Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène

Résumé

Criblage de RNA inhibitrice petit haut débit est un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. Nous présentons ci-après, le développement et la validation des modèles d’exposition et des méthodes pour le criblage à haut débit de fluorure d’hydrogène et chloropicrine-cornée épithéliales lésion induite.

Résumé

Lésion oculaire induite par la substance toxique est une véritable urgence oculaire parce que les produits chimiques sont susceptibles d’infliger rapidement des lésions tissulaires importants. Traitements pour lésion de la cornée induite par la substance toxique sont généralement favorables car aucune thérapeutique spécifique n’existe pour soigner ces blessures. Dans les efforts pour développer des traitements et thérapies pour s’occuper de l’exposition, il peut être important de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de ces blessures. Nous proposons que l’utilisation de criblage à ARN (siRNA) inhibiteur petit haut débit peut être un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. siARN sont double brin molécules d’ARN qui sont 19-25 nucléotides de long et utilisent le silençage voie pour dégrader les ARNm de gènes post-transcriptionnels ayant une homologie avec le siARN. La réduction résultant de l’expression du gène spécifique peut alors être étudiée dans les cellules exposées toxiques pour déterminer la fonction de ce gène dans la réponse cellulaire à la substance toxique. Le développement et la validation des modèles d’exposition in vitro et des méthodes pour le haut débit (HTS) de dépistage de fluorure d’hydrogène (HF) et chloropicrine-(CP) induites par des blessures oculaires sont présentés dans cet article. Même si nous avons choisi ces deux des substances toxiques, nos méthodes sont applicables à l’étude des autres substances toxiques avec des modifications mineures au protocole exposition toxique. L’antigène de T grand SV40 immortalisé ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines QUE SV40-HCEC a été sélectionné pour l’étude. La viabilité cellulaire et la production d’IL-8 ont été choisis comme points de terminaison dans le protocole de dépistage. Plusieurs défis associés au développement de l’exposition de produits toxique et les méthodes de culture cellulaire adaptés aux études HTS sont présentés. La création de modèles HTS pour ces substances toxiques permet pour d’autres études pour mieux comprendre le mécanisme de blessure et d’écran potentiel thérapeutique pour des lésions oculaires chimiques.

Introduction

Lésion oculaire induite par la substance toxique est une véritable urgence oculaire parce que les produits chimiques sont susceptibles d’infliger rapidement des lésions tissulaires importants. Malheureusement, les traitements pour lésion de la cornée induite par la substance toxique ne sont généralement favorables comme aucune thérapeutique spécifique n’existe pour soigner ces blessures. L’actuelle stratégie de traitement est non spécifique et comprend principalement des traitements thérapeutiques topiques tels que les lubrifiants, antibiotiques, et cycloplegics suivie d’anti-inflammatoires (par exemple, stéroïdes) une fois la cornée a re-epithelialized^{1 ,2}. Malgré les meilleur traitement thérapeutique options actuelles disponibles, le pronostic à long terme est généralement médiocre en raison d’une opacification cornéenne progressive et une néovascularisation^2,3.

Modèles animaux ont traditionnellement été utilisés pour étudier la toxicité chimique et comprendre les mécanismes des blessures. Cependant, les études chez l’animal sont fastidieux et coûteux. Il y a aussi des efforts pour réduire les essais sur les animaux. Par exemple, la législation REACH (EC 1907/2006) dans l’Union européenne a dispositions visant à réduire les essais sur les animaux. Les dispositions comprennent une exigence que compagnies de partagent des données afin d’éviter les animaux tests et obtenir l’approbation de l’Agence des produits chimiques avant d’effectuer les tests proposés sur les animaux. En vertu des dispositions du règlement REACH, l’expérimentation animale doit être un dernier recours. Il y a aussi la réglementation européenne de cosmétiques (ce 1223/2009) qui a éliminé les tests des cosmétiques chez les animaux. Lorsque des études chez l’animal sont effectués, ils sont guidés par les principes des 3R (raffinement, réduction et remplacement), qui établit un cadre pour effectuant des recherches sur les animaux plus humaine, ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés et en utilisant des solutions de rechange non animale Lorsque c’est possible. Pour ces raisons, le domaine de la toxicologie a cherché à adopter les dosages in vitro qui permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de toxicité et peuvent se faire à plus haut débit⁴. Il s’agit d’une approche fonctionnelle de toxicologie où les substances toxiques sont définis par leur fonction, et non uniquement par leur composition chimique. Fait un pas de plus, fonctionnelle toxicogénomique cherche à comprendre le rôle que jouent les gènes spécifiques dans les effets des substances toxiques,⁵. Avec l’application de la technologie de siARN, écrans pour étudier la fonction des gènes dans les réponses moléculaires et cellulaires aux substances toxiques peuvent être faits à haut débit. siARN sont double brin molécules d’ARN qui sont 19-25 nucléotides qui profiter du post transcriptionnelle de gènes silencieux parcours présent dans toutes les cellules de mammifères,⁶. Celles-ci sont synthétiquement faits et conçus pour cibler un gène spécifique. Lorsque introduit dans une cellule, le siARN est traitée et un brin, le brin de guide, est chargé dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC). Le siARN dirige le RISC à une région complémentaire dans une molécule d’ARNm et le RISC dégrade l’ARNm. Cela se traduit par la réduction de l’expression du gène spécifique. La réduction résultant de l’expression du gène spécifique peut alors être étudiée dans les cellules exposées toxiques pour déterminer la fonction de ce gène dans la réponse cellulaire à la substance toxique. Une telle approche a été utilisée afin de mieux comprendre les mécanismes de la susceptibilité de la ricine et l’induction de la procréation assistée dépendante du CYP1A1^7,8.

La liste de produits chimiques le terrorisme risque évaluation (CTRA) et les listes de produits chimiques industriels toxiques (TIC) ont détaillé certains produits chimiques basés sur leur toxicité et le potentiel d’être libéré au cours d’un terroriste, guerre ou accident industriel événement⁹. Nous appliquons un siARN criblage à haute approche toxicogénomiques (HTS) à l’étude de la CTRA liste des substances toxiques, qui ont été identifiés à risque élevé d’usage lors d’un incident terroriste. Toxicologie traditionnelle cherche à comprendre les effets indésirables ayant des produits chimiques sur les organismes vivants ; Cependant, nous avons un désir supplémentaire pour comprendre les mécanismes des blessures afin d’informer de la mise au point des thérapeutiques et des approches thérapeutiques et, éventuellement, à découvrir des molécules qui peuvent être ciblées pour le développement thérapeutique. Cet effort d’une certaine façon peut être considéré comme analogue à l’utilisation de siRNA criblage à haut débit et des essais sur des cellules de base dans la drogue découverte processus¹⁰. Une différence majeure est que la découverte de médicaments généralement cherche une cible du singulier pour la découverte thérapeutique alors que dans notre approche, il est assez improbable qu’il y aurait une cible du singulier à haute valeur thérapeutique pour le traitement de l’exposition toxique. Nous prévoyons que tout paradigme de traitement efficace pour l’exposition toxique nécessiterait une approche multi-facettes pour atteindre la haute valeur thérapeutique, et données toxicogénomiques peuvent informer vitale d’un paradigme de traitement efficace.

Benchtop automation apporte la méthodologie haut débit aux laboratoires en dehors de l’industrie pharmaceutique ou de biotechnologie. Les études in vitro à notre Institut ont été historiquement les dosages traditionnels qui sont de faible débit^11,12,13. En quelques années, notre laboratoire est passée à l’utilisation de la robotique de benchtop pour effectuer des siARN criblage à haut débit. Nous présentons ici, le raffinement des modèles de cellules oculaires et le développement de in vitro des méthodes d’exposition à l’acide fluorhydrique (HF) et de la chloropicrine (CP) adapté aux siARN criblage à haut débit. Notre objectif est d’identifier des molécules qui régulent la lésion cellulaire en réponse à ces substances toxiques. Les objectifs de la bibliothèque de siARN, que nous avons sélectionné incluent les récepteurs couplés aux protéines G, protéines kinases, phosphatases, protéases, canaux ioniques et autres cibles potentiellement thérapeutiques. HF et le CP ont été sélectionnés pour l’étude en renvoyant les agents liste CTRA avec les rapports ToxNet des accidents industriels pour trouver ceux qui présentent le plus grand risque de blessure oculaire par vapeur exposition^9,14. CP (formule chimique Cl₃ONC₂, numéro CAS 76-06-2) a été utilisé comme un gaz lacrymogène dans WWI¹⁵. Il est actuellement utilisé comme un fumigant agricole et fonctions comme un nématicide, fongicide et insecticide¹⁶. Fluorure d’hydrogène (HF) est utilisé dans les processus y compris alkylation dans les raffineries de pétrole et de la fluoration électrochimique de composés organiques¹⁷. HF (formule chimique HF, numéro CAS 62778-11-4) est un gaz, mais dans sa forme aqueuse est acide fluorhydrique (HFA numéro CAS 7664-39-3). Par conséquent, nous avons choisi d’utiliser HFA dans notre cellule en modèles d’exposition. L’antigène de T grand SV40 immortalisé ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines QUE SV40-HCEC a été sélectionné pour l’étude. La viabilité cellulaire et les marqueurs inflammatoires IL-8 ont été choisis comme points de terminaison, parce que les cibles qui sont impliqués dans la lésion cellulaire devraient être reflétées dans la mort cellulaire et la réponse inflammatoire. Plus précisément, si une cible devait jouer un rôle protecteur dans l’exposition toxique, mort cellulaire et/ou la production de cytokines inflammatoires devrait augmenter lorsque l’expression cible est inhibée par les siARN. L’inverse serait vrai pour les cibles qui jouent un rôle négatif. En outre, inflammation chronique semble jouer un rôle dans la pathologie de la cornée après que exposition et intervention dans les voies de la mort cellulaire peuvent améliorer les résultats cliniques^2,18.

Protocole

1. entretien de Culture cellulaire

1. Croissance de la lignée cellulaire SV40-HCEC à 37 ° C, 5 % de CO₂et 90 % d’humidité en DMEM F-12 à 15 % sérum fœtal (SVF), 1 % L-glutamine, 10 facteur de croissance épidermique (EGF) µg/L et de 5 mg/L d’insuline.
2. Passage de la lignée cellulaire tous les 3 à 4 jours (selon la densité de semis) afin d’assurer que confluence ne dépasse jamais 80 % au cours de l’entretien de la culture.
3. Détacher les cellules de ballons en utilisant une solution de détachement (14 mL de solution pour chaque flacon de² 150 cm) et une incubation à 37 ° C pendant pas plus de 8 min.
4. Neutraliser la solution de détachement avec un volume égal de milieu de culture cellulaire et les cellules de tubes coniques de 50 mL de granule par centrifugation pendant 7 min à 160 x g.
5. Resuspendre le culot dans un milieu (20 mL pour chaque flacon de² 150 cm).
6. Compter les cellules avec un compteur de cellules portatif automatisé et de semences dans des flacons de nouveau à une densité qui leur permettra de se développer pendant 3 à 4 jours sans dépasser 80 % confluence.

2. les cellules plaque d’expérimentation

1. Vérifier les flacons du SV40-HCECs par microscopie lumineuse de contraste de phase pour assurer cette confluence est inférieur à 80 % et à évaluer la santé générale de cellule.
2. Détacher, pellet, resuspendre et compter SV40-HCECs de flacons comme décrit aux points 1.3 à 1.6 d’entretien de la culture cellulaire. Milieu de SV40-HCEC contenant hydrocortisone 0,5 µg/mL (moyenne HCORT) permet de remettre en suspension les cellules.
3. Dans une bouteille jetable de moyenne, préparer une suspension de SV40-HCECs à 17 857 cellules/mL dans le milieu HCORT préchauffé.
   1. Préparer un volume de suspension cellulaire suffisant pour le nombre de plateaux pour l’ensemencement.
   2. Un minimum de 14 x 96 plats avec des cellules pour chaque plaque de bibliothèque de siARN à étudier les semences.
4. Agiter le flacon pour suspendre les cellules uniformément, versez un volume suffisant de la suspension cellulaire dans un réservoir sur le nid de l’agitateur orbital d’un gestionnaire automatisé de liquid et conservez le flacon contenant la suspension de cellules sur un 37 ° C, le plateau de réchauffement au cours de l’électrodéposition de cellule processus.
5. Utiliser le gestionnaire de liquid automatique pour ajouter des cellules à plaques à une densité de 1000 cellules par puits (5000 cellules/cm²) en 70 µL de milieu / puits d’une plaque de 96 puits. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
   1. Exécutez l’agitateur orbital à 100 tr/min sans cesse durant le processus d’amorçage.
   2. Mélanger la suspension cellulaire trois fois (140 µL mix volume) en utilisant le gestionnaire automatisé de liquid.
   3. Aspirer 140 µL de la suspension cellulaire et administrer 70 µL dans chaque puits de deux plaques de culture cellulaire.
   4. Répétez les étapes 2.5.3 et 2.5.4 jusqu'à ce que toutes les plaques ont été ensemencées avec des cellules.
   5. Remplir le réservoir de suspension de cellules que nécessaire au cours du processus d’amorçage.
6. Après que les plaques ont été ensemencés, retirer le gestionnaire automatisé de liquid et les incuber 30 min à température ambiante avant de les transférer dans un incubateur de culture cellulaire.
7. Évaluer la densité cellulaire de chaque puits pour chaque plaque le lendemain matin, à l’aide d’un système automatisé d’imagerie qui est logé dans un incubateur de culture cellulaire et exclure les plaques de l’étude qui ont des puits intérieurs qui ne sont pas entre 15 % et 22 % anastomosé.

3. transfecter les cellules avec des siARN

1. Acquérir des plaques bibliothèque siARN auprès du fournisseur pré configuré pour contenir 80 cibles de siARN par plaque (voir Figure 4), avec des colonnes 1 et 12 reste vide.
2. Reconstituer la plaque de bibliothèque de siARN avec siARN tampon à une concentration finale de 2 pmol/µL à chaque puits d’ARNsi selon instructions^{19 les directives du fabricant}.
3. Transfecter les cellules 24h après l’ensemencement avec 4 pmol/puits de siRNA et 0,3 µL/puits de réactif de transfection. Exécutez toutes les étapes selon le protocole du fabricant transfection réactif (voir Figure 4 schéma)²⁰.
   1. Effectuer toutes les transfections à l’aide d’un gestionnaire automatisé de liquid et utiliser un 25 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes. Utilisez les boîtes de pointe préconfiguré pour traiter uniquement les puits qui vont être transfectées.
   2. Utiliser le dessus la moitié de la plaque de bibliothèque à transfecter une série de six planches répétées s’est dénommée le « Top plaque Set » (six réplicats par siRNA, n = 6).
   3. Utilisez le fond de la moitié de la plaque de bibliothèque à transfecter un ensemble différent de six planches répétées s’est dénommée le « bas plaque Set » (six réplicats par siRNA, n = 6).
   4. Utiliser le terme « Plaque Full Set » pour décrire les 12 plaques cellulaires qui ont été transfectées avec les siARN bibliothèque.
   5. Transfecter puits B2-B6 de toutes les plaques dans la plaque pleine sertie de siARN mélange négatifs après que tous les jeux de plaque supérieure et inférieure ont été transfectées avec le siARN de bibliothèque.
   6. Aussi transfecter puits B2-B6, d’un autre deux plaques, qui ne reçoivent pas de bibliothèque siRNA et serviront de témoins non exposés (un pour l’ensemble de la plaque supérieure) et un pour le jeu de plaque inférieur, avec piscine négatif siRNA.
4. Incuber toutes les plaques de cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant 4heures après que tous les mélanges de transfection ont été ajoutés et le mélange par gentle touchant toutes les heures.
5. Utiliser un gestionnaire automatisé liquid pour laver toutes les loges des plaques deux fois avec pré chauffé HCORT milieu dilué 1:5 dans du PBS. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
   1. Aspirer 100 µL de chaque puits et que jeter dans un réservoir de déchets.
   2. Ajouter à chaque bien 100 µL/puits préchauffé moyen HCORT dilué 1:5 PBS en laquelle est contenue dans un réservoir différent à un volume suffisant de pour le nombre de plaques.
   3. Répétez les étapes 3.5.1 et 3.5.2, pour chaque plaque.
      1. Vider le réservoir de déchets selon les besoins.
      2. Remplissage du réservoir avec support HCORT dilué 1:5 dans du PBS selon les besoins.
   4. Aspirer 100 µL de chaque puits et que jeter dans le réservoir de déchets.
6. Refeed tous les puits des plaques avec 100 µL/puits préchauffé HCORT moyen, ce qui est contenu dans un réservoir différent à un volume suffisant de support pour le nombre d’assiettes.
   1. Remplir le réservoir avec support si nécessaire.
7. Utilisation de puits C2-C6 de toutes les plaques comme témoins non transfectées.
8. Garder le puits B7-B11 et C7-C11 de toutes les plaques non transfectées pour être utilisé comme médicament et véhicule contrôles d’exposition toxique.

4. refeed les cellules suivantes jour

1. Utilisez un gestionnaire automatisé de liquid pour refeed tous les puits des plaques. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
   1. Aspirer 100 µL de chaque puits et que jeter dans un réservoir de déchets.
   2. Chaque refeed bien avec 100 µL/puits préchauffé HCORT moyen qui est contenue dans un réservoir différent et a un volume suffisant de support pour le nombre d’assiettes à être réalimentés.
   3. Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 au besoin pour refeed toutes les plaques de la cellule.
      1. Vider le réservoir de déchets selon les besoins.
      2. Remplir le réservoir avec support si nécessaire.

5. contrôle positif Addition

1. Deux jours après la transfection et deux heures avant l’exposition, préparer une solution de 62,5 µM de la cardamonin de contrôle positif dans le milieu de la HCORT être utilisé pour des expositions HFA et ajouter à la ligne B d’un réservoir de dilution de 8 rangs.
   1. Pour l’exposition de CP, préparer et utiliser une solution de 25 µM de SKF 86002.
   2. Préparer un volume de contrôle positif suffisant pour le nombre de plaques à tester.
2. Préparer une solution de 0,625 % de DMSO dans un milieu HCORT (contrôle du véhicule) et ajouter à la ligne C du même réservoir.
   1. Pour l’exposition de CP, préparer et utiliser une solution de 0,5 % de DMSO.
   2. Préparer un volume de contrôle du véhicule suffisante pour que le nombre d’assiettes à tester.
3. Utiliser le gestionnaire automatisé de liquid pour ajouter des contrôles positifs et véhicule à puits B7-B11 et C7-C11 de chaque plaque cellulaire et utiliser une pipette de 50 µL/s de vitesse pour toutes les étapes. Utilisez les boîtes de pointe préconfiguré pour traiter uniquement les puits qui recevront les contrôles positifs et véhicule.
   1. Retirer 10 µL de milieu de puits B7-B11 et C7-C11 de chaque plaque cellulaire et jetez-le en lignes G et H du réservoir dilution de 8 rangs.
   2. Transférer 10 µL des contrôles positifs et véhicule dans ces puits et mélanger 3 fois.
4. Remettez ces plaques cellulaires dans l’incubateur.
5. Répétez les étapes 5.3 à 5,4 jusqu'à ce que toutes les plaques de la cellule ont reçu positifs et les commandes du véhicule.

6. HF exposition des cellules en culture

ATTENTION : HFA est corrosifs et toxiques.

1. Effectuer toutes les opérations de l’exposition aux produits chimiques dans une hotte chimique, port de gants en nitrile double, un manteau de laboratoire, les lustrines jetables en polyéthylène et lunettes de sécurité.
   1. Acquérir HFA comme une solution de 48 %.
   2. Diluer la HFA à 1 % avec de l’eau ultrapure et stocker en aliquotes de 5 mL en flacons de 10 mL mur épais polyéthylène pour améliorer la sécurité.
   3. Décontaminer les pointes de pipette et réservoirs qui ont contact avec HFA et les reste HFA liquide avec 2,5 % gluconate de calcium avant son élimination dans le flux de déchets dangereux.
2. Pour chaque plaque de bibliothèque de siARN incriminés, préparer une solution de moyen de HFA 0,0036 % en ajoutant 288 µL de 1 % HFA à 80 mL de milieu HCORT pré chauffé dans un flacon de 150 mL.
   1. Agiter le flacon et laisser incuber la HFA diluée dans un incubateur à 37 ° C sous la hotte chimique pendant 10 min.
3. Mélanger la solution moyenne HFA encore en agitant le flacon et ajoutez la solution moyenne HFA à un réservoir de réactif sur un chauffe-plat.
4. Effectuer l’exposition avec deux techniciens travaillant en tandem.
   1. Avoir le technicien sur le µL d’aspiration droite 100 dans chacun des puits intérieurs d’une plaque de cellules à l’aide d’une pipette à 12 canal et passez ensuite la plaque pour le technicien sur la gauche.
   2. Avoir le technicien à gauche ajouter 100 µL / puits de la solution moyenne HFA.
   3. Répétez les étapes 6.4.1 et 6.4.2 pour toutes les plaques de cellules susceptibles d’être exposés à la substance toxique.
   4. Aussi répéter les étapes 6.4.1 et 6.4.2 pour plaques de commande non exposés, utilisant un milieu frais HCORT au lieu de la solution moyenne HFA.
5. Placer les plaques dans l’incubateur de hotte des fumées chimiques pendant 20 min et puis retournez-les à l’incubateur de culture cellulaire.
6. Répétez l’étape d’addition du contrôle positif (pas de 5.1 à 5.5) comme précédemment indiqué une fois que toutes les plaques ont été exposés et retournés à l’incubateur de culture cellulaire.

7. CP exposition des cellules en culture

ATTENTION : Le CP est extrêmement toxique et irritant.

1. Effectuer toutes les opérations de l’exposition aux produits chimiques dans une hotte chimique, port de gants en nitrile double, un manteau de laboratoire, les lustrines jetables en polyéthylène et lunettes de sécurité.
   1. Acquérir des CP.
   2. Diluer le CP à 5 % dans le DMSO et stocker en portions de 10 mL en flacons de 10 mL à scintillation pour améliorer la sécurité.
   3. Décontaminer les pointes de pipette et réservoirs qui sont venus en contact avec des CP et des reste CP liquide avec du bisulfite de sodium 2,5 % avant leur élimination dans le flux de déchets dangereux.
2. Préparer un volume suffisant de préchauffé moyen HCORT contenant 1 x Pen/Strep et PBS préchauffé pour le nombre de plateaux d’être exposés.
3. Pour chaque jeu Top Set plaque ou plaque de fond, ajouter 8,04 µL de 5 % CP dans le DMSO à une portion de 50 mL de préchauffé moyen HCORT et mélanger bien pour une concentration finale de CP de 0,0008 %. Boucher le tube hermétiquement et incuber la solution dans un incubateur à 37 ° C sous la hotte chimique pendant 1 h.
   1. L’ajout du CP à la 50 ml de milieu du temps afin que chacun exposé Top plaque Set et la valeur de la plaque de fond reçoit toxique exactement 1 h après que le CP a été ajouté à l’aliquote de 50 mL de milieu.
4. Enlever un Top Set plaque et la plaque de 1 contrôle non exposés de l’incubateur de culture cellulaire et placez-les dans la hotte de laboratoire chimique vers la fin de la période d’incubation.
5. Mélanger la solution de CP en renversant le tube et décanter ensuite à un réservoir à la fin de la période d’incubation de 1 h.
6. Effectuer l’exposition avec deux techniciens travaillant en tandem.
   1. Avoir le technicien sur le µL d’aspiration droite 100 dans chacun des puits intérieurs d’une plaque de cellules à l’aide d’une pipette à 12 canal et passez ensuite la plaque pour le technicien sur la gauche.
   2. Avoir le technicien à gauche ajouter 100 µL / puits de la solution de milieu de CP.
   3. Répétez les étapes 7.6.1 et 7.6.2 pour toutes les plaques de la cellule de la plaque Top Set d’être exposés à la substance toxique.
   4. Aussi répéter les étapes 7.6.1 et 7.6.2 pour plaques de commande non exposés, utilisant un milieu frais HCORT au lieu de la solution de milieu de CP.
7. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C sous la hotte chimique pendant 10 min.
8. Ajouter un volume suffisant de PBS et HCORT support contenant 1 x Pen/Strep pour réservoirs à réactifs vers la fin de la période d’incubation de 10 min.
9. Enlever la solution de CP de plaques cellulaires à l’aide d’une pipette à 12 canal et remplacez-le par 100 µL / puits de PBS à la fin de la période d’incubation de 10 min.
10. Immédiatement retirer les PBS de plaques cellulaires et remplacez-le par 100 µL / puits de milieu HCORT contenant 1 x Pen/Strep.
11. Aussi répéter les étapes 7.9 et 7.10 pour les plaques de contrôle non exposés.
12. Retourner les plaques de la cellule à un incubateur de culture cellulaire standard.
13. Répétez les étapes 7.3 à 7.12 pour le jeu de plaque de fond.
14. Répétez l’étape d’addition du contrôle positif (pas de 5.1 à 5.5) comme décrit plus haut une fois que toutes les plaques ont été exposés et retournés à l’incubateur de culture cellulaire.

8. collecte et analyse de viabilité de cellules de l’échantillon

1. Vingt-quatre heures après l’exposition, préparer une solution de substrat MTT de 0,5 mg/mL dans du PBS contenant 10 g/L de glucose et chauffé à 37 ° C,²¹. Préparer 10 mL de substrat pour chaque plaque à doser.
2. Pour le nombre de plaques à doser, ajouter un volume suffisant de solution de substrat MTT jusqu'à un réservoir sur un gestionnaire automatisé de liquid.
3. Utilisation au maître liquid automatisé pour recueillir l’échantillon et ajoutez le substrat MTT au moyen d’une pipette de 50 µL/s de vitesse pour toutes les étapes. Préconfigurer des boîtes de pointe pour traiter uniquement ces puits à doser.
   1. Moyen d’aspirat 95 µL du provenant des puits de 60 intérieures de la plaque cellulaire et dépôt 42,5 µL dans chacune des deux plaques 384 puits de stockage.
   2. Immédiatement ajouter 100 µL / puits de la solution de substrat MTT dans les plaques de la cellule et les incuber à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 1,5 h.
   3. Remplir le réservoir avec la solution de substrat MTT selon les besoins.
4. Incuber les plaques de la cellule à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 1 h.
5. Sceller les plaques 384 puits de stockage et les stocker à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
6. Répétez les étapes 8.3 à 8.5 pour tous les jeux de plaque supérieure et inférieure et les contrôles associés non exposés.
   1. Réutiliser les conseils entre les répétitions si vous le souhaitez, mais Lavez-les lors de l’ajout de solution de substrat MTT et quand passer la plaque fixe.
7. Après l’incubation de 1 h, ajouter un volume suffisant de DMSO à un réservoir sur un gestionnaire automatisé de liquid.
8. Utiliser le gestionnaire automatisé de liquid pour ajouter DMSO et utiliser une pipette de 50 µL/s de vitesse pour toutes les étapes.
   1. Aspirer 100 µL dans chacun des puits intérieurs des plaques cellulaires et jeter la solution de substrat MTT dans un réservoir de déchets.
      1. Vider le réservoir de déchets selon les besoins.
   2. Superposer chaque puits avec 100 µL DMSO.
      1. Remplissez le réservoir de DMSO comme nécessaire.
9. Agiter les plaques sur un agitateur de plaque pendant 3 min.
10. Mesurer l’absorbance à 570 et 690 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque.
11. Soustraire l’arrière-plan et calculer la % de la viabilité cellulaire en divisant les valeurs d’absorbance exposées par les témoins non exposés. Utilisez le contrôle de siARN moyen mélange négatifs non exposés pour calculer la viabilité cellulaire % pour toutes les cibles.

9. IL mesure-8 Concentration dans les surnageants de Culture cellulaire

1. Mesure la concentration d’IL-8 dans les surnageants de culture de cellules en utilisant un non laver axée sur la perle de dosage selon instructions^{22 les directives du fabricant}. Créer une disposition de plaque de dosage pour accueillir les échantillons et la courbe d’étalonnage.
2. Enlever les plaques 384 puits de stockage du congélateur-80 ° C, décongeler à température ambiante et centrifuger brièvement les plaques pour recueillir l’échantillon dans le fond des puits.
3. Pour le nombre de plaques d’essai à exécuter, faire un volume suffisant d’accepteurs anti-IL-8 perles et des anticorps anti-IL-8 biotinylé dans du tampon fourni dans le kit. Utiliser le ratio de 50 µL de perles accepteur anti-IL8 et 50 µL d’anticorps anti-IL8 biotinylé à 9,9 mL de tampon.
   1. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter le mélange de perle/anticorps à une plaque noire 384 puits stockage.
      1. Ajouter accepteur perle/anticorps aux puits désignées pour être utilisée pour les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test.
      2. Ajouter un volume suffisant par puits pour le nombre de plaques de test à exécuter.
4. Reconstituer le standard de l’IL-8 à 1000 pg/mL à l’aide de milieu de culture cellulaire contenant µM 354 NaCl. Faire un volume suffisant pour le nombre de plaques de test à exécuter.
5. Faire huit double série de dilutions de la courbe standard.
6. Ajouter la courbe d’étalonnage en triple exemplaire aux puits d’une plaque noir stockage 384 puits selon le schéma dosage appropriés. Ajouter un volume suffisant par puits pour le nombre de plaques de test à exécuter.
   1. De même, ajoute le milieu de culture cellulaire contenant µM 354 NaCl avec aucun IL-8 pour la mesure de l’arrière-plan.
7. Utilisez un gestionnaire automatisé de liquid pour effectuer le test. Utilisez les boîtes de pointe préconfiguré pour traiter uniquement les puits désignés par le schéma test. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
   1. Transfert 8 µL du mélange accepteur perle-anticorps dans les puits des plaques 384 puits peu profonds dosage bien blanc.
      1. Ajouter uniquement dans les puits désignés pour les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test.
   2. Transfert 2 µL de la courbe d’étalonnage dans les puits appropriés des plaques selon le schéma dosage dosage de puits peu profonds.
   3. Préparer une solution de NaCl de 3,54 M et ajouter un volume suffisant pour le nombre de plaques à doser pour un réservoir profond sur le gestionnaire automatisé de liquid.
   4. Ajuster la concentration en sel des échantillons doit correspondre à celui de la courbe d’étalonnage en transférant 4,5 µL de la solution de NaCl sur les échantillons dans les plaques noires 384 puits stockage.
   5. Mélanger les échantillons trois fois en utilisant un mélange volume 30 µL et transfert 2 µL des échantillons pour le blanc peu profond bien doser plaques selon le schéma test.
      1. Changer de conseils entre les plaques de l’échantillon.
   6. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 heure.
   7. Pour le nombre de plaques d’essai à exécuter, faire un volume suffisant de perles accepteur dans du tampon d’essai. Utiliser le ratio de 200 µL de perles accepteur secondaire à 12,3 mL de tampon.
   8. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter perles secondaires à une plaque noire 384 puits stockage.
      1. Ajouter les perles secondaires aux puits désignées pour être utilisée pour les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test.
      2. Ajouter un volume suffisant par puits pour le nombre de plaques de test à exécuter.
   9. En utilisant le gestionnaire automatisé de liquid, transférer 10 µL de perles secondaires dans les puits des plaques blanches dosage bien 384 puits peu profonds.
      1. Ajouter uniquement dans les puits qui ont reçu les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test et lavez les pointes entre chaque plaque.
   10. Incuber pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante.
8. Sceller le dosage plaques avec clairement des joints de plaque et numériser à l’aide d’un lecteur compatible avec le test. Utilisez 0,2 mm distance entre la plaque et détecteur et temps d’excitation de ms 180 550 ms temps de mesure pour l’analyse.
9. Importer les données brutes de l’IL-8 épreuves dans un tableur.
10. Utiliser la courbe automatisé pour la courbe d’étalonnage de l’IL-8 épreuves et puis convertir les fichiers RAW en pg/mL pour chaque échantillon.

Résultats

Élaboration de méthodes d’exposition

Nous avons affiné et évalué la pertinence de la ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines SV40-HCEC pour utilisation dans les études HTS. SV40-HCEC ont été immortalisé à l’aide de l’antigène de T grand SV-40 et étaient un cadeau du namawa Pal²³. Il y avait trop de variables explorées dans le développement de méthodologi...

Discussion

Dans les présentes, nous décrivons nos méthodes et nos résultats sur le développement d’une cellule épithéliale de haut débit cornée, modèle pour l’étude des lésions HF et CP de dépistage. Nous présentons aussi les résultats de l’écran de siARN primaires pour blessure de HF. Il y avait de nombreux défis pour le développement de modèles HTS pour l’étude des blessures TIC. Les méthodes que nous pourrions trouver dans la littérature concernant l’étude de HF, HFA ou CP dans les modèles de cu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting