein ausreichendes Volumen an die Zellsuspension in einem Stausee auf dem Orbitalschüttler Nest eines automatisierten liquid-Handlers und speichern Sie die Flasche mit der Zellsuspension auf einem 37 ° C Erwärmung Platte in die Zelle-Beschichtung Prozesses.
5. Verwenden Sie die automatisierte liquiden Handler Platten bei einer Dichte von 1000 Zellen pro Bohrloch (5000 Zellen/cm²) in 70 µL Medium pro Bohrloch einer 96-Well-Platte Zellen hinzu. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
   1. Führen Sie die Orbitalschüttler bei 100 u/min, ständig bei der Aussaat.
   2. Mischen Sie die Zellsuspension drei Zeiten (140 µL Mix Volume) mit Hilfe des automatisierten liquiden Handlers.
   3. Aspirieren Sie 140 µL Zellsuspension und verzichten Sie 70 µL in jede Vertiefung der beiden Zellplatten Kultur zu.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.3 und 2.5.4, bis alle Platten mit Zellen ausgesät worden sind.
   5. Nachfüllen der Zelle Aussetzung Reservoir bei Bedarf bei der Aussaat.
6. Nachdem die Platten ausgesät haben, entfernen Sie sie aus der automatisierten liquid Handler und inkubieren sie für 30 min bei Raumtemperatur vor der Übertragung in eine Zelle Kultur Inkubator.
7. Bewerten Sie die Zelldichte von jedem gut für jede Platte am nächsten Morgen mit einem automatisierten imaging System befindet sich in einer Zelle Kultur Inkubator und die Studie die inneren Brunnen haben, die nicht zwischen 15 % und 22 % Zusammenfluss sind alle Platten ausschließen.

(3) transfect Zellen mit siRNA

1. SiRNA Bibliothek Platten vom Anbieter vorkonfiguriert um 80 SiRNA Ziele pro Platte enthalten zu erwerben (siehe Abbildung 4), mit Spalten 1 und 12 leer gelassen.
2. Bereiten Sie die SiRNA-Bibliothek-Platte mit SiRNA-Puffer, um eine Endkonzentration von 2 Pmol/µL für jede Vertiefung von SiRNA gemäß des Herstellers Anweisungen¹⁹.
3. Transfizieren Sie die Zellen 24 h nach der Aussaat mit 4 Pmol/Brunnen von SiRNA und 0,3 µL/Well Transfection Reagens. Führen Sie alle Schritte nach der Transfektion Reagens Hersteller-Protokoll (siehe Abbildung 4 Platte Layout)²⁰.
   1. Führen Sie alle die Transfektionen mit einem automatisierten liquid Handler, und verwenden Sie eine 25 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tip-Boxen ansprechen nur die Brunnen, die transfiziert werden wird.
   2. Verwenden der oberen Hälfte der Bibliothek-Platte auf eine Reihe von sechs replizieren Platten transfizieren als das "Top-Platte-Set bezeichnet" (sechs Wiederholungen pro SiRNA, n = 6).
   3. Verwenden Sie die untere Hälfte der Bibliothek Platte an einen anderen Satz von sechs replizieren Platten transfizieren als das "untere Platte Set bezeichnet" (sechs Wiederholungen pro SiRNA, n = 6).
   4. Verwenden Sie den Begriff "Volle Teller Set" 12 Zellplatten beschreiben, die mit Bibliothek SiRNA transfiziert wurden.
   5. Transfizieren Sie Brunnen B2-B6 alle Platten im vollen Teller-Set mit negativen Pool SiRNA, nachdem alle oberen und unteren Platte-Sets mit Bibliothek SiRNA transfiziert wurden haben.
   6. Auch transfizieren Sie Brunnen B2-B6 ein weiteres zweier Platten, die Bibliothek SiRNA nicht empfangen können und wird als unbelichtete Steuerelemente (eine für die obere Platte gesetzt) und eine für die untere Platte Set, mit negativen Pool SiRNA dienen.
4. Inkubieren Sie alle Zellplatten in eine Zelle-Kultur-Inkubator für 4 Stunden, nachdem alle Transfektion Mischungen hinzugefügt wurden und Mix durch sanftes antippen jede Stunde.
5. Einsatz einer automatisierten liquid Handler alle Vertiefungen der Platten zweimal mit vorgewärmten HCORT Medium zu waschen verdünnt 1:5 mit PBS-Puffer. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
   1. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem Brunnen und verwerfen Sie, die zu einem Abfall Reservoir.
   2. Geben Sie in jedes gut 100 µL/vorgewärmte HCORT Medium verdünnt 1:5 in PBS, die in einem anderen Behälter in ausreichendem Umfang für die Anzahl der Platten enthalten ist.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 und 3.5.2 für jede Platte.
      1. Entleeren Sie Abwasser Behälter, je nach Bedarf.
      2. Nachfüllen der Stausee mit HCORT Medium verdünnt 1:5 mit PBS-Puffer nach Bedarf.
   4. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem Brunnen und verwerfen Sie, die in den Abfall-Behälter.
6. Refeed alle Vertiefungen der Platten mit 100 µL/Well vorgewärmten HCORT Medium, das in einem anderen Behälter in ausreichendem Umfang Mittel für die Anzahl der Platten enthalten ist.
   1. Füllen Sie das Reservoir mit Medium, je nach Bedarf.
7. Verwenden Sie Brunnen C2-C6 alle Platten als Steuerelemente nicht transfiziert.
8. Halten Sie Brunnen B7-B11 und C7-C11 alle Platten transfiziert um als Droge und Fahrzeug-Regler für vergiftendes Exposition verwendet werden.

(4) den Zellen refeed folgende Tag

1. Verwenden Sie einen automatisierte liquiden Handler, um refeed alle Vertiefungen der Platten. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
   1. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem Brunnen und verwerfen Sie, die zu einem Abfall Reservoir.
   2. Refeed jeweils gut mit 100 µL/Well vorgewärmten HCORT Medium, das in einem anderen Behälter enthalten ist und hat ein ausreichendes Volumen des Mediums für die Anzahl der Platten zu refed werden.
   3. Wiederholen Sie 4.1.1 und 4.1.2 Bedarf refeed alle Zellplatten.
      1. Entleeren Sie Abwasser Behälter, je nach Bedarf.
      2. Füllen Sie das Reservoir mit Medium, je nach Bedarf.

5. positive Kontrolle Ergänzung

1. Bereiten Sie zwei Tage nach der Transfektion und zwei Stunden vor der Belichtung, eine 62,5 µM-Lösung der Positivkontrolle cadamonin in HCORT Medium für HFA Belichtungen verwendet werden und Zeile B eines 8-reihige Verdünnung Reservoirs hinzufügen.
   1. Für CP Belichtung vorzubereiten und eine 25 µM-Lösung von SKF 86002 verwenden.
   2. Bereiten Sie ein Volumen von Positivkontrolle ausreichend für die Anzahl der Platten getestet werden.
2. Bereiten Sie eine 0,625 % Lösung von DMSO in HCORT Medium (Fahrzeugkontrolle) und Reihe C des gleichen Reservoirs hinzufügen.
   1. Bereiten Sie für CP-Exposition vor und verwenden Sie eine 0,5 % ige Lösung von DMSO.
   2. Bereiten Sie ein Volumen von Fahrzeugkontrolle ausreichend für die Anzahl der Platten getestet werden.
3. Einsatz der automatisierten liquidere Handler Brunnen B7-B11 und C7-C11 jeder Zelle Platte positiv und Fahrzeug Steuerelemente hinzu und verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tip-Boxen an nur die Brunnen, die die Steuerelemente positiv und Fahrzeug erhalten.
   1. Entfernen Sie 10 µL Medium aus Brunnen B7-B11 und C7-C11 jeder Zelle Platte und entsorgen Sie es in Zeilen, G und H des 8-reihige Verdünnung Reservoirs.
   2. 10 µL der Steuerelemente positiv und Fahrzeug in diese Vertiefungen zu übertragen und 3 mal mischen.
4. Diese Zelle Platten in den Inkubator zurück.
5. Wiederholen Sie Schritte 5.3, 5.4, bis alle Zellplatten positive erhalten haben und Fahrzeug-Kontrollen.

6. HF-Exposition von kultivierten Zellen

Achtung: HFA ist ätzend und akut toxisch.

1. Operationen Sie alle Exposition gegenüber chemischen Stoffen in einem chemischen Abzug Doppel Nitril-Handschuhe, ein Laborkittel, Einweg-Polyäthylen Hülse Protektoren und Schutzbrille tragen.
   1. HFA als 48 % Lösung zu erwerben.
   2. HFA 1 % mit Reinstwasser zu verdünnen und speichern in 5 mL Aliquots in 10 mL dickwandigen Polyethylen Fläschchen zur Verbesserung der Sicherheit.
   3. Dekontaminieren Sie Pipettenspitzen und Stauseen, die mit HFA und jede übrig gebliebene Flüssigkeit HFA mit 2,5 % Kalzium Gluconat vor der Entsorgung in den gefährlichen Abfällen Strom in Berührung gekommen sind.
2. Für jede SiRNA-Bibliothek-Platte untersucht, bereiten die 0.0036 % HFA mittlere Lösung durch Zugabe von 1 % 288 µL HFA, 80 mL vorgewärmten HCORT Medium in einer 150 mL Flasche.
   1. Schwenken Sie die Flasche und inkubieren Sie die verdünnte HFA in einem Inkubator 37 ° C in der chemischen Dampfhaube für 10 min.
3. Mischen Sie die HFA mittlere Lösung wieder durch Schütteln der Flaschenhals und die HFA mittlere Lösung mit einem Reagenz Reservoir auf einer Warmhalteplatte.
4. Führen Sie die Belichtung mit zwei Techniker arbeiten im Tandem.
   1. Den Techniker auf die richtige aspirat 100 µL aus jedem der inneren Brunnen einer Zelle Platte mit einem 12-Kanal-Pipette und übergeben Sie die Platte an dem Techniker auf der linken Seite.
   2. Haben Sie die Techniker auf der linken Seite 100 µL pro Bohrloch der HFA mittlere Lösung hinzufügen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 6.4.1 und 6.4.2 für alle Zellplatten, die Schlüpfzeit ausgesetzt werden.
   4. Auch wiederholen Sie die Schritte 6.4.1 und 6.4.2 für unbelichteten Steuerplatten, frisches HCORT Medium anstatt die HFA mittlere Lösung nutzen.
5. Legen Sie die Platten in den chemischen Rauch Haube Inkubator für 20 min und dann wieder in die Zelle Kultur Inkubator.
6. Wiederholen Sie die Positivkontrolle Zusatz Schritt (Schritte 5.1 bis 5.5) wie zuvor gezeigt, sobald alle Platten wurden ausgesetzt und kehrte in die Zelle-Kultur-Inkubator.

(7) CP Exposition von kultivierten Zellen

Achtung: CP ist akut giftig und reizend.

1. Operationen Sie alle Exposition gegenüber chemischen Stoffen in einem chemischen Abzug Doppel Nitril-Handschuhe, ein Laborkittel, Einweg-Polyäthylen Hülse Protektoren und Schutzbrille tragen.
   1. CP zu erwerben.
   2. CP auf 5 % DMSO zu verdünnen und speichern in 10 mL Aliquots in 10 mL Funkeln Fläschchen zur Verbesserung der Sicherheit.
   3. Dekontaminieren Sie Pipettenspitzen und Stauseen, die mit CP und jede übrig gebliebene Flüssigkeit CP mit 2,5 % Natrium Bisulfit vor der Entsorgung in den gefährlichen Abfällen Strom in Berührung gekommen sind.
2. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen des vorgewärmten HCORT Medium mit 1 x Pen/Strep und vorgewärmten PBS für die Anzahl der Platten ausgesetzt sein.
3. Fügen Sie für jede Top Platte eingestellt oder Bodenplatte, 8.04 µL 5 % CP in DMSO, eine 50 mL-aliquoten vorgewärmten HCORT Medium und eine CP-Endkonzentration von 0,0008 % gut mischen. Röhrchen Sie das fest und inkubieren Sie die Lösung in einem Inkubator 37 ° C in der chemischen Dampfhaube für 1 h.
   1. Zeit die Ergänzung des CP 50 mL Aliquote des Mediums, so dass jeder Top Platte eingestellt ausgesetzt und untere Platte gesetzt erhält Schlüpfzeit genau 1 h nach CP 50 mL Aliquot Medium hinzugefügt wurde.
4. Entfernen Sie eine Top Platte eingestellt und 1 unbelichteten Steuerplatte aus der Zelle Kultur Inkubator und legen Sie sie in der chemischen Dampfhaube nahe dem Ende der Inkubationszeit.
5. Mischen Sie die CP-Lösung durch das Rohr zu invertieren und dann mit einem Reagenz Reservoir am Ende der Inkubationszeit 1 h Dekantieren.
6. Führen Sie die Belichtung mit zwei Techniker arbeiten im Tandem.
   1. Den Techniker auf die richtige aspirat 100 µL aus jedem der inneren Brunnen einer Zelle Platte mit einem 12-Kanal-Pipette und übergeben Sie die Platte an dem Techniker auf der linken Seite.
   2. Haben Sie die Techniker auf der linken Seite 100 µL pro Bohrloch der CP mittlere Lösung hinzufügen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 7.6.1 und 7.6.2 für alle Zellplatten des Top-Platte-Sets Schlüpfzeit ausgesetzt werden.
   4. Wiederholen Sie auch 7.6.1 und 7.6.2 für unbelichteten Steuerplatten, frisches HCORT Medium anstatt die CP mittlere Lösung nutzen.
7. Legen Sie die Platten in einem Inkubator 37 ° C in der chemischen Dampfhaube für 10 Minuten.
8. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen an PBS und HCORT Medium mit 1 x Pen/Strep Reagenz Stauseen am Ende der Inkubationszeit 10 min.
9. Entfernen Sie die CP-Lösung aus Zellplatten mit einem 12-Kanal-Pipette und ersetzen sie mit 100 µL pro Bohrloch von PBS am Ende der Inkubationszeit 10 min.
10. Sofort die PBS aus Zellplatten entfernen und ersetzen Sie es mit 100 µL pro Bohrloch des HCORT Mediums mit 1 x Pen/Strep.
11. Auch wiederholen Sie Schritte 7.9 und 7.10 für die unbelichteten Steuerplatten.
12. Eine Standardzelle Kultur Inkubator die Zellplatten zurückzukehren.
13. Wiederholen Sie die Schritte 7.3, 7,12 für die untere Platte gesetzt.
14. Wiederholen Sie die Positivkontrolle Zusatz Schritt (Schritte 5.1 bis 5.5) wie zuvor beschrieben, sobald alle Platten wurden ausgesetzt und kehrte in die Zelle-Kultur-Inkubator.

(8) Probe Sammlung und Zelle Lebensfähigkeit Assay

1. Vierundzwanzig Stunden nach der Exposition, bereiten Sie eine Lösung von 0,5 mg/mL MTT Substrat in PBS mit 10 g/L Glukose und warm bis 37 ° C²¹. Bereiten Sie 10 mL Substrat für jede Platte, untersucht werden.
2. Fügen Sie für die Anzahl der Platten, untersucht werden ein ausreichendes Volumen an MTT Substratlösung zu einem Reservoir auf einem automatisierten liquid Handler hinzu.
3. Einsatz der automatisierten liquidere Handler Probe sammeln und MTT-Substrat mit einer 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte. Vorkonfigurieren Sie Tip-Boxen Bewältigung nur jene Brunnen, untersucht werden.
   1. Aspirat 95 µL des Mediums aus dem inneren 60 Brunnen der Zellplatte und Kaution 42,5 µL in jeder der beiden 384-Well Storage Platten.
   2. Sofort die Zellplatten 100 µL pro Bohrloch der MTT-Substrat-Lösung hinzu, und inkubieren sie bei 37 ° C in einer Zelle-Kultur-Inkubator für 1,5 h.
   3. Füllen Sie den Behälter mit MTT Substratlösung nach Bedarf.
4. Inkubieren Sie die Zelle-Platten bei 37 ° C in einer Zelle Kultur Inkubator für 1 h.
5. 384-Well Storage Platten versiegeln und bei-80 ° C für spätere Analysen zu speichern.
6. Wiederholen Sie die Schritte 8,3 und 8,5 für alle oberen und unteren Platte-Sets und die damit verbundenen unbelichteten Steuerelemente.
   1. Wiederverwenden Sie Tipps auf Wiederholungen, wenn gewünscht, aber waschen Sie sie beim Hinzufügen von MTT Substratlösung und beim Umschalten zwischen Platte setzt.
7. Fügen Sie nach 1 h Inkubation ein ausreichendes Volumen an DMSO zu einem Reservoir auf einem automatisierten liquid Handler hinzu.
8. Einsatz der automatisierten liquidere Handler DMSO hinzufügen und verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
   1. Aspirieren Sie 100 µL aus jedem der inneren Brunnen der Zelle Platten und entsorgen Sie MTT-Substratlösung in einen Abfall Behälter.
      1. Entleeren Sie Abwasser Behälter, je nach Bedarf.
   2. Überlagern Sie jedes gut mit 100 µL DMSO.
      1. Füllen Sie das DMSO Reservoir nach Bedarf.
9. Schütteln Sie die Platten auf einer Platte Shaker für 3 min.
10. Messen Sie Extinktion bei 570 und 690 nm mit einer Platte Spektralphotometer.
11. Subtrahieren Sie den Hintergrund und berechnen Sie die Zellviabilität % durch Division der exponierten Absorption Werte durch die unbelichteten Steuerelemente zu. Verwenden Sie die durchschnittliche unbelichteten negative Pool SiRNA-Steuerelement, um % Zellviabilität bei allen Zielen berechnen.

(9) Maßnahme IL-8-Konzentration in der Zelle Kultur Überstände

1. Messen die Konzentration von IL-8 in der Zelle Kultur Überstände mit einem Nein waschen Bead-based Assays laut des Herstellers Anweisungen²². Erstellen Sie eine Assay Platte Layout um Proben und Standardkurve unterzubringen.
2. Entfernen Sie die 384-Well Storage Platten aus dem-80 ° C Gefrierschrank, bei Raumtemperatur tauen Sie auf und kurz Zentrifugieren Sie die Platten um die Probe in der Unterseite der Brunnen zu sammeln.
3. Stellen Sie für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden ein ausreichendes Volumen an Anti-IL-8 Akzeptor Perlen und biotinylierte Anti-IL-8 Antikörper in testpuffer im Bausatz enthalten. Verwenden Sie das Verhältnis von 50 µL Anti-IL8 Akzeptor Perlen und 50 µL biotinylierte Antikörper Anti-IL8 9,9 mL testpuffer.
   1. Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette Perle/Antikörper Mischung an einer schwarzen 384-Well-Lagerung-Platte.
      1. Die Brunnen, die für den Gebrauch für Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout fügen Sie Akzeptor Perle/Antikörper hinzu.
      2. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen pro Bohrloch für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
4. Rekonstruieren von IL-8 Standard 1000 Pg/ml mit Zellkulturmedium mit 354 µM NaCl. Machen Sie ein ausreichendes Volumen für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
5. Stellen Sie acht zweifache Verdünnungsreihen der Standardkurve.
6. Fügen Sie der Standardkurve in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen einer schwarzen 384-Well Storage Platte gemäß der Assay-Platte-Layout. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen pro Bohrloch für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
   1. In ähnlicher Weise hinzufügen Zellkulturmedium mit 354 µM NaCl mit IL-8 für Hintergrundmessung.
7. Verwenden Sie einen automatisierte liquiden Handler, den Test durchzuführen. Verwenden Sie vorkonfigurierte Tipp Kontrollkästchen, um nur die Brunnen der Assay-Platte-Layout bezeichneten Adresse. Verwenden Sie ein 50 µL/s pipettieren Geschwindigkeit für alle Schritte.
   1. Übertragen Sie 8 µL Akzeptor-Perle-Antikörper-Mischung in die Vertiefungen der weißen flachen 384-Well gut Assay Platten.
      1. Fügen Sie nur in die Vertiefungen für Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout bezeichnet.
   2. Übertragen Sie in die entsprechenden Vertiefungen der flachen gut Assay Platten gemäß der Assay-Platte-Layout 2 µL der Standardkurve.
   3. Zubereiten einer 3,54 M NaCl-Lösung und ein ausreichendes Volumen für die Anzahl der Platten, flachen Stausee auf der automatisierten liquid Handler untersucht werden.
   4. Passen Sie die Salzkonzentration der Proben der Standardkurve angleichen von 4,5 µL NaCl-Lösung auf die Proben in den schwarzen 384-Well Storage Platten übertragen.
   5. Mischen der Proben dreimal mit einem Mischpult Volumen von 30 µL und Transfer 2 µL der Proben zu den weißen flachen assay auch Platten nach der Assay-Platte-Layout.
      1. Ändern Sie Tipps zwischen Musterplatten.
   6. 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Stellen Sie für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden ein ausreichendes Volumen an Akzeptor Perlen in testpuffer. Verwenden Sie das Verhältnis von 200 µL des sekundären Akzeptor Perlen auf 12,3 mL testpuffer.
   8. Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette sekundäre Perlen mit einer schwarzen 384-Well-Lagerung-Platte.
      1. Fügen Sie sekundäre Perlen in die Vertiefungen für den Gebrauch für Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout hinzu.
      2. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen pro Bohrloch für die Anzahl der Assay-Platten ausgeführt werden.
   9. Mit der automatisierten liquid Handler übertragen Sie 10 µL der sekundären Perlen in die Vertiefungen der weißen flachen 384-Well gut Assay Platten.
      1. Fügen Sie nur in die Vertiefungen, die Proben und Standardkurve nach Assay Platte Layout erhalten und waschen Sie die Spitzen zwischen jeder Platte.
   10. Noch eine Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Der Assay Platten mit klar Platte Dichtungen und Scannen Sie mit einem Teller Reader kompatibel mit dem Assay zu versiegeln. Verwenden Sie 0,2 mm Abstand zwischen Platte und Detektor, 180 ms Erregung Zeit und 550 ms Messzeit für den Scan.
9. Importieren Sie die raw-Daten aus der IL-8-Assays in eine Tabellenkalkulation.
10. Verwenden Sie automatische Kurvenanpassung für die Standardkurve von IL-8-Assays, und dann konvertieren Sie die raw-Daten in Pg/mL für jede Probe.

Ergebnisse

Exposition Methodenentwicklung

Wir verfeinert und die Eignung der menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für HTS Studien ausgewertet. SV40-HCEC waren mit dem SV-40 große T Antigen verewigt und waren ein Geschenk von Dhanajay Pal²³. Gab es zu viele Variablen in Exposition Methodik Entwicklung prägnant hierin präsentieren erforscht, und so, nur einige Beispiele für Ergeb...

Diskussion

Hier beschreiben wir unsere Methoden und Ergebnisse über die Entwicklung des einen hohen Durchsatz Hornhaut Epithelzelle screening-Modell für die Untersuchung von HF und CP Verletzungen. Außerdem präsentieren wir die Ergebnisse aus dem primären SiRNA-Bildschirm für HF-Verletzungen. Es gab viele Herausforderungen an die Entwicklung der HTS-Modelle für die Untersuchung von TIC Verletzungen. Methoden, die wir in der Literatur im Zusammenhang mit der Studie von HF, HFA oder CP in zellmodellen Kultur finden konnte ware...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting