High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Riepilogo

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

Abstract

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale come nessun terapeutica specifica esiste per il trattamento di queste lesioni. Negli sforzi per sviluppare trattamenti e terapie di cura per l'esposizione, può essere importante capire i meccanismi cellulari e molecolari di queste lesioni. Proponiamo che l'utilizzo di screening inibitorio piccoli RNA (siRNA) su vasta scala può essere uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. siRNA sono doppio incagliati molecole RNA che sono 19-25 nucleotidi lunghi e utilizzano il percorso per degradare mRNA il silenziamento genico post-trascrizionale che hanno omologia al siRNA. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Lo sviluppo e la validazione di modelli di esposizione in vitro e metodiche per l'alto throughput screening (HTS) di fluoruro di idrogeno (HF) e cloropicrina-(CP) indotto ferita oculare sono presentati in questo articolo. Sebbene abbiamo scelto queste due sostanze tossiche, i nostri metodi sono applicabili allo studio di altre sostanze tossiche con lievi modifiche al protocollo esposizione tossico. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e la produzione di IL-8 sono stati selezionati come endpoint nel protocollo di screening. Diverse sfide associate con lo sviluppo dell'esposizione tossico e metodi di coltura cellulare adatti per studi HTS sono presentati. La creazione di modelli HTS per queste sostanze tossiche consente ulteriori studi per capire meglio il meccanismo della ferita e alla schermata per potenziali terapie per ferita oculare chimica.

Introduzione

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Purtroppo, trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale solo come terapie specifiche non esistono per trattare queste lesioni. L'attuale strategia di trattamento è aspecifica e comprende principalmente trattamenti topici terapeutici come lubrificanti, antibiotici, e cycloplegics seguita da antinfiammatori (ad es., steroidi) una volta la cornea ha re-epithelialized^{1 ,2}. Nonostante il migliore trattamento terapeutico opzioni correnti disponibili, prognosi a lungo termine è generalmente scarsa a causa di appannamento corneale progressiva e neovascolarizzazione^2,3.

Modelli animali sono stati utilizzati tradizionalmente per tossicità chimica di studiare e comprendere i meccanismi della ferita. Tuttavia, gli studi sugli animali sono lunghe e costose. Ci sono anche gli sforzi per ridurre la sperimentazione animale. Ad esempio, la normativa REACH (CE 1907/2006) dell'Unione europea ha disposizioni destinate a ridurre la sperimentazione. Le disposizioni sono un requisito che aziende condividono dati al fine di evitare la sperimentazione animale e ottenere l'approvazione dall'Agenzia chimica europea prima di eseguire i test proposti sugli animali. Ai sensi delle disposizioni del regolamento REACH, sperimentazione animale dovrebbe essere l'ultima risorsa. C'è anche il regolamento Cosmetici europeo (CE 1223/2009) che gradualmente la sperimentazione dei cosmetici negli animali. Quando vengono effettuati studi sull'animale, sono guidati dai principi di 3R (raffinatezza, riduzione e sostituzione), che forniscono un quadro per eseguire ricerca animale più umana, riducendo il numero di animali utilizzati e l'utilizzo delle alternative non animali ove possibile. Per questi motivi, il campo della tossicologia ha cercato di adottare saggi in vitro che possono fornire la comprensione nei meccanismi molecolari di tossicità e possono essere fatto in maggiore velocità di trasmissione⁴. Si tratta di un approccio funzionale tossicologia cui sostanze tossiche sono definite dalla loro funzione, piuttosto che esclusivamente da loro chimica. Compiuto un passo in avanti, funzionale toxicogenomics cercano di capire il ruolo che specifici geni svolgono negli effetti di sostanze tossiche⁵. Con l'applicazione della tecnologia siRNA, schermi per studiare la funzione del gene nelle risposte molecolari e cellulari alle sostanze tossiche possono essere fatto in alto throughput. siRNA sono molecole di RNA incagliati doppi che sono 19-25 nucleotidi lunghi che sfruttano la presente in tutte le cellule di mammiferi⁶via post silenziamento trascrizionale del gene. Questi sono sinteticamente fatto e progettati per indirizzare un gene specifico. Quando introdotti in una cella, viene elaborato il siRNA e un filo, il filo guida, viene caricato il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC). Gli siRNA dirige il RISC ad una regione complementare in una molecola di mRNA, e il RISC degrada il mRNA. Questo comporta la riduzione dell'espressione del gene specifico. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Tale approccio è stato utilizzato per capire meglio i meccanismi di suscettibilità di ricina e l'induzione di AHR-dipendente di CYP1A1^7,8.

