Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

Resumo

Aqui, detalhamos as técnicas experimentais utilizadas para avaliar as forças de saliência que podosomes aplicar sobre um filme compatível, desde a preparação do filme para a análise automatizada de imagens topográficas.

Resumo

Em inúmeros contextos biológicos, células animais precisam interagir fisicamente com o seu ambiente através do desenvolvimento de forças mecânicas. Entre estes, as forças de tração foram bem caracterizadas, mas há uma falta de técnicas que permite a medição de protrusão forças exercidas pelas células ortogonalmente à sua carcaça. Nós projetamos uma instalação experimental para medir as forças de protrusão exercidas pelas células aderentes em sua carcaça. Células banhadas em uma folha de Formvar compatível com deformam o substrato e a topografia resultante é mapeada por microscopia de força atômica (AFM) à escala nanométrica. Valores de força então são extraídos de uma análise do perfil deformação baseado na geometria das estruturas celulares cêntrica. Portanto, as forças exercidas pelas unidades individuais salientes de uma célula viva podem ser medidas ao longo do tempo. Esta técnica permitirá que o estudo da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão. Aqui, descrevemos o seu aplicativo para medir as forças cêntrica geradas por podosomes formado por macrófagos humanos.

Introdução

As células animais interagirem fisicamente com a matriz e as outras células que constituem o seu ambiente¹. Isso é necessário para que eles migram, internalizar os corpos, adquirir informações externas ou diferenciar. Em tais processos, a célula deve gerar forças mecânicas e, como numerosos estudos têm demonstrado ao longo dos últimos anos, a capacidade de uma célula para gerar forças e sonda ambiente influencia seu comportamento biológico, dirigindo por exemplo proliferação ou diferenciação de^2,3. Por sua vez, a medição de forças celulares é uma grande ajuda para estudar o Regulamento de geração de força e entender a sua implicação na célula destino^4,comportamento e tecido⁵.

Últimos anos têm testemunhado o desenvolvimento de inúmeras técnicas para medir as forças que uma célula pode exercer sobre seu ambiente⁶. A maioria destes têm sido fundamentais para revelar que a tração forças que células exercem como eles puxam em sondas móveis ou um substrato deformável. No entanto, as forças mecânicas envolvidas em protrusão no ambiente extracelular sofrem com a falta de técnicas de medição e são até à data não bem caracterizada.

Para contornar essa limitação, apresentamos um método para medir forças exercidas ortogonalmente ao substrato. Ela consiste no chapeamento de células vivas em uma folha fina e elástica que pode deformar-se na direção ortogonal, tornando possível medir a deformação do substrato pelas células e deduzir as forças envolvidas. Topografia de substrato é medida com resolução nanoescala usando microscopia de força atômica e a avaliação das forças de deformação baseia-se no conhecimento da geometria do cêntrica estruturas celulares^{7,8, 9}.

Aqui, descrevemos a configuração e a sua aplicação para medir as forças geradas pela podosomes, estruturas de adesão cêntrica formadas por macrófagos para sua migração mesenquimal em ambientes tridimensionais^{10,11, 12,13,14,15,16,17}. Acreditamos que esta técnica vai avançar a compreensão da geração de força e sua regulação em muitos processos celulares que envolvem protrusão.

Protocolo

1. preparação de grades Formvar-revestido

1. Limpar grelhas de microscopia eletrônica com acetona pura e secá-las com papel de filtro. Em seguida, limpe uma lâmina de microscópio com etanol puro, limpe com um papel de lente e retire a poeira com um ventilador.
2. Coloque uma lâmina de vidro limpa de etanol verticalmente no funil de um dispositivo de fundição de filme contendo uma solução de Formvar na parte inferior. Cubra a parte superior do funil.
3. Bomba de 100 mL de solução de Formvar (0,5% de dicloreto de etileno) com o bulbo atomizador até o nível atingir dois terços do slide.
4. Manter a corrediça na solução por 1 min.
5. Abra a válvula do dispositivo para drenar a solução de Formvar em um fluxo constante. Uma taxa de fluxo de 10 a 15 mL/s irá produzir um filme de Formvar de 30-80 nm. A espessura do filme é determinada pela concentração da solução de Formvar e pela taxa de drenagem.
   Nota: A taxa de drenagem pode ser controlada por abrindo lentamente a válvula de ventilação a pressão através da válvula de ar-para fora. A drenagem mais rápida, mais grosso o filme. Na prática, porque é difícil de prever a espessura da película da taxa de fluxo de Formvar, preparamos vários lotes de Formvar filmes e controlar sua espessura por AFM (consulte a etapa 2).
6. Remover o slide da câmara e secar delicadamente o papel de filtro para remover qualquer líquido Formvar.
7. Corte um retângulo de 20 x 50 mm do filme Formvar com uma lâmina de barbear.
8. Encha um copo com água destilada limpa e lentamente mergulhar o slide verticalmente na água a flutuar fora do filme: o filme deve flutuar na superfície da água.
9. Grades de acetona-limpo secos lugar no filme, brilhante face para cima.
10. Coloque algumas das grades de uma lamela de vidro redonda (Ø 12 mm). Esta lamela servirá para medir a espessura da película (consulte a etapa 2).
11. Cobri uma lâmina de microscópio com um adesivo branco redimensionado para ajustá-lo. Mergulhe o slide verticalmente na fronteira do filme Formvar flutuante até o filme inteiro adere ao slide. Remover o excesso de água do slide com papel de filtro e deixe secar à temperatura ambiente durante a noite.

2. medição de espessura de filme

1. Corte o Formvar próximo a lamela com uma pinça para desconectá-lo do slide.
2. Marque a localização da grade sob a lamela com uma caneta.
3. Corte o Formvar em torno da grade marcada para desconectá-lo da lamela. Portanto, haverá um buraco na folha Formvar restante, que permitirá medir a espessura da película. Cobrir a lamela com PBS e coloque-a sobre uma lâmina de vidro no microscópio.
4. Monte um cantilever de nitreto de silício sobre o bloco de vidro AFM, certificando-se que a listra dourada não é coberta pela ponta da primavera.
   Nota: A sensibilidade e a constante de mola do cantilever devem ter anteriormente foi calibrados em PBS.
5. Montar o bloco de vidro para o módulo AFM e em seguida, coloque o módulo no microscópio.
6. Colocar a lamela Formvar revestido na câmara de observação e cubra-o com 500 µ l de PBS.
7. Digitalize a borda do buraco na folha de Formvar usando o AFM em modo de contato e um ponto de ajuste de força nN 0,5.
8. Usar a superfície da lamela de vidro como a referência para medições de altura e avaliar a espessura de Formvar como a altura da secção transversal (executar pelo menos 10 medidas por lote de Formvar).

3. semeadura de células nas grades

1. Sob uma capa estéril, colocar uma faixa (12 x 3 mm) de fita adesiva dupla-face sobre uma lamela.
2. Cortar uma grade Formvar revestido com uma pinça e colocá-lo de cabeça para baixo sobre a fita adesiva (apenas o aro da grade deve ser anexado à fita). O filme de Formvar precisa encarar a lamela.
3. Colocar este dispositivo em uma cultura bem.
4. Coloque uma gota de 10 µ l de RPMI sem FCS contendo 10⁴ macrófagos diferenciados de monócitos humanos¹⁶.
   Nota: Certifique-se de não tocar na grelha com a ponta da pipeta para não danificar o revestimento de Formvar.
5. Incube durante 30 min (37 ° C, 5% CO₂) para permitir que células aderem.
6. Encha o poço com 2 mL de RPMI contendo 10% FCS.
7. Incube o dispositivo para 2 h a 37 ° C e 5% CO₂ deixar células aderem antes observação AFM.

4. topografia medições das deformações induzida por Podosome

1. Cole duas tiras de fita adesiva duplicou face um fundo de vidro, placa de Petri.
   Nota: A distância entre as duas tiras deve ser menor que o diâmetro da grade.
2. Cuidadosamente retire a grade chapeada com macrófagos da fita adesiva.
3. Vire a grelha invertida para que as células de frente para o vidro e enfiar a grade entre as duas tiras adesivas.
4. Fix a grade com duas novas tiras de adesivo duplicou face: grade assim vai ser imprensada entre duas tiras de adesivo, deixando a área central da grade acessível à ponta AFM.
   Nota: Certifique-se que a grade está bem fixo e não torcido; caso contrário o cantilever AFM não poderá se aproximar da superfície Formvar.
5. Encha o prato de Petri com 2 mL de meio de cultura previamente aquecida a 37 ° C (RPMI com 10% de FCS) suplementado com 10 mM HEPES (pH 7,4).
6. Coloque o prato de cultura em um aquecedor de prato de 37 ° C.
7. Instale o aquecedor de prato no palco AFM.
8. Deixe o sistema estabilizar a 37 ° C.
9. No modo de contato com uma força de 0,5 nN, fazer uma primeira imagem global para localizar podosomes e depois digitalizar a topografia de Formvar a 3 Hz com um pixel aproximadamente 20 nm-grande.
   Nota: Evite varredura perto das bordas da grade.

Resultados

O protocolo acima descreve como preparar a instalação experimental para quantificar as forças de protrusão aplicadas pelos macrófagos podosomes sobre um substrato de Formvar. Isto é conseguido usando AFM e é ilustrado na Figura 1.

Ao analisar uma imagem topográfica de protuberâncias abaixo podosomes usando o software de processamento de dados JPK, um polinômio de terceiro grau se encaixam ...

Discussão

Propriedades do material

A escolha do material para a membrana deformável, no nosso caso Formvar, precisa cumprir alguns requisitos. O material deve ser transparente à luz visível e apresentam fluorescência auto limitada para permitir as observações em campo claro e microscopia de fluorescência. A rugosidade do filme fino deve estar abaixo de 10 nm para evitar qualquer efeito topográfico na adesão celular e para permitir a observação clara das saliências induzida p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100