Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

Resumen

Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

Resumen

En numerosos contextos biológicos, las células animales necesitan interactuar físicamente con su entorno mediante el desarrollo de las fuerzas mecánicas. Entre ellas, las fuerzas de tracción han sido bien caracterizadas, pero hay una falta de técnicas que permite la medición de las fuerzas de protrusión ejercida por células ortogonalmente a su substrato. Se diseñó un montaje experimental para medir las fuerzas de protrusión ejercidas por las células adherentes a su substrato. Células sobre una hoja de Formvar compatible con este sustrato deforman y la topografía resultante se asigna por microscopía de fuerza atómica (AFM) en la escala de nanómetros. Valores de fuerza se extraen luego de un análisis del perfil de deformación basado en la geometría de las estructuras celulares protrusivo. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las unidades individuales que sobresale de una célula viva pueden medirse con el tiempo. Esta técnica permite el estudio de generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión. Aquí, Describimos su aplicación para medir las fuerzas protrusivo generadas por podosomes formado por macrófagos humanos.

Introducción

Las células animales interactúan físicamente con la matriz y las otras células que constituyen su medio ambiente¹. Esto es necesario para que puedan migrar, internalizar cuerpos, adquirir información externa o distinguir. En tales procesos, la célula debe generar fuerzas mecánicas y, como han demostrado numerosos estudios en los últimos años, la capacidad de una célula para generar fuerzas y probe su entorno influye en su comportamiento biológico, dirigir por ejemplo proliferación o diferenciación de^2,3. A su vez, la medición de fuerzas celulares es una ayuda importante para estudiar la regulación de la generación de fuerzas y comprender su implicación en la célula comportamiento y tejido destino^4,5.

Años recientes han presenciado el desarrollo de numerosas técnicas para medir las fuerzas que una célula puede ejercer sobre su medio ambiente⁶. La mayoría de ellos ha sido instrumental en revelar que la tracción las fuerzas que las células ejercen como tiran en sondas móviles o un substrato deformable. Sin embargo, las fuerzas mecánicas involucradas en protrusión en el ambiente extracelular sufren de una falta de técnicas de medición y hasta la fecha no bien caracterizado.

Para superar esta limitación, se presenta un método para medir las fuerzas ejercidas ortogonalmente al sustrato. Consiste en las células vivas en una fina lámina elástica que pueden deformarse en la dirección ortogonal, lo que es posible medir la deformación del sustrato por las células y deducir las fuerzas implicadas de la galjanoplastia. Topografía del sustrato se mide con una resolución de nanoescala utilizando microscopía de fuerza atómica y la evaluación de las fuerzas de deformación se basa en el conocimiento de la geometría de las estructuras celulares protrusivo^{7,8, 9}.

Aquí, describimos la configuración y su aplicación para medir las fuerzas generadas por podosomes, estructuras de protrusión de la adherencia, formadas por los macrófagos para su migración mesenquimal en entornos tridimensionales^{10,11, 12,13,14,15,16,17}. Creemos que esta técnica será avanzar en el entendimiento de la generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión.

Protocolo

1. elaboración de rejillas de Formvar recubierto

1. Limpiar rejillas de microscopia electrónica con acetona pura y seca sobre papel filtro. Luego limpiar el portaobjetos de un microscopio con etanol puro, limpie con un papel de lente y quite el polvo con un soplador.
2. Colocar un portaobjetos de vidrio limpieza de etanol verticalmente en el embudo de un dispositivo de colada de película que contiene una solución de Formvar en la parte inferior. Cubrir la parte superior del embudo.
3. Bomba de 100 mL de solución de Formvar (0.5% en dicloruro de etileno) con el bulbo atomizador hasta que alcanza las dos terceras partes de la diapositiva.
4. Mantener la corredera en la solución durante 1 minuto.
5. Abra la válvula del dispositivo para drenar la solución de Formvar en un flujo constante. Un caudal de 10 a 15 mL/s producirá una película de Formvar de 30-80 nm. El espesor de la película se determina por la concentración de la solución de Formvar y por la tasa de drenaje.
   Nota: La tasa de drenaje puede controlarse por la presión a través de la válvula de salida de aire de ventilación abriendo lentamente la válvula. Más rápido el drenaje, cuanto más gruesa la película. En la práctica, porque es difícil predecir el espesor de la película de la tasa de flujo de Formvar, preparamos varios lotes de películas de Formvar y controlar su espesor por AFM (véase paso 2).
6. Retire el portaobjetos de la cámara y secar delicadamente en papel de filtro para eliminar cualquier líquido Formvar.
7. Cortar un rectángulo de 20 x 50 mm de la película de Formvar con una cuchilla de afeitar.
8. Llene un vaso de precipitados con agua destilada y sumergirse lentamente el portaobjetos verticalmente en el agua para flotar fuera de la película: la película debe flotar sobre la superficie del agua.
9. Lugar seco acetona limpia las rejillas en la película, brillante hacia arriba.
10. Coloque un cubreobjetos de vidrio redonda (Ø 12 mm) en algunas de las rejillas. Este cubreobjetos servirá para medir el espesor de la película (véase paso 2).
11. Cubrir el portaobjetos de un microscopio con una pegatina blanca cambia el tamaño para colocarlo. Sumerja la diapositiva verticalmente en la frontera de la película de Formvar flotante hasta que toda la película se adhiera al portaobjetos. Quitar exceso de agua de lo portaobjetos con papel de filtro y dejar secar a temperatura ambiente durante la noche.

2. medición del espesor de la película

1. Corte el Formvar alrededor el cubreobjetos con las pinzas para separar de la diapositiva.
2. Marque la ubicación de la rejilla bajo el cubreobjetos con un lápiz.
3. Corte el Formvar alrededor de la rejilla marcada para desprenderse del cubreobjetos. Por lo tanto habrá un agujero en la hoja restante de Formvar, que permitirá medir el espesor de la película. Cubrir el cubreobjetos con PBS y se coloca sobre un portaobjeto en el microscopio.
4. Montar un voladizo de nitruro de silicio en el bloque de cristal AFM, asegurándose de que la raya de oro no está cubierta por la punta del muelle.
   Nota: La sensibilidad y la constante elástica del voladizo deben haberse previamente calibrados en PBS.
5. Monte el bloque de vidrio en el módulo AFM y luego colocar el módulo en el microscopio.
6. Colocar el cubreobjetos de Formvar recubierto en la cámara de observación y cubrirla con 500 μl de PBS.
7. Explorar la frontera del agujero en la hoja de Formvar utilizando AFM en modo de contacto y un punto de ajuste de fuerza de 0.5 nN.
8. Utilizar la superficie del cubreobjetos de vidrio como la referencia para la medición de la altura y evaluar el grosor de Formvar que la altura de la sección transversal (realizar al menos 10 mediciones por Formvar lote).

3. siembra de células en redes

1. Bajo una campana de estéril, coloque una tira (12 mm x 3 mm) de cinta adhesiva de doble cara en un cubreobjetos.
2. Corte una cuadrícula Formvar recubierto con pinzas y ponerlo boca abajo sobre la cinta adhesiva (sólo el borde de la red necesita ser atado a la cinta). La película de Formvar debe enfrentar el cubreobjetos.
3. Poner este dispositivo en una cultura así.
4. Coloque una gota de 10 μl de RPMI sin FCS que contiene 10 macrófagos⁴ distinguidos de monocitos humanos¹⁶.
   Nota: Asegúrese de no tocar la red con la punta de la pipeta para evitar dañar el revestimiento de Formvar.
5. Incubar durante 30 min (37 ° C, 5% CO₂) para dejar que las células se adhieren.
6. Llenar el pozo con 2 mL de RPMI con 10% FCS.
7. Incubar el dispositivo por 2 h a 37 ° C y 5% CO₂ para dejar que las células se adhieren antes de observación AFM.

4. topografía mediciones de deformaciones inducidas por Podosome

1. Pegar dos tiras de cinta adhesiva de doble cara en un fondo de cristal plato de Petri.
   Nota: La distancia entre las dos tiras debe ser más pequeña que el diámetro de la rejilla.
2. Cuidadosamente separe la rejilla plateada con los macrófagos de la cinta adhesiva.
3. Invierta la red para tener las células hacia el vidrio y la red entre las dos tiras de adhesivo se pega.
4. Fijar la rejilla con dos nuevas tiras de adhesivo doble cara: la red así se se intercala entre dos tiras de adhesivo, dejando la zona central de la red de acceso a la punta AFM.
   Nota: Asegúrese de que la red es bien fija y no doblada; de lo contrario el voladizo AFM no podrían acercarse a la superficie de Formvar.
5. Llene la caja Petri con 2 mL de medio de cultivo previamente calentadas 37 ° C (RPMI con 10% FCS) suplementado con 10 mM HEPES (pH 7.4).
6. Coloque la placa de cultivo en un calentador de plato de 37 ° C.
7. Instale el calentador de plato en el escenario de la AFM.
8. Deje que el sistema se estabilice a 37 ° C.
9. En modo de contacto con una fuerza de 0,5 nN, hacer una primera imagen global para localizar podosomes y después explorar la topografía de Formvar a 3 Hz con un pixel aproximadamente 20 nm-grande.
   Nota: Evitar analizar cerca de los bordes de la rejilla.

Resultados

El protocolo de arriba describe cómo preparar la configuración experimental para cuantificar la fuerza saliente por macrófagos podosomes en un substrato de Formvar. Esto se consigue utilizando AFM y se ilustra en la figura 1.

Al analizar una imagen topográfica de protuberancias debajo de podosomes usando el software de procesamiento de datos JPK, un polinomio de tercer grado ajuste debe restarse...

Discusión

Propiedades de los materiales

La elección del material de la membrana deformable, en nuestro caso Formvar, debe cumplir con unos requisitos. El material debe ser transparente a la luz visible y exhiben fluorescencia auto limitada para permitir observaciones en campo brillante y microscopía de fluorescencia. La rugosidad de la capa fina debe estar muy por debajo de 10 nm para evitar efectos topográficos sobre la adhesión celular y para permitir la observación clara de las ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100