Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

Riepilogo

Qui, abbiamo dettaglio le tecniche sperimentali utilizzate per valutare le forze di protrusione che podosomes si applicano su una pellicola compatibile, dalla preparazione del film per l'analisi automatizzata delle immagini topografiche.

Abstract

In numerosi contesti biologici, cellule animali hanno bisogno di interagire fisicamente con il loro ambiente attraverso lo sviluppo di forze meccaniche. Tra questi, le forze di trazione sono stati ben caratterizzate, ma c'è una mancanza di tecniche che permettono la misurazione delle forze protrusione esercitata dalle cellule ortogonalmente al loro substrato. Abbiamo progettato un setup sperimentale per misurare le forze di protrusione esercitate dalle cellule aderenti il loro substrato. Cellule piastrate su un foglio di Formvar compatibile con questo substrato di deformazione e la topografia risultante è mappata per microscopia a forza atomica (AFM) su scala nanometrica. I valori di forza vengono quindi estratti da un'analisi del profilo deformazione basato sulla geometria delle strutture cellulari protrusive. Quindi, le forze esercitate dalle singole unità sporgente di una cellula vivente possono essere misurate nel tempo. Questa tecnica consentirà lo studio della generazione di forza e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione. Qui, descriviamo la sua applicazione per misurare le forze protrusive generate da podosomes formata dai macrofagi umani.

Introduzione

Cellule animali interagiscono fisicamente con la matrice e le altre cellule che costituiscono il loro ambiente¹. Ciò è necessario per loro di migrare, interiorizzare corpi, acquisire informazioni esterne o differenziare. In tali processi, la cella deve generare forze meccaniche e, come numerosi studi hanno dimostrato negli ultimi anni, la capacità di una cellula di generare forze e sonda ambiente influenza il comportamento biologico, dirigendo per esempio proliferazione o differenziazione^2,3. A sua volta, la misurazione delle forze cellulare è un aiuto importante per studiare la regolazione della forza di generazione e capire la sua implicazione nella cella comportamento e tessuto destino^4,5.

Ultimi anni hanno visto lo sviluppo di numerose tecniche per misurare le forze che una cella può esercitare sul suo ambiente⁶. La maggior parte di questi è stati strumentale nel rivelare che la trazione delle forze che cellule esercitano come si tirano su sonde mobili o un substrato deformabile. Tuttavia, le forze meccaniche coinvolte in protrusione nell'ambiente extracellulare soffrono di una mancanza di tecniche di misurazione e sono fino ad oggi non è ben caratterizzato.

Per ovviare a questa limitazione, presentiamo un metodo per misurare forze esercitate ortogonalmente al substrato. Essa consiste nella placcatura cellule viventi in un sottile foglio elastico che può deformare in direzione ortogonale, che permette di misurare la deformazione di substrato dalle cellule e dedurre le forze coinvolte. Topografia di substrato è misurata con risoluzione nanometrica mediante microscopia a forza atomica e la valutazione delle forze di deformazione si basa sulla conoscenza della geometria delle strutture cellulari protrusiva^{7,8, 9}.

Qui, descriviamo l'installazione e la sua applicazione per misurare le forze generate dal podosomes, strutture di adesione protrusiva formate dai macrofagi per la loro migrazione mesenchimale in ambienti tridimensionali^{10,11, 12,13,14,15,16,17}. Noi crediamo che questa tecnica avanzerà la comprensione della creazione delle forze e la sua regolamentazione in molti processi cellulari che coinvolgono la protrusione.

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Protocollo

1. preparazione di griglie rivestite con Formvar

1. Pulire le griglie di microscopia elettronica con acetone puro e farle asciugare su carta da filtro. Quindi pulire un vetrino da microscopio con etanolo puro, pulire con una carta per lenti e rimuovere la polvere con un soffietto.
2. Posto un vetrino pulito etanolo verticalmente nell'imbuto di un dispositivo di fusione pellicola contenente una soluzione di Formvar nella parte inferiore. Coprire la parte superiore dell'imbuto.
3. Con la lampadina atomizzatore pompa 100 mL di soluzione di Formvar (0,5%, dicloruro di etilene) fino a quando il livello raggiunge due terzi della diapositiva.
4. Mantenere il vetrino nella soluzione per 1 min.
5. Aprire la valvola del dispositivo per drenare la soluzione di Formvar in un flusso costante. Una portata di 10 a 15 mL/s produrrà un film Formvar di 30-80 nm. Lo spessore del film è determinato dalla concentrazione della soluzione Formvar e per il tasso di drenaggio.
   Nota: Il tasso di drenaggio può essere controllata scaricando la pressione tramite la valvola aria aprendo lentamente la valvola. Il più veloce il drenaggio, il più spesso il film. In pratica, perché è difficile da predire lo spessore del film dalla portata Formvar, prepariamo diversi lotti di Formvar film e controllare il loro spessore di AFM (vedi passo 2).
6. Rimuovere il vetrino dalla camera e asciugarlo delicatamente su carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido Formvar.
7. Tagliare un rettangolo di 20 x 50 mm dal film Formvar con una lama di rasoio.
8. Riempire un bicchiere con acqua distillata e immergersi lentamente la diapositiva verticalmente in acqua per galleggiare fuori la pellicola: il film deve galleggiare sulla superficie dell'acqua.
9. Luogo asciutto pulito acetone griglie sulla pellicola, splendente verso l'alto.
10. Posizionare un coprioggetto in vetro tondo (Ø 12 mm) su alcune delle griglie. Questo vetrino coprioggetti servirà a misurare lo spessore del film (vedi passo 2).
11. Coprire un vetrino da microscopio con un adesivo bianco ridimensionato per adattarlo. Immergere la diapositiva verticalmente al bordo del film Formvar galleggiante fino a quando l'intero film aderisce alla diapositiva. Rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino con carta da filtro e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.

2. misurazione dello spessore del Film

1. Tagliare il Formvar intorno il coprioggetto con pinzette per staccarlo dalla diapositiva.
2. Segnare la posizione della griglia sotto il vetrino coprioggetto con una penna.
3. Tagliare il Formvar intorno alla griglia contrassegnata per staccarla dal vetrino coprioggetti. Pertanto non vi sarà un buco nello strato Formvar rimanente, che verranno permetterà di misurare lo spessore del film. Coprire il vetrino coprioggetto con PBS e collocarla su un vetrino sul microscopio.
4. Montare un cantilever di nitruro di silicio sul mattone di vetro AFM, assicurandosi che la striscia dorata non è coperto dalla punta della molla.
   Nota: La sensibilità e la costante elastica del cantilever dovrebbe avere precedentemente stati calibrati in PBS.
5. Montare il blocco di vetro sul modulo del AFM e quindi posizionare il modulo sul microscopio.
6. Collocare il vetrino coprioggetto rivestite con Formvar sulla camera di osservazione e coprirlo con 500 µ l di PBS.
7. Il bordo del foro nel foglio Formvar utilizzando AFM in modalità di contatto e un punto di regolazione forza di 0,5 nN la scansione.
8. Utilizzare la superficie del vetrino coprioggetti di vetro come il riferimento per misure di altezza e valutare lo spessore di Formvar come l'altezza della sezione trasversale (eseguire almeno 10 misurazioni per ogni batch di Formvar).

3. cellule su griglie di semina

1. Sotto una cappa sterile, mettere una striscia (12 x 3 mm) del nastro bi adesivo su un vetrino coprioggetti.
2. Tagliare una griglia Formvar-rivestito con pinzette e metterlo a testa in giù sulla striscia adesiva (solo il bordo della griglia deve essere attaccata al nastro). Il film di Formvar deve affrontare il vetrino coprioggetti.
3. Mettere il dispositivo in una cultura ben.
4. Mettere una goccia di 10 µ l di RPMI senza FCS contenente 10⁴ macrofagi differenziati da monociti umani¹⁶.
   Nota: Assicurarsi di non toccare la griglia con la punta della pipetta per evitare di danneggiare il rivestimento di Formvar.
5. Incubare per 30 min (37 ° C, 5% CO₂) che le cellule aderiscono.
6. Riempire il pozzo con 2 mL di RPMI contenente 10% FCS.
7. Incubare il dispositivo per 2 ore a 37 ° C e 5% di CO₂ di lasciare le cellule aderiscono prima osservazione AFM.

4. topografia misure delle deformazioni indotte da Podosome

1. Attaccare due strisce di raddoppiato-nastro biadesivo su un fondo di vetro capsula di Petri.
   Nota: La distanza tra le due strisce dovrebbe essere inferiore al diametro di griglia.
2. Staccare con cura la griglia placcata con macrofagi dal nastro adesivo.
3. Capovolgere la griglia al fine di avere le cellule rivolto verso il vetro e la griglia tra le due strisce adesive di bastone.
4. Correzione della griglia con due nuove strisce di adesivo raddoppiato: la griglia sarà così essere intramezzata fra due strisce adesive, lasciando l'area centrale della griglia accessibile a punta dell'AFM.
   Nota: Assicurarsi che la griglia è ben fissata e non attorcigliata; altrimenti il cantilever AFM potrebbe non essere in grado di avvicinarsi alla superficie di Formvar.
5. Riempire la capsula di Petri con 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldata 37 ° C (RPMI con 10% FCS) completati con 10 mM HEPES (pH 7.4).
6. Posizionare la piastra di coltura su un riscaldatore di piatto di 37 ° C.
7. Installare il riscaldatore di piatto sul palco AFM.
8. Lasciare che il sistema si stabilizza a 37 ° C.
9. In modalità a contatto con una forza di 0,5 nN, fare una prima immagine globale per individuare podosomes e poi la scansione la topografia di Formvar a 3 Hz con un circa 20 nm-grande pixel.
   Nota: Evitare l'analisi vicino ai bordi della griglia.

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Risultati

Il protocollo di cui sopra viene descritto come preparare la messa a punto sperimentale di quantificare le forze di protrusione applicate dal macrofago podosomes su un substrato di Formvar. Questa operazione viene eseguita mediante AFM ed è illustrata nella Figura 1.

Quando si analizza un'immagine topografica di rigonfiamenti sotto podosomes utilizzando il software di elaborazione dati JPK, un poli...

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Discussione

Proprietà del materiale

La scelta del materiale per la membrana deformabile, nel nostro caso Formvar, deve soddisfare alcuni requisiti. Il materiale deve essere trasparente alla luce visibile e presentano fluorescenza auto limitato per consentire osservazioni in campo chiaro e microscopia a fluorescenza. La rugosità del film sottile deve essere ben di sotto di 10 nm per evitare qualsiasi effetto topografica su adesione delle cellule e per consentire la chiara osservazione de...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100