L'elenco di valutazione di rischio del terrorismo chimico (CTRA) e gli elenchi di prodotti chimici industriali tossici (TIC) sono riportati in dettaglio selezionare prodotti chimici basati sulla loro tossicità e il potenziale per essere rilasciato nel corso di un terrorista, guerra o incidente industriale evento⁹. Stiamo applicando un throughput elevato di siRNA (HTS) toxicogenomic metodo per lo studio delle sostanze tossiche di elenco CTRA, che sono stati identificati per essere ad alto rischio di uso in un atto terroristico della selezione. Tossicologia tradizionale cerca di comprendere gli effetti avversi che hanno sostanze chimiche sugli organismi viventi; Tuttavia, abbiamo un ulteriore desiderio di comprendere i meccanismi della ferita allo scopo di informare lo sviluppo di terapeutica e approcci terapeutici e possibilmente, per scoprire le molecole che possono essere mirate per lo sviluppo terapeutico. Questo sforzo in un certo senso può essere considerato analogo all'uso di screening su vasta scala siRNA e saggi di cellulare basato nella droga scoperta processo¹⁰. Una differenza principale sarebbe che l'individuazione della droga tipicamente cerca una destinazione singolare per la scoperta terapeutica, considerando che il nostro approccio è alquanto improbabile che ci sarebbe una destinazione singolare con alto valore terapeutico per il trattamento dell'esposizione tossico. Prevediamo che qualsiasi paradigma di trattamento efficace per l'esposizione tossico richiederebbe un approccio multi-angolare per raggiungere alto valore terapeutico, e toxicogenomic dati vitale possono informare un paradigma di trattamento efficace.

Automazione del laboratorio porta metodologia throughput elevato ai laboratori fuori le industrie farmaceutiche o biotecnologiche. Gli studi in vitro al nostro Istituto sono state storicamente le analisi tradizionali che sono di bassa velocità effettiva^11,12,13. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha eseguito la transizione per l'utilizzo della robotica da banco per eseguire screening su vasta scala siRNA. Qui, presentiamo la raffinatezza dei modelli cellulari oculare e lo sviluppo in vitro di metodi di esposizione per acido fluoridrico (HF) e cloropicrina (CP) adatto per screening su vasta scala siRNA. Il nostro obiettivo è quello di identificare molecole che regolano la lesione cellulare in risposta a queste sostanze tossiche. Gli obiettivi della biblioteca siRNA che abbiamo selezionato sono recettori accoppiati a proteine G, proteinchinasi, proteasi, fosfatasi, canali ionici e altri potenzialmente bersagli. HF e CP sono stati selezionati per lo studio incrociando CTRA elenco agenti con i rapporti ToxNet degli incidenti industriali per trovare quelli che presentano il maggior rischio di lesioni oculari tramite vapore esposizione^9,14. CP (formula chimica Cl₃CNO₂, numero CAS 76-06-2) è stato originariamente utilizzato come un gas lacrimogeni in WWI¹⁵. Attualmente è stato utilizzato come un fumigante agricolo e funzioni come un insetticida, fungicida e nematocida¹⁶. Acido fluoridrico (HF) è utilizzato nei processi tra cui di alchilazione in raffinerie di petrolio e fluorurazione elettrochimica di composti organici¹⁷. HF (formula chimica HF, numero CAS 62778-11-4) è un gas, ma nella sua forma acquosa è l'acido fluoridrico (HFA, CAS 7664-39-3 di numero). Pertanto, abbiamo scelto di utilizzare HFA nella nostra cella in modelli di esposizione. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e il marcatore infiammatorio IL-8 sono stati selezionati come endpoint perché gli obiettivi che sono coinvolti nella lesione cellulare dovrebbero riflettersi nella morte delle cellule e la risposta infiammatoria. In particolare, se una destinazione dovesse svolgere un ruolo protettivo nell'esposizione tossico, morte delle cellule e/o la produzione di citochine infiammatorie dovrebbe aumentare quando l'espressione di destinazione è inibita da siRNA. Il contrario sarebbe vero per gli obiettivi che giocano un ruolo negativo. Inoltre, l'infiammazione cronica sembra svolgere un ruolo nella patologia della cornea dopo l'esposizione e l'intervento nelle vie di morte delle cellule può migliorare il risultato clinico^2,18.

Protocollo

1. cella cultura manutenzione

1. Crescere la linea cellulare SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO₂e 90% di umidità in DMEM F-12 con 15% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, 10 µ g/L fattore di crescita (EGF) e di 5 mg/L insulina.
2. Passaggio della linea cellulare ogni 3-4 giorni (a seconda della densità di semina) per garantire che confluency mai supera l'80% durante la manutenzione di cultura.
3. Staccare le cellule da boccette utilizzando una soluzione di distacco (14 mL di soluzione per ogni boccetta di² cm 150) e l'incubazione a 37 ° C per non più di 8 min.
4. Neutralizzare la soluzione di distacco con un uguale volume di terreno di coltura cellulare e agglomerare le cellule in provette coniche da 50 mL mediante centrifugazione per 7 min a 160 x g.
5. Risospendere il pellet cellulare in mezzo (20 mL per ogni boccetta di² 150 cm).
6. Contare le celle con un contatore di cellule palmare automatizzati e semi in nuove boccette con una densità che consentirà loro di crescere per 3 o 4 giorni senza superare 80% confluency.

2. piastra cellule per la sperimentazione

1. Verifica boccette di SV40-HCECs da microscopia chiara di contrasto di fase per garantire tale confluenza è minore di 80% e per valutare la salute generale delle cellule.
2. Scollegare, a pellet, risospendere e contare SV40-HCECs da boccette come descritto ai punti da 1.3 a 1.6 di mantenimento di coltura delle cellule. Usare mezzo di SV40-HCEC contenenti idrocortisone 0,5 µ g/mL (media HCORT) per risospendere le cellule.
3. In una bottiglia di media USA e getta, preparare una sospensione di SV40-HCECs a 17.857 cellule/mL nel mezzo di HCORT pre-riscaldato.
   1. Preparare un volume sufficiente di sospensione cellulare per il numero di piastre per essere seminato.
   2. Semi di un minimo di 14 x 96 pozzetti con cellule per ogni piatto di biblioteca di siRNA essere studiato.
4. Agitare il flacone per sospendere le cellule uniformemente, versare un sufficiente volume della sospensione cellulare in un serbatoio sul nido agitatore orbitale di un gestore di liquido automatizzato e conservare il flacone contenente la sospensione cellulare su un 37 ° C piastra di riscaldamento durante la placcatura di cella processo.
5. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per aggiungere celle a piastre ad una densità di 1000 cellule per pozzetto (5000 cellule/cm²) in 70 µ l di terreno per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
   1. Eseguire l'agitatore orbitale a 100 rpm costantemente durante il processo di seeding.
   2. Mescolare la sospensione cellulare tre volte (140 µ l di miscela) utilizzando il gestore di liquido automatizzato.
   3. 140 µ l della sospensione delle cellule di aspirare e dispensare 70 µ l in ogni pozzetto di due piastre per colture cellulari.
   4. Ripetere i passaggi 2.5.3 e 2.5.4 per tutte le piastre hanno seminate con le cellule.
   5. Riempire il serbatoio di sospensioni di cellule come necessario durante il processo di seeding.
6. Dopo le piastre hanno seminate, rimuoverli dal gestore liquido automatizzato e li Incubare 30 min a temperatura ambiente prima di trasferirli in un'incubatrice di cultura cellulare.
7. Valutare la densità delle cellule di ogni pozzo per ogni piatto la mattina seguente, utilizzando un sistema automatizzato di imaging che è ospitato in un'incubatrice di coltura cellulare ed esclude eventuali piastre dallo studio che hanno pozzi interni che non sono tra 15% e 22% confluenti.

3. transfect cellule con siRNA

1. Acquisire piastre libreria siRNA dal fornitore pre-configurato per contenere 80 siRNA obiettivi per piastra (vedere Figura 4), con colonne 1 e 12 lasciato vuoto.
2. Ricostituire la piastra di biblioteca di siRNA con siRNA buffer per una concentrazione finale di 2 pmol / µ l per ogni pozzetto di siRNA secondo istruzioni^{19 del produttore}.
3. Transfect le cellule 24 h dopo la semina con 4 pmol/pozzetto di siRNA e 0,3 µ l/pozzetto di reagente di transfezione. Eseguire tutti i passaggi secondo il protocollo del produttore del reagente di transfezione (Vedi Figura 4 per il layout di piastra)²⁰.
   1. Eseguire tutte le transfezioni utilizzando un gestore di liquido automatizzato e utilizzare un 25 µ l/s di velocità di pipettaggio per tutti i passaggi. Utilizzare scatole di tip pre-configurato per affrontare solo i pozzi che saranno trasfettati.
   2. Utilizzare la parte superiore metà della piastra biblioteca a transfect una serie di sei piatti replicare indicata come il "Top Plate Set" (sei repliche per siRNA, n = 6).
   3. Utilizzare il fondo metà della piastra biblioteca a transfect un diverso insieme di sei piatti replicare indicata come il "piatto fondo Set" (sei repliche per siRNA, n = 6).
   4. Utilizzare il termine "Full Plate Set" per descrivere il 12 piastre di cellule che sono state trasfettate con siRNA biblioteca.
   5. Transfect pozzi B2-B6 di tutte le piastre nel Set completo di piastra con piscina negativo siRNA dopo tutti i set di piastra superiore e inferiore sono stati trasfettati con siRNA biblioteca.
   6. Anche transfect pozzi B2-B6 di un altro due piastre, che non ricevono biblioteca siRNA e serviranno come comandi non esposti (uno per il set piastra superiore) e uno per il set di piastra di fondo, con piscina negativo siRNA.
4. Incubare tutte le placche delle celle in un'incubatrice di coltura cellulare per 4 ore dopo aver aggiunto tutte le miscele di transfezione e mix di gentle toccando ogni ora.
5. Utilizzare un gestore automatico liquido per lavare tutti i pozzetti delle piastre due volte con il mezzo di HCORT pre-riscaldato diluito 1:5 in PBS. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
   1. 100 µ l di ciascun pozzetto di aspirare e scartare che in un serbatoio dei rifiuti.
   2. Aggiungere ad ogni ben 100 µ l/pozzetto preriscaldata medio HCORT diluito 1:5 in tampone PBS che è contenuta in un serbatoio diverso a un volume sufficiente di per il numero di piatti.
   3. Ripetere i passaggi 3.5.1 e 3.5.2 per ogni piatto.
      1. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo le necessità.
      2. Ricarica il serbatoio con il mezzo di HCORT diluito 1:5 in PBS come necessario.
   4. 100 µ l di ciascun pozzetto di aspirare e scartare che nel serbatoio dei rifiuti.
6. Refeed tutti i pozzetti della piastra con 100 µ l/pozzetto pre-riscaldato HCORT terreno, che è contenuta in un serbatoio diverso a un volume sufficiente di mezzo per il numero di piatti.
   1. Riempire il serbatoio con medie come necessario.
7. Utilizzare pozzetti C2-C6 di tutte le piastre come controlli non trasfettate.
8. Tenere pozzi B7-B11 e C7-C11 di tutte le piastre non trasfettate per essere utilizzati come controlli droga e veicolo per esposizione tossico.

4. refeed le cellule il seguente giorno

1. Utilizzare un gestore di liquido automatizzato per refeed tutti i pozzetti delle piastre. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
   1. 100 µ l di ciascun pozzetto di aspirare e scartare che in un serbatoio dei rifiuti.
   2. Ogni pila bene con 100 µ l/pozzetto preriscaldata mezzo HCORT che è contenuta in un serbatoio diverso e ha un volume sufficiente di mezzo per il numero di piastre per essere refed.
   3. Ripetere i passaggi 4.1.1 e 4.1.2 come bisogno di refeed tutte le placche delle celle.
      1. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo le necessità.
      2. Riempire il serbatoio con medie come necessario.

5. controllo positivo aggiunta

1. Due giorni dopo trasfezione e due ore prima dell'esposizione, preparare una soluzione di 62,5 µM del cardamonin di controllo positivo in mezzo HCORT per essere utilizzata per esposizioni HFA e aggiungere alla riga B di un serbatoio di diluizione 8-riga.
   1. Per l'esposizione di CP, preparare e utilizzare una soluzione di 25 µM di SKF 86002.
   2. Preparare un volume di controllo positivo e sufficiente per il numero di piastre per essere testato.
2. Preparare una soluzione di 0,625% di DMSO in mezzo HCORT (controllo del veicolo) e aggiungere alla riga C del serbatoio stesso.
   1. Per l'esposizione di CP, preparare e utilizzare una soluzione di 0,5% di DMSO.
   2. Preparare un volume di controllo del veicolo sufficiente per il numero di piastre per essere testato.
3. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per aggiungere i controlli positivo e veicolo ai pozzi B7-B11 e C7-C11 di ciascuna piastra di cella e utilizzare un 50 µ l/s pipettaggio velocità per tutti i passaggi. Utilizzare scatole di tip pre-configurato per affrontare solo i pozzi che riceveranno i controlli positivo e veicolo.
   1. Rimuovere 10 µ l di terreno da pozzi B7-B11 e C7-C11 di ciascuna piastra di cella e gettarlo in righe G e H del serbatoio 8-riga diluizione.
   2. Trasferire 10 µ l dei controlli positivi e veicolo di quei pozzi e mescolare 3 volte.
4. Riporre queste piastre di cella nell'incubatore.
5. Ripetere i passaggi 5.3 a 5.4 fino a quando tutte le piastre di cellulari hanno ricevuto positivi ed i comandi del veicolo.

6. HF esposizione delle cellule coltivate

Attenzione: HFA è acutamente tossici e corrosivi.

1. Eseguire tutte le operazioni di esposizione a sostanze chimiche in una cappa chimica indossando guanti in nitrile doppio, un camice da laboratorio, maniche di protezione in polietilene monouso e occhiali di sicurezza.
   1. Acquisire HFA come soluzione di 48%.
   2. Diluire HFA all'1% con acqua ultrapura e memorizzare in aliquote da 5 mL a 10 mL fiale di polietilene parete spessa per migliorare la sicurezza.
   3. Decontaminare i puntali per pipette e bacini che sono venuti in contatto con HFA e qualsiasi residuo liquido HFA con gluconato di calcio 2,5% prima dello smaltimento nel flusso di rifiuti pericolosi.
2. Per ogni piatto di library di siRNA sotto inchiesta, preparare una soluzione di media del HFA 0.0036% aggiungendo µ l 288 del 1% HFA a 80 mL di mezzo HCORT pre-riscaldato in un flacone da 150 mL.
   1. Agitare la bottiglia e incubare l'HFA diluito in un incubatore a 37 ° C nella cappa chimica per 10 min.
3. Mescolare la soluzione media HFA ancora agitando il flacone e aggiungere la soluzione di medie HFA in un serbatoio di reagente su una piastra scaldavivande.
4. Eseguire l'esposizione con due tecnici lavorano in tandem.
   1. Sono il tecnico sulla destra aspirato 100 µ l da ciascuno dei pozzetti di una piastra di cella utilizzando una pipetta a 12 canali interni e quindi passare la piastra al tecnico sulla sinistra.
   2. Sono il tecnico sulla sinistra aggiungere 100 µ l di soluzione media HFA.
   3. Ripetere i passaggi 6.4.1 e 6.4.2 per tutte le piastre di cellula che sono esposti a tossico.
   4. Anche ripetere passaggi 6.4.1 e 6.4.2 per piastre di controllo non esposti, utilizzando freschi HCORT mezzo invece la soluzione media HFA.
5. Posizionare le piastre nell'incubatore cappuccio chimico del vapore per 20 minuti e poi tornare per l'incubatrice della coltura cellulare.
6. Ripetere il passaggio di aggiunta di controllo positivo (passi 5.1-5.5) come precedentemente indicato una volta che tutti i piatti sono stati esposti e ritornò l'incubatrice della coltura cellulare.

7. CP esposizione delle cellule coltivate

Attenzione: CP è acutamente tossica e irritante.

1. Eseguire tutte le operazioni di esposizione a sostanze chimiche in una cappa chimica indossando guanti in nitrile doppio, un camice da laboratorio, maniche di protezione in polietilene monouso e occhiali di sicurezza.
   1. Acquisire CP.
   2. Diluire il CP al 5% in DMSO e memorizzare in aliquote di 10 mL a 10 mL fiale di scintillazione per migliorare la sicurezza.
   3. Decontaminare i puntali per pipette e bacini che sono venuti in contatto con CP e qualsiasi residuo liquido CP con bisolfito di sodio 2,5% prima dello smaltimento nel flusso di rifiuti pericolosi.
2. Preparare un volume sufficiente di pre-riscaldato mezzo HCORT contenente 1 x Pen/Strep e PBS preriscaldata per il numero di piastre di essere esposti.
3. Per ogni set Top Plate Set o piastra inferiore, aggiungere 8.04 µ l del 5% CP in DMSO ad un'aliquota di 50 mL di pre-riscaldato HCORT medio e mescolare bene per una concentrazione finale di CP di 0,0008%. Richiudere ermeticamente il tubo e incubare la soluzione in un incubatore a 37 ° C nella cappa chimica per 1 h.
   1. Ora l'aggiunta di CP per le aliquote di 50 mL di mezzo in modo che ciascuno esposti Top Plate Set e Bottom Plate Set riceve tossico esattamente 1 h dopo CP è stato aggiunto per l'aliquota di 50 mL di mezzo.
4. Togliere un Top Plate Set e 1 controllo non esposto l'incubatrice della coltura cellulare e metterli nella cappa chimica verso la fine del periodo d'incubazione.
5. Miscelare la soluzione CP capovolgendo la provetta e decantare quindi ad un serbatoio di reagente alla fine del periodo di incubazione di 1 h.
6. Eseguire l'esposizione con due tecnici lavorano in tandem.
   1. Sono il tecnico sulla destra aspirato 100 µ l da ciascuno dei pozzetti di una piastra di cella utilizzando una pipetta a 12 canali interni e quindi passare la piastra al tecnico sulla sinistra.
   2. Sono il tecnico sulla sinistra aggiungere 100 µ l di soluzione media CP.
   3. Ripetere i passaggi 7.6.1 e 7.6.2 per tutte le piastre di cella del Top Plate Set di essere esposti alla sostanza tossica.
   4. Anche ripetere passaggi 7.6.1 e 7.6.2 per piastre di controllo non esposti, utilizzando freschi HCORT mezzo invece la soluzione media CP.
7. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C nella cappa chimica per 10 min.
8. Aggiungere un volume sufficiente di PBS e HCORT mezzo contenente 1 x Pen/Strep a serbatoi di reagente vicino alla fine del periodo di incubazione di 10 min.
9. Rimuovere la soluzione di CP da piastre di cella utilizzando una pipetta a 12 canali e sostituirlo con 100 µ l di PBS alla fine del periodo di incubazione di 10 min.
10. Immediatamente rimuovere il PBS placche in cella e sostituirlo con 100 µ l di terreno di HCORT contenente 1 x Pen/Strep.
11. Anche ripetere passaggi 7.9 e 7.10 per le piastre di controllo non esposti.
12. Restituire le piastre di cella per un'incubatrice di cultura cellulare standard.
13. Ripetere i passaggi da 7,3 a 7.12 per il Bottom Plate Set.
14. Ripetere il passaggio di aggiunta del controllo positivo (passi 5.1-5.5) come precedentemente descritto una volta che tutti i piatti sono stati esposti e ritornò l'incubatrice della coltura cellulare.

8. raccolta e analisi di attuabilità delle cellule del campione

1. Ventiquattro ore dopo l'esposizione, preparare una soluzione di substrato MTT di 0,5 mg/mL in PBS contenente 10 g/L glucosio e riscaldare a 37 ° C²¹. Preparare 10 mL di substrato per ogni piatto deve essere analizzato.
2. Per il numero di piastre deve essere analizzato, è necessario aggiungere un volume sufficiente di soluzione di substrato MTT ad un serbatoio su un gestore di liquido automatizzato.
3. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per raccogliere il campione e aggiungere substrato MTT utilizzando un 50 µ l/s pipettaggio velocità per tutti i passaggi. Preconfigurare scatole di tip per risolvere solo quei pozzi deve essere analizzato.
   1. Mezzo di aspirato 95 µ l of da interni 60 pozzetti della piastra e deposito 42,5 µ l in ciascuna delle due piastre 384 pozzetti deposito.
   2. Immediatamente aggiungere 100 µ l di soluzione substrato MTT per le piastre di cella e li Incubare a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per 1,5 h.
   3. Riempire il serbatoio con la soluzione di substrato MTT come necessario.
4. Incubare le piastre di cella a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare per 1 h.
5. Sigillare le piastre 384 pozzetti deposito e conservarli a-80 ° C per la successiva analisi.
6. Ripetere i passaggi da 8,3 a 8,5 per tutti i set di piastra superiore e inferiore e i controlli associati non esposti.
   1. Riutilizzare i suggerimenti tra repliche se lo si desidera, ma lavarli quando si aggiunge la soluzione di substrato MTT e commutazione tra piastra quando imposta.
7. Dopo l'incubazione di 1h, aggiungere un volume sufficiente di DMSO per un serbatoio su un gestore di liquido automatizzato.
8. Utilizzare il gestore di liquido automatizzato per aggiungere DMSO e utilizzare un 50 µ l/s pipettaggio velocità per tutti i passaggi.
   1. 100 µ l da ciascuno dei pozzetti delle piastre cella interni di aspirare e scartare la soluzione di substrato MTT in un serbatoio dei rifiuti.
      1. Svuotare il serbatoio dei rifiuti secondo le necessità.
   2. Sovrapposizione di ciascun pozzetto con 100 µ l DMSO.
      1. Riempire il serbatoio di DMSO come necessario.
9. Agitare le piastre su un agitatore per piastre per 3 min.
10. Misurare l'assorbanza a 570 e 690 nm utilizzando uno spettrofotometro di piastra.
11. Sottrarre lo sfondo e l'attuabilità delle cellule % viene calcolato dividendo i valori di assorbanza esposti dai controlli non esposti. Utilizzare il controllo di siRNA media piscina negativo non esposti per calcolare % vitalità cellulare per tutte le destinazioni.

9. IL misura-8 concentrazione nei surnatanti della cultura delle cellule

1. Misura la concentrazione di IL-8 nei surnatanti di cultura cellulare utilizzando un no lavare test basati su tallone secondo istruzioni^{22 del produttore}. Creare un layout di piastra di dosaggio per ospitare i campioni e la curva standard.
2. Rimuovere le piastre 384 pozzetti deposito dal congelatore-80 ° C, scongelare a temperatura ambiente e centrifugare brevemente le piastre per raccogliere il campione nel fondo dei pozzetti.
3. Per il numero di piastre di analisi da eseguire, è necessario effettuare un volume sufficiente di perline acceptor anti-IL-8 e anticorpo biotinilato anti-IL-8 nel tampone incluso nel kit. Utilizzare il rapporto di 50 µ l di perline acceptor anti-IL8 e 50 µ l di anticorpo anti-IL8 biotinilato a 9,9 mL di tampone del saggio.
   1. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere la miscela di tallone/anticorpo ad una piastra di stoccaggio nero 384 pozzetti.
      1. Aggiungere acceptor tallone/anticorpo ai pozzetti destinati all'uso per i campioni e la curva standard in base al layout di piastra di dosaggio.
      2. Aggiungere un volume sufficiente per pozzetto per il numero di piastre di analisi da eseguire.
4. Ricostituire IL-8 standard a 1000 pg/mL utilizzando il mezzo di coltura cellulare contenente 354 µM NaCl. Rendere un volume sufficiente per il numero di piastre di analisi da eseguire.
5. Fare otto diluizioni seriali della curva standard.
6. Aggiungere la curva standard in triplice copia relativi pozzetti di una piastra nera 384 pozzetti deposito in base al layout di piastra di dosaggio. Aggiungere un volume sufficiente per pozzetto per il numero di piastre di analisi da eseguire.
   1. Allo stesso modo, aggiungere mezzo di coltura cellulare contenente 354 µM NaCl con nessun IL-8 per la misura di sfondo.
7. Utilizzare un gestore di liquido automatizzato per eseguire l'analisi. Utilizzare scatole di tip pre-configurato per affrontare solo i pozzetti designati dal layout di piastra di dosaggio. Utilizzare un 50 µ l/s velocità di pipettaggio per tutti i passaggi.
   1. Trasferire 8 µ l della miscela della perla-anticorpo accettore ai pozzetti delle piastre 384 pozzetti poco profonde analisi ben bianco.
      1. Aggiungere solo i pozzi indicati per campioni e la curva standard in base al layout di piastra di dosaggio.
   2. Trasferire 2 µ l della curva standard relativi pozzetti delle piastre dosaggio ben poco profonde in base al layout di piastra di dosaggio.
   3. Preparare una soluzione di NaCl 3,54 M e aggiungere un volume sufficiente per il numero di piastre deve essere analizzato per un bacino poco profondo sul gestore del liquido automatizzato.
   4. Regolare la concentrazione di sale dei campioni in base a quella della curva standard trasferendo 4,5 µ l della soluzione NaCl ai campioni delle piastre di stoccaggio nero 384 pozzetti.
   5. Mescolare i campioni tre volte utilizzando un volume di miscelazione di 30 µ l, e trasferire 2 µ l dei campioni per il bianco poco profondo analisi ben piastre in base al layout di piastra di dosaggio.
      1. Cambiare suggerimenti tra piastre di campione.
   6. Incubare per 1 h al buio a temperatura ambiente.
   7. Per il numero di piastre di analisi da eseguire, è possibile rendere un volume sufficiente di perline acceptor nel tampone. Utilizzare il rapporto di 200 µ l di perline acceptor secondaria a 12,3 mL di tampone del saggio.
   8. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere perline secondarie ad una piastra di stoccaggio nero 384 pozzetti.
      1. Aggiungere perline secondarie ai pozzetti destinati all'uso per i campioni e la curva standard in base al layout di piastra di dosaggio.
      2. Aggiungere un volume sufficiente per pozzetto per il numero di piastre di analisi da eseguire.
   9. Utilizzando il gestore di liquido automatizzato, trasferire 10 µ l delle perline secondarie ai pozzetti delle piastre bianco dosaggio ben poco profonde 384 pozzetti.
      1. Aggiungere solo i pozzi che ha ricevuto i campioni e la curva standard secondo lo schema di dosaggio piastra e lavare le punte tra ogni piatto.
   10. Incubare per un'altra ora al buio a temperatura ambiente.
8. Sigillare il dosaggio piastre con chiaro guarnizioni piastra ed eseguire la scansione utilizzando un lettore di piastra compatibile con l'analisi. Utilizzare 0,2 mm di distanza tra piastra e rivelatore, 180 ms tempo di eccitazione e 550 ms tempo di misura per l'analisi.
9. Importare i dati grezzi dai dosaggi di IL-8 in un foglio di calcolo.
10. Utilizzare automatizzata curva raccordo per la curva standard dei saggi IL-8 e quindi convertire i dati grezzi in pg/mL per ogni campione.

Risultati

Sviluppo del metodo di esposizione

Abbiamo raffinato ed abbiamo valutato l'idoneità della linea cellulare epiteliale corneale umana SV40-HCEC per uso negli studi HTS. SV40-HCEC furono immortalati utilizzando il grande T antigene di SV-40 e sono stati un regalo da Dhanajay Pal²³. C'erano troppe variabili Esplorate nello sviluppo di metodologia di esposizione per presentare brevemente nel ...

Discussione

Qui descriviamo i nostri metodi e risultati sullo sviluppo di una cellula epiteliale di cornea elevato throughput screening modello per lo studio delle lesioni HF e CP. Inoltre presentiamo i risultati dalla schermata principale siRNA per lesioni HF. C'erano molte sfide per lo sviluppo di modelli HTS per lo studio delle lesioni TIC. Metodi che potremmo trovare nella letteratura relazionata allo studio di HF, HFA o CP in modelli di coltura cellulare erano di poco aiuto. Maggior parte dei studi in vitro sullo ione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting