Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.

Özet

Çok sayıda biyolojik bağlamlarda hayvan hücrelerinin fiziksel olarak mekanik Kuvvetleri geliştirerek onların çevre ile etkileşim gerekir. Bunlar arasında çekiş güçleri iyi karakterize olmuştur, ama teknikleri onların substrat uygun hücrelere tarafından sarf çıkıntı kuvvetler ölçümü izin veren bir eksikliği olduğunu. Biz onların yüzey üzerinde yapışık hücreleri tarafından sarf çıkıntı kuvvetleri ölçmek için deneysel bir kurulum tasarlanmıştır. Bu yüzey hücreleri uyumlu Formvar kağıt üzerinde kaplama deforme ve elde edilen topografya nanometre ölçeğinde atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından eşleştirilir. Kuvvet değerleri daha sonra protrusive hücresel yapılar geometri üzerinde dayalı deformasyon profil bir analiz ayıklanır. Bu nedenle, bir yaşam hücre bireysel çıkıntılı birimleri tarafından sarf kuvvetleri zamanla ölçülebilir. Bu teknik, kuvvet oluşturma ve çıkıntı içeren birçok hücresel süreçler, Yönetmelikte sağlayacaktır. Burada, insan makrofajlar tarafından kurulan podosomes tarafından oluşturulan protrusive kuvvetleri ölçmek için uygulama açıklar.

Giriş

Hayvan hücrelerinin fiziksel olarak matrix ve onların çevre1oluşturan diğer hücreleri ile etkileşim. Bu onlar için geçirme, cesetleri içselleştirmesi, dış bilgi edinme veya ayırt etmek gereklidir. Bu tür işlemlerde, mekanik Kuvvetleri hücre oluşturmak için gereken ve çok sayıda çalışma son yıllarda gösterdiği gibi kuvvetler oluşturmak ve çevresine yoklama için hücre yeteneği Örneğin nükleer silahların yayılmasına karşı yönlendiren biyolojik davranışını etkiler veya farklılaşma2,3. Buna karşılık, hücresel kuvvetler ölçümü kuvvet oluşturma Yönetmeliği çalışma ve onun dolaylı hücre davranış ve doku kader4,5anlamak için bir büyük yardımcısıdır.

Son yıllarda bir hücre üzerinde onun çevre6uygulamayın kuvvetleri ölçmek için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde çok sayıda tanık olduk. Bunların çoğunluğu onlar mobil probları veya deforme substrat çekmek gibi hücreleri sarfetmek çekiş güçleri açığa vesile olmuştur. Ancak, mekanik Kuvvetleri çıkıntı hücre dışı ortama dahil ölçüm teknikleri bir eksikliği muzdarip ve iyi değil karakterize bugüne kadar.

Bu sınırlamayı aşmak için uygun belgili tanımlık substrate sarf kuvvetleri ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu canlı hücreler hücreleri tarafından yüzey deformasyon ölçmek ve katılan kuvvetleri anlamak mümkün hale dik yönde deforme ince bir elastik levha üzerinde kaplama oluşur. Substrat topografya atomik kuvvet mikroskobu kullanarak nano çözünürlüğü ile ölçülür ve deformasyon kuvvetlerden değerlendirilmesi protrusive hücresel yapılar7,8, geometri bilgisine dayanıyor 9.

Burada, kurulum ve uygulama podosomes, protrusive yapışma yapıları için üç boyutlu ortamlarda10,11mezenkimal onların göç makrofajlar tarafından kurulan tarafından oluşturulan kuvvetleri ölçmek için açıklamak, 12,13,14,15,16,17. Bu teknik kuvvet oluşturma ve çıkıntı içeren birçok hücresel süreçler, Yönetmelikte anlayışı peşin olacak inanıyorum.

Protokol

1. Formvar kaplamalı ızgaralar hazırlanması

  1. Elektron mikroskobu ızgaralar saf aseton ile temiz ve kuru onları filtre kağıt üzerinde. Sonra temiz bir mikroskop slayt saf etanol ile objektif kağıt ile silin ve toz bir üfleyici ile kaldırın.
  2. Bir etanol temizledim cam slayt film döküm cihazın alt kısmındaki Formvar çözeltilerine içeren huni dikey olarak yerleştirin. Huni üst kapak.
  3. Düzeyi üçte ikisi slayt ulaşıncaya kadar 100 mL Formvar çözeltisi (etilen ve %0,5) atomizer ampul ile pompa.
  4. Slayt 1 dk. için çözüm unutmayın.
  5. Aygıt bir akışı Formvar çözümünde drenaj valfi açın. Bir akış hızı 10 15 mL/s 30-80 nm Formvar film ortaya çıkarır. Film kalınlığı Formvar çözüm konsantrasyonu ve drenaj oranına göre belirlenir.
    Not: Drenaj oranı tarafından havalandırma basınç yoluyla hava-out Vana Vana yavaş yavaş açarak kontrol edilebilir. Daha hızlı drenaj, kalın film. Uygulamada, film kalınlığı Formvar akış hızı düşük tahmin etmek zordur çünkü biz Formvar filmlerin birkaç toplu hazırlamak ve onların kalınlığı AFM tarafından kontrol (adım 2 bakınız).
  6. Slayt odasından kaldırın ve kibar bir şekilde herhangi bir sıvı Formvar kaldırmak için filtre kağıdına kuru.
  7. 20 mm x 50 mm dikdörtgen bir tıraş bıçağı ile Formvar filmden kesip.
  8. Bir ölçek temiz distile su ile doldurun ve yavaş yavaş slayt dikey olarak filmin yüzer suya dalma: film su yüzeyine float.
  9. Yer kuru aseton temizlenmiş ızgaralar üzerinde film, parlak ön yüz yukarıda.
  10. Yuvarlak cam coverslip (Ø 12 mm) birkaç ızgaralar yerleştirin. Bu coverslip film kalınlığı ölçmek için hizmet edecek (adım 2 bakınız).
  11. Bir mikroskop slayt sığdırmak için yeniden boyutlandırılmış bir beyaz sopa ile kapak. Bütün film için slayt bağlıdır kadar slayt dikey kayan Formvar film sınırında daldırma. Aşırı su filtre kağıdı ile slayt kaldırmak ve oda sıcaklığında gecede kurumaya bırakın.

2. Film kalınlığı ölçümü

  1. Coverslip çevresinde Formvar slayttan ayırmak için cımbız ile kesti.
  2. Coverslip altında kılavuzunun bir kalemle işaretlemek.
  3. Coverslip ayırmak için Formvar işaretli kılavuz çevresinde kesin. Bu nedenle film kalınlığı ölçmek için izin verir kalan Formvar sayfasının içinde bir delik olacak. Coverslip PBS ile kapak ve bir cam slayt mikroskop üzerinde yerleştirin.
  4. Bir silikon nitrür prensibine göre altın şerit bahar ipucu tarafından kapsanmayan emin AFM cam blok bağlama.
    Not: Duyarlılığı ve bahar sabiti prensibine göre daha önce PBS içinde kalibre varsa.
  5. Cam blok AFM modülü üzerine monte ve modül mikroskop üzerine yerleştirin.
  6. Formvar kaplı coverslip Gözlem odası yerleştirin ve PBS 500 µL ile kapağı.
  7. Formvar sayfası AFM iletişim modu ve 0.5 nN kuvvet ayar noktası olarak kullanarak delik kenarlığını inceden inceye gözden geçirmek.
  8. Cam coverslip yüzey boy ölçümleri için başvurmak ve Formvar kalınlık kesit yüksekliğini olarak değerlendirmek (Formvar toplu iş başına en az 10 ölçümleri gerçekleştirmek).

3. tohum hücreleri üzerinde ızgaralar

  1. Steril bir başlık altında bir şerit (12 mm x 3 mm) çift taraflı yapışkan bant bir coverslip koy.
  2. Formvar kaplı ızgara cımbızla ve (sadece ızgara kenarında teybe bağlı olması gerekir) yapıştırıcı şerit üzerinde ters koydu. Formvar film coverslip karşısında gereken.
  3. Bu cihaz bir kültürde de koy.
  4. Yer RPMI 104 makrofajlar içeren FCS olmadan bir 10 µL damlacık insan monosit16' dan farklı.
    Not: Formvar kaplama zarar önlemek için pipet ucu kılavuzla dokunmak emin olun.
  5. 30 dk (37 ° C, % 5 CO2) uygun hücreleri izin vermek için kuluçkaya.
  6. Kadar iyi 2 mL % 10 FCS içeren RPMI ile doldurun.
  7. Aygıt hücreleri AFM gözlem önce uygun izin için 37 ° C ve % 5 CO2 2 h için kuluçkaya.

4. Podosome kaynaklı deformasyonlar topografya ölçümleri

  1. İki katına taraflı yapışkan bant iki şeritler bir cam alt Petri kabına sadık.
    Not: İki şeritler arasındaki mesafe kılavuz çapı daha küçük olmalıdır.
  2. Dikkatle makrofajlar yapışkan bandı üzerinden ile kaplama Kılavuzu bağlantısını kesin.
  3. Izgarayı cam dış yüzey hücreleri için ters çevirmek ve Izgarayı iki yapışkan şeritleri arasında sopa.
  4. Izgarayı iki ile yeni iki katına taraflı yapışkan şeritler Düzeltme: kılavuz böylece merkezi alan kılavuz AFM ipucu için erişilebilir bırakarak iki yapışkan şeritleri arasında gözükeceksin.
    Not: ızgara tamir ve değil bükülmüş emin olun; Aksi takdirde AFM prensibine göre Formvar yüzey yaklaşmak mümkün olmayabilir.
  5. Petri kabına 10 mM HEPES (pH 7,4) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış 37 ° C Kültür ortamının (RPMI % 10 FCS ile) 2 mL ile doldurun.
  6. Kültür tabak bir 37 ° C yemek ısıtıcı yerleştirin.
  7. Yemek ısıtıcı AFM sahne alanı'nda yükleyin.
  8. 37 ° C'de stabilize sistem izin
  9. Kişi modu bir 0.5 nN kuvvetle podosomes bulmak için bir ilk küresel görüntü olun ve 3 Hz değerinde Formvar topografya ile yaklaşık 20 nm büyük pixel inceden inceye gözden geçirmek.
    Not: ızgara kenarlarına tarama kaçının.

Sonuçlar

Yukarıdaki Protokolü makrofaj podosomes Formvar substrat üzerine tarafından uygulanan çıkıntı kuvvetleri ölçmek için deneysel kurulum hazırlamak açıklar. Bu AFM kullanarak elde edilir ve Şekil 1' de gösterilmiştir.

JPK veri işleme yazılımı kullanarak podosomes altında çıkıntı topografik bir görüntüsünü analiz ederken, uygun bir üçüncü derece polinom her tarama sat?...

Tartışmalar

Malzeme özellikleri

Formvar, bizim durumumuzda deforme membran için malzeme seçimi birkaç şartları yerine getirmek gerekiyor. Malzeme için görünür ışık şeffaf olması ve gözlemler parlak alan ve floresan mikroskopi izin vermek için sınırlı otomatik floresans sergilemek gerekir. İnce film pürüzlülüğü de 10 olmalıdır nm açık hücre kaynaklı çıkıntılar gözlenmesi AFM görüntüleme tarafından izin veren ve hücre adezyon topografik herhangi bi...

Açıklamalar

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar ilk katkılarından dolayı bu eser ve Matthieu Sanchez ve Françoise Viala için video filme ve düzenleme ile yardım için Anna Labernadie, Guillaume Charrière ve Patrick Delobelle için minnettarız. Bu eser l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planı kanser, Fondation Toulouse kanser ve insan sınır bilim programı (RGP0035/2016) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
200 mesh nickel gridsElectron Microscopy SciencesG200-Ni
Filter paperSigma-Aldrich1001-055
Microscope slidesFisher Scientific10235612
White stickers 26 x 70 mmAveryDP033-100
Film casting device with valve in its outletElectron Microscopy Sciences71305-01
RazorbladesElectron Microscopy Sciences72000
EthanolVWR1.08543.0250
AcetoneVWR20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichlorideElectron Microscopy Sciences15820
12 mm coverslipsVWR631-0666
Inverted microscopeCarl ZeissAxiovert 200
Atomic Force MicroscopeJPK InstrumentsNanoWizard III
Temperature-controlled sample holder JPK InstrumentsBioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/mVeeco InstrumentsMLCT-AUHW
PBSGibco14190-094
Double-sided adhesive tapeAPLI AGIPA118100
RPMI 1640Gibco31870-025
FCSSigma-AldrichF7524
HEPES Sigma-AldrichH0887
35 mm glass-bottom Petri dishesWPIFD35-100

Referanslar

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
  5. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  6. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
  7. Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
  8. Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
  9. Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
  10. Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
  11. Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
  12. Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
  13. Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
  14. Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
  15. Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
  16. Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
  17. Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
  18. Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
  19. Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
  20. Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
  21. Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
  22. Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
  23. Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
  24. Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
  25. Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 136h cre mekani ik nt kuvvetatomik kuvvet mikroskobuPodosomemakrofaj

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır