Récolte de venin toxines d’Assassin Bugs et autres insectes hétéroptères

Résumé

Bien que beaucoup d’insectes dans le sous-ordre des hétéroptères (Insecta : Hemiptera) sont venimeux, leur composition du venin et les fonctions de leurs toxines venin sont pour la plupart inconnues. Ce protocole décrit les méthodes pour récolter des hétéroptères venins pour davantage de caractérisation, utilisant l’électrostimulation, de harcèlement et dissection de la glande.

Résumé

Les insectes hétéroptères comme assassin bugs (Reduviidae) et punaises d’eau géantes (Belostomatidae) descendant d’un ancêtre commun de prédateur et venimeux, et la plupart des consommables existantes conserve cette stratégie trophique. Certains consommables sont passés au se nourrissant de sang de vertébrés (tels que les bogues de kissing, Triatominae ; et punaises de lit, Cimicidae) tandis que d’autres ont retourné à se nourrissant de plantes (plus Pentatomomorpha). Toutefois, à l’exception de la salive utilisée par kissing bugs pour faciliter l’alimentation en sang, peu est connu sur hétéroptères venins contre les venins de serpents, les scorpions et les araignées.

Un obstacle à la caractérisation des toxines venin hétéroptères est la structure et la fonction des glandes venin/labiale, qui sont morphologiquement complexes et d’effectuer de multiples rôles biologiques (défense, capture des proies et digestion extra-orale). Dans cet article, nous décrivons trois méthodes, que nous avons utilisé avec succès pour recueillir les hétéroptères venins. Tout d’abord, nous présentons électrostimulation comme un moyen pratique de recueillir le venin qui est souvent mortelle lorsqu’elle est injectée en proie des animaux, et qui permet d’éviter la contamination par du tissu glandulaire. Deuxièmement, nous montrons que doux harcèlement d’animaux est suffisante pour produire l’extrusion du venin de la trompe et/ou de venin craché dans certains groupes de consommables. En troisième lieu, nous décrivons des méthodes pour récolter des toxines venin par dissection des animaux anesthésiés pour obtenir les glandes à venin. Cette méthode est complémentaire aux autres méthodes, car elle peut permettre la récolte des toxines des taxons dans lequel l’électrostimulation et le harcèlement sont inefficaces. Ces protocoles permettra aux chercheurs de récolter les toxines des hétéroptères insectes pour la caractérisation de la structure-fonction et applications possibles en médecine et l’agriculture.

Introduction

Hétéroptères venins sont des substances bioactives puissamment¹. Par exemple, les sécrétions de venin/salive de sang-alimentation hétéroptères comme kissing bugs (Triatominae) et les punaises de lit (Cimicidae) facilite l’alimentation en perturbant l’hémostase². Toxines dans ces venins ciblent des voies multiples, y compris la coagulation, l’agrégation plaquettaire et une vasoconstriction, ainsi que la douleur et démangent des voies. Venins de la plupart des espèces d’hétéroptères sont adaptés pour faciliter la prédation plutôt que de nourrir de sang. Leurs venins causent la paralysie, la mort et la liquéfaction des tissus lorsqu’elle est injectée dans les invertébrés^3,4. Lorsqu’elle est injectée dans les vertébrés, leur venin peut aussi avoir des effets drastiques. Par exemple, injection de venin de l’assassin bug Holotrichius innesi dans vertébrés provoque la douleur, une paralysie des muscles et l’hémorragie ; souris envenomated par ce bogue mourir rapidement à cause de la paralysie des muscles respiratoires⁵.

Études de transcriptomique et protéomique ont révélé la composition en protéines de certains venins hétéroptères. Venins d’espèces prédatrices sont riches en protéases, autres enzymes et des peptides et des protéines de structure inconnue et fonction^6,7,8. Kissing bug venin est riche dans la famille des protéines triabin, dont les membres affectent profondément la coagulation, l’agrégation plaquettaire et une vasoconstriction^2,9. Cependant, on ne sait pas quelles toxines sous-tendent la plupart des bioactivités de venin. Par exemple, le venin de Triatoma infestans kissing bug a été signalé à être analgésique et inhibent les canaux de sodium¹⁰, mais les composants responsables restent à élucider. De même, on ne sait pas quel composant du venin d’assassin bug cause la paralysie ou la douleur. Une condition sine qua non pour identifier les toxines responsables bioactivités venin particulier et pour la caractérisation de la structure et la fonction des toxines venin roman, est l’obtention de venin.

Venin a été obtenue de consommables par électrostimulation^{5,6,7,8,11,12,13}, provocation de défensive réponses^4,8, mécaniquement comprimant le thorax^12,14,15,16, dissection venin glandes^{8,17 ,18,19,20,21,22}et l’application des agonistes des récepteurs muscariniques de l’acétylcholine²³. A en juger les éventuels avantages et inconvénients de n’importe quelle méthode est compliquée par la morphologie des glandes à venin hétéroptères, qui se composent d’une glande principale avec deux lumières séparées, la glande principale antérieure (AMG) et la glande principale postérieure (PMG), ainsi que d’un glandes accessoires associés (AG). Ces compartiments de différentes glandes produisent des sécrétions de différentes protéines, qui peuvent être spécialisées pour différentes fonctions biologiques, y compris la capture des proies, de défense et de digestion extra-orale^8,17. Dans peiratine et ectrichodiine assassin bugs, l’AMG a été associé à la capture des proies et la PMG avec digestion extra-orale¹⁷. Toutefois, dans le harpactorine bug Pristhesancus plagipennis la PMG est spécialisée pour la capture des proies et la digestion tandis que l’AMG est l’hypothèse à sécréter venin défensif⁸. L’AG a été décrit comme ayant une fonction sécrétrice peu assassin bugs⁸ ou comme un important site de stockage de protéase dans les punaises d’eau géantes²³. De toute évidence, les travaux supplémentaires sont nécessaire pour clarifier la fonction de chaque compartiment de la glande entre les divers sous-groupes d’hétéroptères et à déterminer la fonction de la plupart des toxines venin. Dans ce rapport, nous décrivons des protocoles pour la récolte des toxines venin de consommables pour atteindre ce but.

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Protocole

Ce protocole est conforme à la politique de l’Université du Queensland énoncée dans Responsible Care et l’utilisation des animaux dans l’enseignement et de recherche (PPL 4.20.11) ainsi que la National Health et Medical Research Council code australien pour le soin et l’utilisation de animaux à des fins scientifiques (8^ème édition 2013).

ATTENTION : prendre soin de ne pas pour être envenomated lors de la gestion des bugs de l’assassin. Prenez soin de protéger les yeux lors de la manipulation des espèces qui crachent le venin défensivement. Prendre soin dans l’ensemble ne pas de blesser les animaux de laboratoire. Cela comprend la surveillance de la pression sur les restrictions telles que des bandes de caoutchouc et de veiller à ce que la trompe n’est pas cassée.

Remarque : Vous pouvez également anesthésier animaux par l’exposition au CO₂ pendant 0,5 à 2 min ou refroidissement de 4-10 ° C avant la récolte de venin dans vise 1-3 pour faciliter le transfert sûr et retenue. Anesthésie, n’est pas strictement nécessaire mais peut faciliter la retenue sûre des spécimens agiles ou fortes. Toutefois, les animaux doivent être éveillés pour permettre la récolte de venin. N’oubliez pas les applications en aval lorsqu’ils décident ou non d’ajouter des inhibiteurs de la protéase.

1. récolte de venin toxines par électrostimulation

1. Obtenir des spécimens vivants permettant de récolter des toxines.
2. Utilisation des brucelles en plastique préparés à l’avance avec des électrodes positives et négatives monté à chaque extrémité. Se connecter à pinces électrifiées à un électrostimulateur ou une source de tension constante qui permet le réglage de la tension.
   1. Pour les petites (environ 10 mm) et gros (~ 25 mm) assassin bugs, utiliser des tensions de crête de 15 et 25 V respectivement.
   2. Pour les plus grands consommables tels que les punaises d’eau géantes, utiliser jusqu'à 40 V.
3. Retenir les insectes vivants par leur cerclage sur une plate-forme, à l’aide d’un élastique sur le thorax.
4. Placer l’extrémité de la trompe dans une pointe de collecte appropriée. Pour les bugs de l’assassin, utiliser un embout de pipette P200. Pour les punaises d’eau géantes, couper l’extrémité large une pointe P200 pour augmenter la taille de l’ouverture.
   1. Soulevez la trompe avec une paire fermée de pince à épiler propre doucement et poussez l’ouverture de l’embout de la collection sur l’extrémité de la trompe.
   2. Si vous le souhaitez, absorption ~ 5 µL eau ultrapure avant de placer la trompe dans la collecte de pointe. Cela réduit les pertes de venin restant à l’intérieur de la pointe, bien que le venin récolté sera dilué.
5. Appliquer l’électrostimulation. Plonger les électrodes stimulants en gel conducteur, tels que 2,5 M NaCl/50% glycérol. Appliquer les électrodes sur le thorax. Pour belostomatids, appliquer les deux électrodes à la surface dorsale postérieure de la tête.
6. Stocker le venin pour empêcher autodégradation. Après que le venin est expulsé, transférer rapidement dans un tube à-20 ° C ou -60 ° C, ou d’un tube contenant le cocktail inhibiteur de protéase.
7. Répétez les étapes 1.5 et 1.6 jusqu'à ce que le venin suffisant est acquis ou d’aucune autre venin n’est attendu.

2. récolte de venin toxines par le harcèlement

1. Préparer les animaux pour la récolte de venin et placer l’extrémité de la trompe dans un vestibule de la collection, tel que décrit dans les paragraphes 1.1 et 1.3-1.4.
2. Si le venin est expulsé spontanément, passez à l’étape 2.3. Si ce n’est pas le cas, harceler les animaux par le doucement toucher sur les jambes, l’abdomen et l’antenne avec des pincettes jusqu'à ce que le venin est produite.
3. Transférer rapidement le venin dans un tube à-20 ° C-60 ° C ou un tube contenant inhibiteur de protéase cocktail, si vous le souhaitez.

3. récolte de venin toxines par le harcèlement de venin « Cracher » espèces

1. Anesthésier, ou partiellement anesthésier, l’insecte avant de le retirer de son enceinte pour empêcher tout cracher défensive prématurée.
2. Provoquer le venin craché de comportement. Contenir et repositionner l’insecte en utilisant le couvercle profond d’une norme 90 x 16 mm boîte de Pétri. Maintenir le couvercle légèrement en arrière et 1 à 4 cm au-dessus de l’insecte pour prévenir le vol. La plupart des insectes vont cracher plusieurs fois, souvent en succession rapide. S’assurer que tout venin n’est perçue sur le dessous du plat.
3. Recueillir le venin sur la face inférieure de la boîte de Pétri en rinçant avec 10 µL d’eau ultrapure. Les transférer rapidement dans un tube à-20 ° C ou -60 ° C, ou d’un tube contenant le cocktail inhibiteur de protéase.

4. récolte de venin toxines par Dissection de la glande

1. Sacrifier des animaux. Fortement anesthésier et tuer les animaux à l’aide de > 5 min l’exposition au CO₂. Pipe pure CO₂ directement dans les trous d’aération du boîtier de logement de l’animal.
2. Insecte broche au plateau de dissection. Pour les bugs de l’assassin, disséquer par le biais de la face ventrale (4.3). Pour les punaises d’eau géantes, disséquer par le biais de la surface dorsale (4.4).
3. Dissection ventrale
   1. Insérer les trois broches dans l’abdomen postérieur à maintenez l’insecte sans percer les glandes à venin.
   2. Couper une incision médiane court dans la surface ventrale de l’abdomen à l’aide d’un scalpel miniature. Utiliser des ciseaux miniatures de prolonger l’incision médiane antérieure à la tête, en prenant soin de couper l’exosquelette seulement et ne pas endommager les structures internes.
   3. Pour exposer les structures internes, faites plusieurs coupes latérales qui s’étend de l’incision de la ligne médiane du côté de l’insecte. Puis, broche arrière chaque lambeau de ventrale exosquelette pour révéler les structures internes.
   4. Pour grands assassin bugs, faire des incisions latérales quatre, dans le milieu de l’abdomen, antérieur l’abdomen, entre les jambes de premiers et deuxième et en face de la première manche.
4. Dissection dorsale
   1. Retirer les ailes près de la base. Insérer les trois broches dans l’abdomen postérieur à maintenez l’insecte sans percer les glandes à venin.
   2. Couper une incision médiane de la tête à l’abdomen à l’aide de ciseaux miniatures et bistouri, en prenant soin de couper l’exosquelette seulement et ne pas endommager les structures internes.
   3. Forcer à part les deux moitiés de l’insecte. Placer plusieurs broches latéralement sur toute la longueur de l’insecte de quitter la cavité intérieure exposée.
   4. Supprimer les muscles du vol à l’aide de la pince à épiler.
5. Inonder le plateau de dissection. Ajouter PBS jusqu'à ce que le bug est immergé pour permettre aux structures internes flottent vers le haut et être plus facilement visualisés.
6. À l’aide de micro-ciseaux et pinces à épiler, retirez soigneusement le conjonctif et le tissu nerveux et la trachée. Les glandes à venin apparaissent comme allongé, structures translucides s’étendant le long de chaque côté du canal digestif.
   1. Identifier la glande principale par son aspect caractéristique, avec des lobes antérieurs et postérieurs et deux conduits au hile.
   2. Si vous le désirez, identifiez la glande accessoire en traçant la gaine depuis le hile. Gratuitement la glande principale en coupant les deux conduits émanant du hile.
7. Récolter les lumens de glande désirée. Transférer la glande à une micro-centrifugeuse sur glace contenant 30 µL de PBS ou PBS et inhibiteur de la protéase cocktail. Lance les glandes avec une épingle propre forte.
   1. Vortexer pendant 10 s et centrifuger (1 min, 5 000 × g, 4 ° C) pour vider les lumens de la glande. Retirez le tissu glandulaire avec une pincette.
8. Clarifier l’extrait de toxine. Centrifugeuse (5 min, 17 000 × g, 4° C) pour éliminer les particules solides, conservant le surnageant et jeter le culot. Conserver à-20 ° C ou -60 ° C à prévenir la dégradation de l’autoproteolytic.

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Résultats

Certaines espèces d’hétéroptères, tels que le harpactorine P. plagipennis et le reduviine Platymeris Rhadamanthe, rendement fiable (5-20 µL) de grandes quantités de venin en réponse à l’électrostimulation (tableau 1). En général, la plupart des bugs peiratine, reduviine et harpactorine donnent venin en réponse à cette méthode. Parmi stenopodaine bogues, électrostimulation a suscité le venin de Oncocephalus SP., mais pas de

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Discussion

L’étape la plus critique dans la récolte de venin d’assassin bug consiste à sélectionner la méthode appropriée selon les besoins de l’étude. Chacune des trois méthodes présentées pour la récolte des hétéroptères venins a des avantages et inconvénients selon les applications en aval.

Induisant des bogues pour expulser le venin de la trompe (protocoles 1-3) évite la contamination du venin de tissus glandulaires. En outre, ces méthodes sont non létales et peuvent être ré...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electostimulator	Grass Technologies	S48 Square Pulse Stimulator	Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezers	Australian Entomological Supplies	E122B	For handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktail	Sigma	4693124001	For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipment	Australian Entomological Supplies	E152Micro	For fine dissections
Insect pins	Australian Entomological Supplies	E162	For fine dissections