Выступ силовой микроскопии: Метод количественного определения сил, разработанный ячейки выступов

Резюме

Здесь мы подробно экспериментальные методы, используемые для оценки силы выступа, которые podosomes применить на совместимый фильм, от подготовки фильма для автоматизированного анализа топографических изображений.

Аннотация

В многочисленных биологических контекстах животных клеток необходимо физически взаимодействовать с окружающей их средой путем разработки механических сил. Среди них тяговой силы были хорошо изученных, но существует нехватка технологий, позволяя измерения силы выступ, оказываемое клетки ортогонально к их основанию. Мы разработали экспериментальной установки для измерения силы выступ, оказываемое адэрентных клеток на их поверхности. Клетки, покрытие на листе совместимый Formvar деформируют этот субстрат и результате топографии сопоставляется с атомно-силовой микроскопии (АСМ) в нанометровом масштабе. Затем значения извлекаются из анализ деформации профиля на основе геометрии выступающем клеточных структур. Таким образом силы, оказываемое отдельных выступающих единиц живой клетки может быть измерена с течением времени. Этот метод даст возможность изучения формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа. Здесь мы описываем его применение для измерения выступающем силы, порожденные podosomes, образованного человека макрофагов.

Введение

Животных клеток физически взаимодействовать с матрицы и другие клетки, которые составляют их окружающей среды¹. Это требуется для их переноса, усваивать органы, приобретать внешней информации или дифференцировать. В таких процессах, ячейка должна генерировать механических сил и, как показывают многочисленные исследования за последние годы, способность ячейки для создания сил и зонд окружающей среды влияет на его биологического поведения, например направляя распространения или дифференциация^2,3. В свою очередь измерение сотовой сил является основной помощи изучить правила формирования сил и понять ее последствия в клетки тканей и поведение судьба^4,5.

Последние годы стали свидетелями многочисленных методов для измерения силы, которые ячейки может оказать на ее окружающей среде⁶. Большинство из них играют важную роль в раскрытии что тяговых сил, что клетки оказывают как они тянут на мобильных зондов или деформируемые субстрата. Однако механических сил, участвующих в выступ в внеклеточной окружающую среду страдают от отсутствия методов измерения и являются на сегодняшний день не характерны.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы представляем метод измерения силы оказываемого ортогонально к подложке. Он состоит в покрытие живых клеток на листе тонкой упругой, могут деформироваться в ортогональных направлении, что делает его возможным для измерения деформации подложки клеток и вывести силы, участвующие. Субстрат топографии измеряется с наночастицами резолюции с помощью атомно-силовой микроскопии и оценки сил от деформации опирается на знание геометрии выступающем клеточных структур^{7,8, 9}.

Здесь мы описываем установку и его применение для измерения силы, порожденные podosomes, выступающем адгезии структуры, образованные макрофаги их мезенхимальных миграции в трехмерных средах^{10,11, 12,13,14,,1516,17}. Мы считаем, что этот метод будет заранее понимание формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа.

протокол

1. Подготовка Formvar покрытием сетки

1. Очистить сетки электронной микроскопии с чистым ацетоном и высушите их на фильтровальной бумаге. Затем очистить микроскопа с чистого этанола, протрите объектив бумаги и удалите пыль с вентилятором.
2. Место очистке этанола стеклянное скольжение по вертикали в воронку фильм литья устройства, содержащего раствор Formvar в нижней части. Крышка в верхней части воронки.
3. Насос 100 мл Formvar раствора (0,5% в дихлорэтана) с лампой атомайзера до тех пор, пока уровень достигнет двух третей слайда.
4. Сохранить слайд в решении за 1 мин.
5. Откройте клапан устройства для слива раствора Formvar в устойчивый поток. Скорость потока от 10 до 15 мл/сек даст Formvar фильм 30-80 Нм. Толщина пленки определяется концентрация раствора Formvar и скорость дренажа.
   Примечание: Уровень дренаж может управляться вентиляции давления через клапан воздуха выход, медленно открытия клапана. Чем быстрее дренаж, тем толще фильм. На практике, потому что это трудно предсказать, толщина пленки от Formvar скорость потока, мы готовим несколько партий Formvar фильмов и контролировать их толщину AFM (см. шаг 2).
6. Удалить слайд из камеры и высушить его тонко на фильтровальной бумаге, чтобы удалить любые жидкости Formvar.
7. Вырежьте прямоугольник 20 x 50 мм из Formvar фильма с лезвием бритвы.
8. Заполнить стакан с чистой дистиллированной водой и медленно окунуться слайд вертикально в воду плавать от фильма: фильм следует плавают на поверхности воды.
9. Место сухой очищены ацетон сетки на пленке, блестящие лицом вверх.
10. Поместите круглые стекло coverslip (Ø 12 мм) на несколько сеток. Этот coverslip будет служить для измерения толщины пленки (см. шаг 2).
11. Обложка микроскопа с белой наклейкой подогнан к размеру его. Погрузите слайд вертикально на границе плавающей Formvar фильма до тех пор, пока весь фильм придерживается к слайду. Удалите лишнюю воду из слайда с фильтровальной бумаги и дайте высохнуть на ночь при комнатной температуре.

2. Измерение толщины пленки

1. Вырежьте Formvar вокруг coverslip с помощью пинцета, чтобы отсоединить его от слайда.
2. Марк расположение сетки под coverslip с ручкой.
3. Вырежьте Formvar вокруг отмеченные сетки, чтобы отсоединить его от coverslip. Поэтому будет отверстие в оставшихся Formvar лист, который позволит измерить толщины пленки. Обложка coverslip с PBS и поместите его на слайде стекло микроскопа.
4. Смонтируйте консольные нитрида кремния на AFM стеклянный блок, убедившись, что золотой полосой не охватывается кончик пружины.
   Примечание: Чувствительность и весной константа кантилевера должны ранее был откалиброван в PBS.
5. Смонтировать блок стекла на AFM модуль, а затем поместите модуль на Микроскоп.
6. Место coverslip Formvar покрытием на камеры наблюдения и покрыть ее с 500 мкл PBS.
7. Проверьте границы отверстия в Formvar листа с помощью AFM в режим контакта и набор силы 0.5 nN.
8. Использовать coverslip поверхности стекла в качестве ссылки для измерения высоты и оценить толщину Formvar как высота сечения (выполнить по крайней мере 10 измерений в пакете Formvar).

3. Заполнение ячеек сетки

1. Под капотом стерильные Положите полосы (12 мм x 3 мм)-двухсторонней клейкой ленты на coverslip.
2. Вырезать из Formvar покрытием сетки с помощью пинцета и положить ее вверх вниз на клейкой лентой (только край сетки должен прилагаться к ленте). Formvar фильм должен противостоять coverslip.
3. Хорошо положите устройство в культуре.
4. Место 10 мкл капли RPMI без FCS, содержащие 10⁴ макрофагов отличается от человека моноциты¹⁶.
   Примечание: Убедитесь, чтобы не задеть сетки с кончиком пипетки для предотвращения повреждения покрытия Formvar.
5. Инкубируйте 30 мин (37 ° C, 5% CO₂), чтобы позволить придерживаться клетки.
6. Заполните вверх наилучшим образом с 2 мл RPMI, содержащие 10% FCS.
7. Инкубируйте устройство для 2 ч при 37 ° C и 5% CO₂ чтобы клетки присоединиться до AFM наблюдения.

4. топография измерений индуцированных Podosome деформаций

1. Палка две полоски удвоилось сторонний Скотч на дно стеклянной чашке Петри.
   Примечание: Расстояние между двумя полосками должно быть меньше, чем диаметр сетки.
2. Аккуратно отсоедините сетки покрытые макрофагов с клейкой лентой.
3. Переверните сетке для того чтобы иметь клетки, сталкивается с стекла и придерживаться сетки между двумя клейкие полоски.
4. Исправление, сетки с двумя новые полосы удвоилось сторонняя клея: сетки таким образом быть зажатой между двумя клейкие полоски, оставляя доступным для AFM кончик центральной области сетки.
   Примечание: Убедитесь, что сетка хорошо фиксируется и не перекручены; в противном случае AFM консольные может быть не смогли подойти на Formvar поверхность.
5. Заполните чашку Петри с 2 мл питательной среды подогретую 37 ° C (RPMI с 10% FCS) дополнены 10 мм HEPES (рН 7,4).
6. Место культуры блюдо на подогреватель блюдо 37 ° C.
7. Установите обогреватель блюдо на сцене AFM.
8. Пусть система стабилизации при 37 ° C.
9. В режим контакта с силой 0.5 nN сделать первый глобальный образ для обнаружения podosomes и затем проверять Formvar рельеф на 3 Гц с приблизительно 20 Нм большой пиксель.
   Примечание: Избегайте, сканирование по краям сетки.

Результаты

Вышеупомянутый Протокол описывается подготовка экспериментальной установки для количественного определения силы выступ, применяемые макрофагов podosomes на подложке Formvar. Это достигается с помощью АСМ и проиллюстрирована на рисунке 1.

Обсуждение

Свойства материала

Выбор материала для деформируемых мембраны, в нашем случае Formvar, необходимо выполнить несколько требований. Материал должен быть прозрачным для видимого света и выставку ограниченное auto флуоресценции позволяющие наблюдений в светлые област...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100