حصاد السم السموم من قاتل الحشرات وغيرها من الحشرات هيتيروبتيران

Summary

على الرغم من أن الكثير من الحشرات في رتيبات هيتيروبتيرا (الحشرات: Hemiptera) هي سام وتركيبتها السم ومهام تلك السموم السم في معظمها غير معروف. ويصف هذا البروتوكول أساليب حصاد السموم هيتيروبتيران لمزيد من توصيف، استخدام اليكتروستيموليشن، والتحرش، وتشريح الغدة.

Abstract

هيتيروبتيران الحشرات مثل البق الحشاشين (Reduviidae) والبق المياه العملاقة (بيلوستوماتيداي) وينحدر من سلف مشترك المفترسة والسامة، وأغلبية هيتيروبتيرانس موجودة الاحتفاظ بهذه الاستراتيجية التغذوية. وقد انتقلت بعض هيتيروبتيرانس للتغذية على دم الفقاريات (مثل تقبيل البق، Triatominae؛ وبق الفراش، سيميسيداي) في حين أن البعض الآخر قد عادت إلى التغذية على النباتات (معظم بينتاتومومورفا). ومع ذلك، استثناء اللعاب المستخدمة من قبل الخلل تقبيل تيسيرا للتغذية بالدم، والقليل المعروف عن السموم هيتيروبتيران مقارنة بالسموم العناكب والعقارب والثعابين.

عقبة واحدة لتوصيف هيتيروبتيران السم السموم هو هيكل ووظيفة الغدد السم/بنية، على حد سواء معقدة شكلياً وأداء أدوار بيولوجية متعددة (الدفاع والتقاط الفريسة، والهضم خارج الفم). في هذه المقالة، نحن تصف الأساليب الثلاثة أننا قد استخدمت بنجاح لتجميع السموم هيتيروبتيران. أولاً، نقدم electrostimulation فريسة طريقة ملائمة لجمع السم التي غالباً ما تكون قاتلة عندما حقن الحيوانات، والذي يغني عن التلوث من الأنسجة الغدية. ثانيا، نحن تبين أن التحرش لطيف من الحيوانات كافية لإنتاج قذف السم من ململه و/أو البصق في بعض المجموعات من هيتيروبتيرانس السم. ثالثا، نحن تصف أساليب حصاد السم السموم بتشريح الحيوانات فظاعتها الحصول على غدد السم. هذا الأسلوب مكمل للأساليب الأخرى، كما أنها قد تسمح للحصاد من السموم من الأصناف التي اليكتروستيموليشن والمضايقة غير فعالة. هذه البروتوكولات سوف تمكن الباحثين من حصاد السموم من الحشرات هيتيروبتيران لتوصيف وظيفة الهيكل والتطبيقات الممكنة في مجال الطب والزراعة.

Introduction

السموم هيتيروبتيران هي المواد النشطة بيولوجيا حقاً¹. على سبيل المثال، يسهل إفرازات السم/اللعاب من هيتيروبتيرا التغذية بالدم مثل تقبيل الحشرات (Triatominae) وبق الفراش (سيميسيداي) تغذية بتعطيل الأرقاء². السموم في هذه السموم تستهدف مسارات متعددة بما في ذلك تخثر الدم، وتراكم الصفائح الدموية وتضيق الأوعية، فضلا عن الألم وحكة مسارات. يتم تكييف السموم من معظم الأنواع الأخرى هيتيروبتيران تيسيرا لافتراس بدلاً من تغذية الدم. هذه السموم تسبب الشلل، الموت وتسييل الأنسجة عند حقنها في اللافقاريات^3،4. السم عند حقن الفقريات، كما قد آثار جذرية. على سبيل المثال، يؤدي الحقن بالسم من خلل قاتل إينيسي هولوتريتشيوس في الفقاريات الألم وشلل العضلات ونزيف؛ ويموت انفينوماتيد الفئران بهذا الخلل بسرعة بسبب شلل الجهاز التنفسي⁵.

وأظهرت الدراسات ترانسكريبتوميك والبروتين تكوين البروتين من بعض السموم هيتيروبتيران. السموم أنواع المفترسة غنية في البروتياز، والأنزيمات، والببتيدات والبروتينات غير معروف هيكل ووظيفة^6،،من⁷⁸الأخرى. تقبيل علة السم غنية بالبروتين تريابين الأسرة، وأعضاؤها تؤثر تأثيراً عميقا في تخثر الدم والصفيحات التجميع وتضيق الأوعية^2،9. ومع ذلك، فإنه لا يعرف السموم التي تكمن وراء معظم بيواكتيفيتيس من السم. على سبيل المثال، أبلغ السم الشوائب تقبيل Triatoma عن مسكن وتمنع قنوات الصوديوم¹⁰، ولكن تظل العناصر المسؤولة توضيح. وبالمثل، فإنه لا يعرف ما المكون (المكونات) السم خطأ قاتل يسبب الشلل أو الألم. شرط أساسي لتحديد مسؤولية بيواكتيفيتيس السم خاصة، ووصف هيكل ووظيفة رواية السم السموم، السموم هو الحصول على السم.

وقد تم الحصول على السم من هيتيروبتيرانس electrostimulation^{5،6،7،8،11،،}من¹²¹³، اﻻستفزاز من موقف دفاعي الردود^4،8، ميكانيكيا عصر الصدر^12،14،،من¹⁵¹⁶، تشريح بالسم الغدد^{8،17 ،،}من^1819،20،،من²¹²²، والتطبيق ليضع مستقبلات أستيل المسكارينيه²³. الحكم على مزايا وعيوب أي وسيلة محتملة يعقدها مورفولوجية الغدد السم هيتيروبتيران، والتي تتكون من غدة الرئيسي مع لومن منفصلة اثنين، الغدة الرئيسية الأمامي (AMG) والغدة الرئيسية الخلفي (فريق رصد السلام)، فضلا عن ترتبط الغدة التبعي (AG). هذه المقصورات الغدة مختلفة تنتج إفرازات البروتينات المختلفة، التي قد تكون متخصصة لمختلف الوظائف البيولوجية بما في ذلك القبض على الفريسة والدفاع والهضم خارج الفم^8،17. في البق قاتل بيرتيني واكتريتشودييني، ارتبطت AMG مع التقاط الفريسة وفريق رصد السلام مع الهضم خارج الفم¹⁷. بيد في هارباكتوريني علة بلاجيبينيس بريسثيسانكوس فريق رصد السلام متخصصة لالتقاط الفريسة والهضم بينما هو الافتراض AMG لإفراز السم دفاعية⁸. ووصف النائب العام كوجود وظيفة افرازية قليلاً في البق قاتل⁸ أو كموقع رئيسي لتخزين حوزتي في البق المياه العملاقة²³. ومن الواضح أن المزيد من العمل مطلوب لتوضيح وظيفة كل حجرة الغدة بين مختلف المجموعات الفرعية هيتيروبتيران، وتحديد وظيفة معظم السم السموم. في هذا التقرير يصف لنا البروتوكولات لحصاد السم السموم من هيتيروبتيرانس نحو تحقيق هذا الهدف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

هذا البروتوكول تمتثل السياسة "جامعة كوينزلاند" المبينة في الرعاية المسؤولة واستخدام الحيوانات في التدريس والبحث (PPL 4.20.11)، فضلا عن الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية في المدونة الأسترالية للرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية (8^th طبعة عام 2013).

تنبيه: الحرص على عدم تكون انفينوماتيد عند التعامل مع الأخطاء قاتل. الحرص على حماية العينين عند التعامل مع الأنواع التي يبصقون السم دفاعيا. رعاية في جميع أنحاء لا تصيب الحيوانات التجريبية. ويشمل هذا الرصد للضغط على قيود مثل الأربطة المطاطية، وضمان أن ململه لم يتم كسر.

ملاحظة: بشكل اختياري، تخدير الحيوانات قبل التعرض ل أول أكسيد الكربون₂ 0.5-2 دقيقة أو التبريد إلى 4-10 درجة مئوية قبل الحصاد السم في يهدف 1-3 لتسهيل نقل آمنة وضبط النفس. التنويم غير مطلوب تماما ولكن قد يسهل ضبط النفس الآمنة للعينات السريع أو قوية. ومع ذلك، يجب أن تكون الحيوانات مستيقظا للسماح لحصاد السم. تبقى التطبيقات المتلقين للمعلومات في الاعتبار عند اتخاذ قرار بإضافة مثبطات البروتياز أم لا.

1-حصاد السم السموم التي اليكتروستيموليشن

1. الحصول على عينات حية لحصاد السموم منه.
2. استخدام ملاقط بلاستيكية معدّة سلفا مع أقطاب الإيجابية والسلبية التي شنت على أي تلميح. قم بتوصيل ملاقط مكهرب اليكتروستيمولاتور أو مصدرا للجهد المستمر الذي يسمح التعديل للجهد.
   1. الصغيرة (~ 10 مم) والكبيرة (~ 25 مم) قاتل البق، تستخدم الفولتية ذروة 15 و 25 الخامس على التوالي.
   2. لأكبر هيتيروبتيرانس مثل البق المياه العملاقة، استخدام يصل إلى 40 الخامس.
3. كبح جماح البق يعيش بالربط منها إلى النظام الأساسي، باستخدام شريط المطاطي عبر الصدر.
4. مكان غيض ململه في تلميح جمع مناسبة. قاتل الأخطاء، استخدام تلميح ماصة P200. للأخطاء المياه العملاقة، قص أقصى قبالة تلميح P200 لزيادة حجم الفتحة.
   1. بلطف مع زوج مغلقة من ملاقط نظيفة ململه رفع ودفع الفتحة مفتوحة من طرف جمع أكثر من نهاية ململه.
   2. إذا رغبت في ذلك، امتصاص ~ 5 ميليلتر الماء عالي النقاوة قبل وضع في ململه في جمع معلومات سرية. وهذا يقلل خسائر السم المتبقية داخل معلومات سرية، على الرغم من أن السم المقطوع سوف تضعف.
5. تطبيق اليكتروستيموليشن. تراجع أقطاب كهربائية محفزة في هلام موصلة، مثل الجلسرين NaCl/50% 2.5 م. تطبيق أقطاب كهربائية للصدر. بيلوستوماتيدس، لا تنطبق قطبين الظهرية السطح الخلفي من الرأس.
6. تخزين السم لمنع أوتوديجراديشن. بعد هو مقذوف السم، بسرعة نقلها إلى أنبوب في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية، أو أنبوب يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز.
7. كرر الخطوات من 1.5 و 1.6 حتى يكتسب السم كافية أو لا السم آخر المقبلة.

2-حصاد السم السموم بالتحرش

1. إعداد الحيوانات لحصاد السم ومكان غيض من ململه في دهليز جمع، كما هو موضح في الأقسام الفرعية 1.1 و 1.3-1.4.
2. إذا كان السم هو مقذوف تلقائياً، انتقل إلى الخطوة 2، 3. إذا لم يكن الأمر كذلك، مضايقة الحيوانات بلطف لمسها في البطن والساقين وهوائيات مع الملقط حتى يتم إنتاج السم.
3. بسرعة نقل السم لأنبوب في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية، أو أنبوب يحتوي على مبطلات مثبط كوكتيل، إذا رغبت في ذلك.

3-حصاد السم السموم بالمضايقة من السم "البصق" الأنواع

1. تخدير أو تخدير جزئيا، الحشرة قبل إزالته من مرفقها لمنع أي البصق دفاعي سابق لأوانه.
2. إثارة السم البصق السلوك. احتواء وتغيير موضع الحشرة باستخدام غطاء عميق على مستوى 90 × 16 مم طبق بيتري. عقد الغطاء الخلفي قليلاً و 1-4 سم فوق الحشرة للحيلولة دون هروب. معظم الحشرات سوف يبصقون عدة مرات، وكثيراً ما في تتابع سريع. كفالة يتم جمع جميع السم على الجزء السفلي الطبق.
3. جمع السم على الجزء السفلي صحن بيتري قبل الشطف مع 10 ميليلتر من الماء عالي النقاوة. نقل بسرعة إلى أنبوب في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية، أو أنبوب يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز.

4-حصاد السم السموم بتشريح الغدة

1. التضحية بالحيوانات. تخدير بشدة أو قتل الحيوانات باستخدام > 5 دقائق التعرض لأول أكسيد الكربون₂. أنابيب خالصة CO₂ مباشرة في الهواء-ثقوب الضميمة الإسكان للحيوان.
2. رقم التعريف الشخصي للحشرات إلى علبة تشريح. لقاتل البق، تشريح عبر السطح البطني (4.3). لعملاق المياه البق، تشريح من خلال سطح الظهرية (4.4).
3. التشريح البطني
   1. إدراج ثلاثة دبابيس في البطن الخلفي باستمرار الحشرات دون ثقب في الغدد السم.
   2. قص شق خط الوسط قصيرة في السطح البطني للبطن باستخدام مشرط مصغرة. استخدام مقص مصغرة لتوسيع شق خط الوسط الأسفل للرأس، مع الحرص على خفض الهيكل الخارجي فقط ولا تضر الهياكل الداخلية.
   3. للكشف عن الهياكل الداخلية، إجراء تخفيضات جانبية متعددة تمتد من شق خط الوسط إلى جانب الحشرة. ثم، دبوس مرة أخرى كل رفرف البطني الهيكل الخارجي للكشف عن الهياكل الداخلية.
   4. لكبير قاتل البق، جعل أربعة شقوق جانبية، في البطن منتصف البطن، الأمامي، بين الساقين الأولى والثانية، وأمام المحطة الأولى.
4. تشريح الظهرية
   1. إزالة أجنحة قرب القاعدة. إدراج ثلاثة دبابيس في البطن الخلفي باستمرار الحشرات دون ثقب في الغدد السم.
   2. قص شق خط الوسط من الرأس إلى البطن باستخدام مقص مصغرة والمبضع، مع الحرص على خفض الهيكل الخارجي فقط ولا تضر الهياكل الداخلية.
   3. قوة إلى جانب النصفي للحشرة. ضع عدة دبابيس أفقياً على طول الحشرة ترك تجويف داخلي مكشوف.
   4. إزالة عضلات الطيران باستخدام الملقط.
5. الفيضانات في علبة تشريح. إضافة برنامج تلفزيوني حتى الأخطاء هي مغمورة للسماح بتعويم حتى الهياكل الداخلية وتصور بسهولة أكبر.
6. استخدام الملقط، والمقص الصغير، بعناية إزالة الضام والنسيج العصبي والقصبة الهوائية. تظهر غدد السم ممدود، الهياكل الشفافة التي تمتد على طول كل جانب من القناة الهضمية.
   1. تحديد الغدة الرئيسية بمظهره المميزة، مع الفصوص الأمامي والخلفي وهما القنوات اجتماعها نقير.
   2. إذا رغبت في ذلك، تحديد الغدة التبعي عن طريق تتبع القناة من نقير. مجاناً الغدة الرئيسية بقطع القنوات اثنين المنبثقة عن نقير.
7. حصاد لومن الغدة المرجوة. نقل الغدة إلى ميكروسينتريفوجي على الجليد التي تحتوي على 30 ميليلتر من برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى مثبطات البروتياز كوكتيل. لانس في الغدد بدبوس حاد نظيفة.
   1. دوامة 10 s وأجهزة الطرد المركزي (1 دقيقة، ز × 5,000، 4 درجة مئوية) إفراغ لومن الغدة. إزالة الأنسجة الغدية استخدام الملقط.
8. توضيح استخراج السم. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 17,000 ز ×، 4 درجة مئوية) لإزالة أي جزيئات صلبة، الاحتفاظ بالمادة طافية ونبذ بيليه. تخزين في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية لمنع تدهور أوتوبروتيوليتيك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعض أنواع هيتيروبتيران، مثل هارباكتوريني P. بلاجيبينيس وريدوفييني رهادامانثوس بلاتيميريس، العائد موثوق بها كميات كبيرة (5-20 ميليلتر) من السم وردا على اليكتروستيموليشن (الجدول 1). بشكل عام، تعطي معظم الأخطاء بيرتيني، ريدوفييني، وهارباكتوريني السم في ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أن الخطوة الأكثر أهمية في حصاد السم خطأ قاتل واختيار الأسلوب المناسب تبعاً لأغراض الدراسة. كل من الأساليب الثلاثة المقدمة لحصاد هيتيروبتيران السموم على مزايا وعيوب اعتماداً على التطبيقات المتلقين للمعلومات.

حمل البق لطرد السم من ململه (البروتوكولات 1-3) تجنب تلوث السم عن طر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electostimulator	Grass Technologies	S48 Square Pulse Stimulator	Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezers	Australian Entomological Supplies	E122B	For handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktail	Sigma	4693124001	For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipment	Australian Entomological Supplies	E152Micro	For fine dissections
Insect pins	Australian Entomological Supplies	E162	For fine dissections