مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

Summary

هنا، نحن بالتفصيل الأساليب التجريبية المستخدمة لتقييم قوي نتوء بودوسوميس تنطبق على فيلم متوافقة، من إعداد الفيلم للتحليل الآلي للصور الطبوغرافية.

Abstract

في العديد من السياقات البيولوجية، تحتاج الخلايا الحيوانية من التفاعل فعلياً مع بيئتها بتطوير القوات الميكانيكية. ومن بين هذه الجر قوات كانت تتسم جيدا، ولكن هناك نقص في التقنيات التي تسمح بقياس بروز قوي تمارسه الخلايا أورثوجونالي إلى هذه الركيزة. لقد قمنا بتصميم إعداد تجريبية لقياس بروز قوي تمارسه الخلايا ملتصقة على هذه الركيزة. خلايا مطلي على ورقة فورمفار متوافقة مع تشوه هذه الركيزة وهو تعيين التضاريس الناتجة عن ذلك بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM) بمقياس نانومتر. ثم يتم استخراج قيم القوة من تحليل الشخصية تشوه استناداً إلى هندسة الهياكل الخلوية بارزة. ومن ثم، يمكن قياس قوي تمارسه الوحدات الفردية بارزة من خلية حية على مر الزمن. وستمكن هذه التقنية دراسة توليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء. وهنا يصف لنا تطبيقه لقياس قوي بارزة المتولدة عن بودوسوميس التي شكلتها الضامة البشرية.

Introduction

الخلايا الحيوانية التفاعل فعلياً مع المصفوفة والخلايا الأخرى التي تشكل هذه البيئة¹. وهذا مطلوب بالنسبة لهم ترحيل أو تدخيل الهيئات، والحصول على المعلومات الخارجية أو التفريق. في مثل هذه العمليات، يجب إنشاء الخلية القوات الميكانيكية، وكما أظهرت العديد من الدراسات على مدى السنوات الأخيرة، قدرة خلية لتوليد القوى، والتحقيق في بيئتها يؤثر على سلوكها البيولوجي، على سبيل المثال توجيه الانتشار أو تمايز^2،3. بدوره، قياس قوات الخلوية مساعدة كبرى دراسة تنظيم توليد القوة وفهم أثره في الخلايا والأنسجة والسلوك مصير^4،5.

وقد شهدت السنوات الأخيرة تطوير العديد من التقنيات لقياس القوى التي يمكن أن تمارسه خلية على البيئة⁶. أن غالبية هذه قد ساعدت في الكشف عن قوي الجر أن تمارس الخلايا كما أنها تسحب متنقلة المسابير أو تشوه الركازة. بيد قوي ميكانيكية المتورطين في نتوء في البيئة خارج الخلية تعاني من الافتقار إلى تقنيات القياس والتاريخ تتميز ليس على ما يرام.

للتغلب على هذا التحديد، نقدم طريقة لقياس القوى التي تمارس أورثوجونالي إلى الركيزة. وهو يتألف في طلاء الخلايا الحية على ورقة رقيقة مرنة التي يمكن أن تشوه في اتجاه متعامد، مما يجعل من الممكن لقياس التشوه الركيزة بالخلايا ونستنتج القوى المعنية. يقاس الطوبوغرافيا الركازة مع القرار النانو باستخدام مجهر القوة الذرية والتقييم للقوات من التشوه ويعتمد على معرفة هندسة الهياكل الخلوية بارزة^{7،8، 9}.

هنا، نحن وصف الإعداد وتطبيقها لقياس القوى التي تم إنشاؤها بواسطة بودوسوميس، هياكل التصاق بارزة شكلتها الضامة لهجرتهم الوسيطة في بيئات ثلاثية الأبعاد^{10،11، 12،13،،}من^1415،،من¹⁶¹⁷. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب ستعزز التفاهم وتوليد القوة وتنظيمها في العديد من العمليات الخلوية التي تنطوي على نتوء.

Protocol

1-إعداد الشبكات المغلفة فورمفار

1. تنظيف شبكات الميكروسكوب الإلكتروني مع الأسيتون النقي وتجفيفها على ورق الترشيح. ثم نظيف شريحة مجهر مع الإيثانول النقي، يمسح مع ورقة عدسة وإزالة الغبار مع منفاخ.
2. مكان على شريحة زجاج تنظيفها الإيثانول عمودياً في القمع لجهاز صب الأفلام التي تتضمن حلاً فورمفار في الجزء السفلي. يغطي الجزء العلوي من القمع.
3. ضخ 100 مل محلول فورمفار (0.5% في كلوريد الإيثيلين) مع لمبة رذاذ حتى يصل إلى المستوى الثلثين من الشريحة.
4. ضع الشريحة في الحل لمدة 1 دقيقة.
5. فتح الصمام الجهاز استنزاف الحل فورمفار في دفق مستمر. معدل تدفق من 10 إلى 15 مل/s سوف تسفر عن فيلم فورمفار من 30-80 نانومتر. يتم تحديد سمك الفيلم بتركيز حل فورمفار، ومعدل الصرف.
   ملاحظة: يمكن التحكم في سعر الصرف بواسطة التنفيس الضغط عن طريق صمام الهواء من خلال فتح ببطء الصمام. أسرع الصرف، وأكثر سمكا الفيلم. في الممارسة العملية، لأنه من الصعب التنبؤ بسمك الفيلم من معدل التدفق فورمفار، نحن إعداد عدة دفعات من الأفلام فورمفار ومراقبة سمكها حسب فؤاد (راجع الخطوة 2).
6. إزالة الشريحة من الدائرة وجاف أنه دقيق على الورق مرشح لإزالة أي فورمفار السائلة.
7. قطع مستطيل 20 مم × 50 مم من الفيلم فورمفار بشفرة حلاقة.
8. ملء كوب ماء مقطر نظيفة ويغرق ببطء الشريحة عمودياً في الماء لتطفو قبالة الفيلم: الفيلم يجب أن تطفو على سطح الماء.
9. مواجهة شبكات تنظيف الأسيتون الجافة مكان في الفيلم، لامعة.
10. وضع زجاج جولة ساترة (Ø 12 مم) على عدد قليل من الشبكات. سيعمل هذا ساترة قياس سماكة الفيلم (راجع الخطوة 2).
11. تغطية شريحة مجهر مع ملصق أبيض حجمها لتناسب ذلك. تراجع الشريحة عمودياً عند الحدود للفيلم فورمفار العائمة حتى الفيلم كله تلتزم بالشريحة. إزالة الماء الزائد من الشريحة مع ورق الترشيح وأتركها تجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.

2-قياس سمك الفيلم

1. قطع فورمفار حولها ساترة مع ملاقط لفصل فإنه من الشريحة.
2. وضع علامة على موقع الشبكة تحت ساترة بقلم.
3. قطع فورمفار حول الشبكة ملحوظ لفصل فإنه من ساترة. ولذلك ستكون ثقب في ورقة فورمفار المتبقية، والتي سوف تسمح لقياس سماكة الفيلم. تغطية ساترة مع برنامج تلفزيوني ووضعه على شريحة زجاج في المجهر.
4. جبل ناتئ نيتريد سيليكون على كتلة الزجاج فؤاد، مع التأكد من أن الشريط الذهبي لا يشملها غيض من فصل الربيع.
   ملاحظة: حساسية وربيع ثابت ناتئ ينبغي أن يكون سابقا تم معايرة في برنامج تلفزيوني.
5. جبل كتلة الزجاج على الوحدة النمطية فؤاد ومن ثم وضع الوحدة النمطية على المجهر.
6. ضع ساترة المغلفة فورمفار في دائرة المراقبة وتغطية ذلك مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
7. المسح الضوئي من الثقب في ورقة فورمفار استخدام فؤاد في وضع الاتصال ومجموعة قوة 0.5 nN نقطة الحدود.
8. استخدام سطح الزجاج ساترة كالمرجع لقياس الطول، وتقييم سمك فورمفار كارتفاع المقطع العرضي (إجراء قياسات على الأقل 10 كل دفعة فورمفار).

3-زرع الخلايا في الشبكات

1. تحت غطاء عقيمة، وضع شريطا (12 ملم × 3 ملم) من شريط لاصق الوجهين على ساترة.
2. قطع شبكة فورمفار المغلفة بملاقط ووضعه رأسا على قطاع لاصقة (حافة الشبكة فقط يحتاج لإلحاقها بالشريط). الفيلم فورمفار يجب أن تواجه ساترة.
3. وضع هذا الجهاز في ثقافة جيدا.
4. مكان معالجة تجميعية 10 ميليلتر من ربمي دون FCS التي تحتوي على 10⁴ الضامة متباينة من وحيدات الإنسان¹⁶.
   ملاحظة: تأكد من عدم اتصال الشبكة مع طرف الماصة لمنع إتلاف طلاء فورمفار.
5. احتضان لمدة 30 دقيقة (37 درجة مئوية، 5% CO₂) للسماح للخلايا الالتزام.
6. تملأ البئر مع 2 مل ربمي المحتوية على السفح 10%.
7. احتضان الجهاز ح 2 في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ للسماح للخلايا الالتزام قبل المراقبة فؤاد.

4-تضاريس قياسات التشوهات الناجمة عن بودوسومي

1. عصا الشريطين لتضاعف من جانب شريط لاصق على زجاج قاع طبق بيتري.
   ملاحظة: يجب أن تكون المسافة بين الشريطين أصغر من قطر الشبكة.
2. فصل الشبكة مطلي بالضامة من الشريط اللاصق بعناية.
3. تشغيل الشبكة رأسا من أجل الحصول على الخلايا التي يواجهها الزجاج وعصا الشبكة بين الشريطين لاصقة.
4. إصلاح الشبكة مع اثنين شرائط جديدة من الضعف من جانب لاصق: الشبكة وبالتالي سوف يكون تقع بين الشريطين لاصقة، تاركاً المنطقة الوسطى من الشبكة موجوداً لنصيحة فؤاد.
   ملاحظة: تأكد من أن الشبكة الثابتة جيدا ولا الملتوية؛ ناتئ فؤاد قد لا تكون قادرة على الاقتراب من السطح فورمفار.
5. ملء طبق بيتري مع 2 مل من قبل ساخنة في 37 درجة مئوية الثقافة المتوسطة (ربمي مع السفح 10 ٪) وتستكمل مع 10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4).
6. ضع الطبق الثقافة على سخان طبق 37 درجة مئوية.
7. تثبيت سخان طبق في مرحلة فؤاد.
8. السماح للنظام بتحقيق استقرار في 37 درجة مئوية.
9. في وضع الاتصال مع قوة 0.5 nN، جعل صورة عالمية أولى لتحديد موقع بودوسوميس، ومن ثم مسح طبوغرافية فورمفار عند 3 هرتز مع كسل نانومتر كبيرة حوالي 20.
   ملاحظة: تجنب المسح الضوئي قرب حواف الشبكة.

النتائج

البروتوكول أعلاه توضح كيفية إعداد الإعداد التجريبية تحديد حجم القوات نتوء تطبقها بودوسوميس بلعم على الركازة فورمفار. وهذا يتحقق باستخدام فؤاد ويتضح في الشكل 1.

عند تحليل صورة طوبوغرافية تضخمات تحت بودوسوميس باستخدام برن...

Discussion

خصائص المواد

اختيار المواد للغشاء تشوه، في حالتنا فورمفار، يحتاج إلى الوفاء ببعض المتطلبات. المواد التي يجب أن تكون شفافة للضوء المرئي ويحمل الأسفار السيارات المحدودة للسماح للملاحظات في الميدان مشرق والفحص المجهري الأسفار. خشونة الفيلم رقيقة يجب أن تكون أقل من 1...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100