Microscopie à Force saillie : Une méthode pour quantifier les Forces développées par cellule saillies

Résumé

Ici, nous détaillons les techniques expérimentales utilisées pour évaluer les forces de protrusion podosomes applicables sur un film compatible, de la préparation du film pour l’analyse automatique des images topographiques.

Résumé

Dans nombreux contextes biologiques, cellules animales ont besoin d’interagir physiquement avec leur environnement en développant des forces mécaniques. Parmi ceux-ci, les forces de traction ont été bien caractérisés, mais il y a un manque de techniques permettant de mesurer les forces de protrusion exercée par les cellules orthogonalement à leur substrat. Nous avons conçu un montage expérimental pour mesurer les forces de protrusion exercées par les cellules adhérentes sur leur substrat. Les cellules plaqués sur une feuille de Formvar conforme déforment ce substrat et la topographie qui en résulte est mappée par microscopie à force atomique (AFM) à l’échelle du nanomètre. Valeurs de force sont alors extraites de l’analyse de la déformation de profil basé sur la géométrie des structures cellulaires protrusive. Par conséquent, les forces exercées par les différentes unités qui dépasse d’une cellule vivante peuvent être mesurées au fil du temps. Cette technique va permettre l’étude de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie. Nous décrivons ici son application pour mesurer les forces protrusive générés par podosomes formé par les macrophages humains.

Introduction

Les cellules animales interagissent physiquement avec la matrice et les autres cellules qui constituent leur environnement¹. Cela est nécessaire à leur migration, internaliser les organes, acquérir de l’information externe ou différencier. Dans ces processus, la cellule doit générer des forces mécaniques et, comme de nombreuses études ont montré ces dernières années, la capacité d’une cellule pour générer des forces et sonde son environnement influe sur son comportement biologique, mise en scène par exemple prolifération ou différenciation^2,3. À son tour, la mesure des forces cellulaires est une aide importante pour étudier la régulation de la production de force et de comprendre son implication dans la cellule comportement et tissu sort^4,5.

Ces dernières années ont vu le développement de nombreuses techniques pour mesurer les forces qu’une cellule peut exercer sur son environnement⁶. La majorité d'entre eux ont contribué à révéler que la traction des forces que les cellules exercent comme ils tirent sur les sondes mobiles ou un substrat déformable. Cependant, les forces mécaniques impliquées en saillie dans l’environnement extracellulaire souffrent d’un manque de techniques de mesure et sont à ce jour n’est pas bien caractérisé.

Pour contourner cette limitation, nous présentons une méthode pour mesurer les forces exercées perpendiculairement au substrat. Il consiste en la plaquant sur une mince feuille élastique qui peut se déformer dans la direction orthogonale, ce qui permet de mesurer la déformation du substrat par les cellules et en déduire les forces en présence, les cellules vivantes. Topographie de substrat est mesurée à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide de la microscopie à force atomique et de l’évaluation des forces de déformation s’appuie sur la connaissance de la géométrie des structures cellulaires protrusive^{7,8, 9}.

Nous décrivons ici le programme d’installation et de son application pour mesurer les forces générées par les podosomes, structures d’adhérence protrusive formés par les macrophages pour leur migration mésenchymateuse dans des environnements en trois dimensions^{10,11, 12,13,14,15,16,17}. Nous pensons que cette technique fera progresser la compréhension de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie.

Protocole

1. préparation des grilles Formvar-enduit

1. Nettoyer les grilles de la microscopie électronique avec de l’acétone pur et séchez-les sur du papier filtre. Puis nettoyez avec de l’éthanol pur, une lame de microscope, essuyer avec un papier de lentille et enlever la poussière avec un ventilateur.
2. Placez une lamelle de verre nettoyé à l’éthanol verticalement dans l’entonnoir d’un film de dispositif de moulage contenant une solution de Formvar dans la partie inférieure. Recouvrir le haut de l’entonnoir.
3. 100 mL de solution de Formvar (0,5 % en chlorure d’éthylène) la pompe avec la poire atomiseur jusqu'à ce que le niveau atteigne les deux tiers de la diapositive.
4. Garder la lame dans la solution pendant 1 min.
5. Ouvrez le robinet de l’appareil pour vider la solution Formvar dans un flot continu. Un débit de 10 à 15 mL/s produira un film Formvar de 30 à 80 nm. L’épaisseur du film est déterminée par la concentration de la solution de Formvar et par le débit de drainage.
   Remarque : Le débit de drainage peut être contrôlé par la pression par la soupape d’air sortie d’évacuation en ouvrant lentement le robinet. Plus vite le drainage, le plus épais du film. Dans la pratique, parce qu’il est difficile de prévoir l’épaisseur de la couche de la vitesse d’écoulement de Formvar, nous préparons plusieurs lots de Formvar films et contrôler leur épaisseur par AFM (voir étape 2).
6. Retirez la lame de la chambre et séchez-le délicatement sur un papier filtre pour enlever n’importe quel liquide Formvar.
7. Découper un rectangle de 20 x 50 mm du film Formvar avec une lame de rasoir.
8. Remplir un bécher d’eau distillée et lentement plonger la lame verticalement dans l’eau à flotter sur le film : le film devrait flotter à la surface de l’eau.
9. Relever le lieu nettoyé à l’acétone secs grilles sur le film, brillant.
10. Placez une lamelle de verre rond (Ø 12 mm) sur quelques uns des grilles. Cette lamelle servira à mesurer l’épaisseur de film (voir étape 2).
11. Couvrir une lame de microscope avec un autocollant blanc redimensionné pour s’adapter à elle. Tremper la lame verticalement à la frontière du film Formvar flottant jusqu'à ce que tout le film adhère à la diapositive. Retirer l’eau en excès de la diapositive avec le papier filtre et laisser sécher à température ambiante pendant la nuit.

2. mesure de l’épaisseur du Film

1. Couper le Formvar autour de la lamelle couvre-objet avec la pince à épiler pour détacher de la diapositive.
2. Marquer l’emplacement de la grille sous la lamelle avec un stylo.
3. Couper le Formvar autour de la grille marquée pour détacher de la lamelle. Il y aura donc un trou dans la feuille de Formvar restante, qui permettra de mesurer l’épaisseur du film. Couvrir la lamelle avec du PBS et le placer sur une lame de verre sur le microscope.
4. Monter un cantilever de nitrure de silicium sur la brique de verre AFM, veillant à ce que la bande d’or n’est pas couvert par l’extrémité du ressort.
   Remarque : La sensibilité et la constante du ressort du levier doivent ont précédemment été calibrés dans du PBS.
5. Monter la brique de verre sur le module de l’AFM et ensuite placer le module sur le microscope.
6. Placer la lamelle Formvar-enduit à la chambre d’observation et la couvrir avec 500 µL de PBS.
7. Scan de la frontière du trou dans la feuille de Formvar utilisant l’AFM dans le mode de contact et un point de consigne de force nN 0,5.
8. Utilisez la surface de lamelle de verre comme référence pour les mesures de hauteur et d’évaluer l’épaisseur de Formvar comme la hauteur de la section transversale (mesurer au moins 10 par Formvar lot).

3. ensemencement de cellules sur des grilles

1. Sous hotte stérile, mettre une bande (12 x 3 mm) de ruban adhésif double-face sur un lamelle couvre-objet.
2. Découper une grille Formvar-enduit avec des pincettes et mettez-le à l’envers sur la bande adhésive (seulement la jante de la grille doit être attachée à la bande). Le film de Formvar doit faire face à la lamelle.
3. Mettre cet appareil dans une culture bien.
4. Placer une goutte de 10 µL de RPMI sans FCS contenant 10⁴ macrophages différenciés des monocytes humains¹⁶.
   Remarque : Veillez à ne pas toucher la grille avec l’embout de la pipette pour éviter d’endommager le revêtement Formvar.
5. Incuber 30 min (37 ° C, 5 % de CO₂) pour laisser les cellules adhèrent.
6. Remplir le puits avec 2 mL de RPMI contenant 10 % FCS.
7. Incuber le dispositif pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO₂ à laisser les cellules à respecter avant l’observation de l’AFM.

4. topographie mesures de déformations induites par le podosomes

1. Coller deux bandes de ruban adhésif double-face sur un fond de verre plat de Pétri.
   Remarque : La distance entre les deux bandes doit être inférieure au diamètre de la grille.
2. Soigneusement détacher la grille plaquée avec du ruban adhésif, les macrophages.
3. Renversez la grille afin d’avoir des cellules face à la vitre et le bâton de la grille se trouvant entre les deux bandes adhésives.
4. Fixer la grille avec deux nouvelles bandes d’adhésif double-face : la grille sera ainsi intercalée entre deux bandes adhésives, laissant la zone centrale de la grille accessible à la pointe de l’AFM.
   Remarque : Assurez-vous que la grille soit bien fixée et pas tordue ; sinon le cantilever AFM ne peut-être pas en mesure d’approcher la surface Formvar.
5. Remplissez la boîte de Pétri avec 2 mL de milieu de culture préchauffé 37 ° C (RPMI avec 10 % FCS) additionné de 10 mM HEPES (pH 7,4).
6. Placez la boîte de Petri sur un chauffe plat de 37 ° C.
7. Installer l’appareil à plat sur la scène de l’AFM.
8. Laisser le système se stabiliser à 37 ° C.
9. En mode de contact avec une force nN 0,5, faire une première image globale pour localiser les podosomes et puis analyser la topographie Formvar à 3 Hz avec un pixel environ 20 nm-grand.
   NOTE : Éviter d’analyser près des bords de la grille.

Résultats

Le protocole ci-dessus décrit comment préparer le montage expérimental de quantifier protrusion forces exercées par les macrophages podosomes sur un substrat de Formvar. Ceci est réalisé en utilisant le manuel de vol et est illustrée à la Figure 1.

Lorsqu’on analyse une image topographique des renflements sous podosomes en utilisant le logiciel de traitement de données JPK, un polynôme d...

Discussion

Propriétés des matériaux

Le choix du matériau de la membrane déformable, dans notre cas Formvar, il faut remplir quelques conditions. Le matériel doit être transparent à la lumière visible et fluorescence auto limitée pour permettre des observations dans le champ lumineux et la microscopie de fluorescence. La rugosité de la couche mince doit être bien inférieure à 10 nm pour éviter tout effet topographique sur l’adhérence des cellules et permettre à claire o...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100