독 독 소 암살자 버그와 다른 Heteropteran 곤충에서 수확

요약

비록 Heteroptera suborder에 많은 곤충 (Insecta: Hemiptera)는 악의 찬, 그들의 독 성분 및 그들의 독 독 소의 기능 대부분 알려지지 않은. 이 프로토콜에는 더 특성화를 통해, 성희롱, 동맥 해 부를 사용 하 여에 대 한 heteropteran venoms 수확 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Heteropteran 곤충 암살자 버그 (침노린재과) 등 거 대 한 물 버그 (물장군과) predaceous 및 악의 찬 공통 조상에서 후손 그리고 현존 heteropterans의 대다수가 영양 전략을 유지 합니다. 일부 heteropterans 척추 혈액에 먹이 기에 전환 해야 (Triatominae; 키스 버그 등 및 침대 버그, Cimicidae) 동안 다른 사람 식물 (대부분 Pentatomomorpha)에 먹이로 되 돌. 그러나, 키스 버그에 의해 혈액 공급, 작은 촉진 하는 데 사용 하는 타 액을 제외 하 고 heteropteran venoms venoms 거미, 전갈과 뱀의 비교에 대 한 알려져 있다.

Heteropteran 독 독 소의 특성화에 1 개의 장애는 구조와 기능 둘 다 형태학 상으로 복잡 한 되 고 수행 하는 여러 생물 학적 역할 (방어, 먹이 캡처 및 여분 구두 소화)는 독/양순 분 비의. 이 문서에서 우리는 우리가 성공적으로 heteropteran venoms 수집을 사용 하는 세 가지 방법을 설명 합니다. 첫째, 우리 제시 통해는 종종로 주사 될 때 치명적인 독을 수집 하는 편리한 방법을 먹이 동물, 그리고 어떤 선 직물에 의해 오염 obviates. 둘째, 우리는 동물의 부드러운 성희롱 코 또는 heteropterans의 일부 그룹에 침 독 독 압출 생산 충분 한지 보여줍니다. 셋째, 독 독 독 샘을 얻으려면 anaesthetized 동물의 해 부에 의해 수확 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 방법에 보완으로 그것을 통해 및 성희롱 효과가 있다 taxa에서 독 소의 수확 수 있습니다. 이 프로토콜에는 의학 및 농업 구조-기능 특성 및 가능한 heteropteran 곤충에서 독 소를 수확 연구원 수 있게 된다.

서문

Heteropteran venoms potently 생리 활성 물질¹있습니다. 예를 들어 키스 버그 (Triatominae) 등 침대 버그 (Cimicidae) Heteroptera 혈액 공급의 독/타 액 분 비 hemostasis²를 방해 하 여 수 유를 촉진 한다. 이러한 venoms 독 소는 응고, 혈소판 vasoconstriction, 뿐만 아니라 통증을 포함 하 여 여러 개의 경로 대상 하 고 경로가 렵 게. 대부분 다른 heteropteran 종에서 venoms는 혈액을 먹이 것 보다는 포식을 용이 하 게 적응. 그들의 venoms 마비, 죽음 및 조직 액 무척 추 동물^3,4에 주입 하는 경우 발생할. 척추 동물에 주입 했을 때 그들의 독 또한 과감 한 효과 있을 수 있습니다. 예를 들어 척추로 암살자 버그 Holotrichius innesi 에서 독의 주입 하면 근육 마비 통증과 출혈; 이 버그에 의해 쥐 envenomated 호흡 마비⁵인해 신속 하 게 죽어.

Transcriptomic 및 proteomic 연구 일부 heteropteran venoms의 단백질 구성을 밝혀 있다. Predaceous 종 venoms는 프로 테아 제, 다른 효소, 펩 티 드 및 알 수 없는 구조와 기능^6,,78의 단백질 풍부 합니다. 키스 버그 독 회원 뿌리깊은 영향을 응고, 혈소판, vasoconstriction^2,9triabin 단백질 가족에 풍부 하다. 그러나, 그것은 어떤 독 소 기초 독의 대부분 bioactivities 알 수 없습니다. 예를 들어 키스 버그 Triatoma infestans 의 독은 진통 및 나트륨 채널¹⁰, 억제 알려졌다 하지만 책임 구성 요소 해명 될 남아 있다. 마찬가지로, 그것은 암살자 버그 독의 어떤 컴포넌트 마비 또는 통증 원인이 알려져 있지 않다. 특정 독 bioactivities과 특성화 구조와 기능, 소설 독 독 소의 독 소를 식별 하는 데 필수 독을 얻는 이다.

독을 통해^{5,6,7,8,11,,1213}, 방어의 도발에 의해 heteropterans에서 얻은 되었습니다. 응답^4,8, 기계적으로 흉부^12,,1415,16, 독 샘^{8,17 개 해 부를 당기고 ,18,19,20,,2122}및²³muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체 촉진제의 응용 프로그램. 두 개의 별도 루멘, 앞쪽 주요 동맥 (AMG) 및 후부 주요 동맥 (PMG), 주요 동맥을 이루어져 있는 heteropteran 독 샘의 형태에 의해 복잡 잠재적인 장단점 어떤 방법의 판단으로 부속 선 (AG) 관련. 이러한 다른 선 구획 생산 다른 단백질 분 비 물, 먹이 캡처, 여분 구두 소화^8,17, 국방 등 다양 한 생물 학적 기능에 대 한 전문화 될 수 있습니다. Peiratine 및 ectrichodiine 자 객 버그는 AMG 먹이 캡처 및 여분 구두 소화¹⁷PMG와 연결 되었습니다. 그러나,는 harpactorine에서 버그 Pristhesancus plagipennis 는 PMG는 전문 먹이 캡처 및 소화는 AMG 방어 독⁸분 비 가설 하는 반면. AG은 암살자 버그⁸ 에서 약간 분 비 기능을가지고 또는 거 대 한 물 버그²³protease 스토리지의 주요 사이트 설명 하고있다. 명확 하 게, 추가 작업은 다양 한 heteropteran 하위 그룹 중 각 선 구획의 기능을 명확히 하 고 대부분 독이 독 소의 기능을 결정 하는 데 필요한. 이 보고서에서 우리는 독 독이이 목표를 향해 heteropterans에서 수확에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

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프로토콜

이 프로토콜와 책임 관리 하 고 교육 및 연구에 있는 동물의 사용 (PPL 4.20.11)으로 국민 건강 및 의료 연구 위원회의 치료에 대 한 호주 코드 및의 사용에서 밖으로 설정 하는 퀸즐랜드 대학 정책 준수 과학적 목적을 위해 동물 (8^일 에디션 2013).

주의: 하지 되도록 envenomated 암살자 버그를 처리할 때 처리. 방어 독 침 종 처리 때 눈을 보호 하는 것을 주의. 통해 처리 실험 동물을 다치게 하 하지. 고무 밴드 같은 지지대에 압력의 모니터링 및 코 깨진 하지 않음을 보장 포함 됩니다.

참고: 필요에 따라 0.5-2 CO₂ 에 노출에 의해 동물을 anaesthetize 분 또는 독에 수확 전에 4-10 ° C에 냉각 안전 전송 및 구속 1-3를 목표로. Anaesthetization는 엄격 하 게 필요 하지 않습니다 하지만 민첩 한 또는 강한 표본의 안전 규제를 촉진 수 있습니다. 그러나, 동물 독 수확 수 있도록 깨어 있어야 합니다. 프로 테아 제 억제제를 추가 여부를 결정할 때 다운스트림 응용 프로그램 하십시오.

1. 독 독 소 통해에 의해 수확

1. 독 소를 수확 하는 라이브 표본의 얻을.
2. 긍정적이 고 부정적인 전극으로 사용 하 여 미리 준비 된 플라스틱 핀셋 어느 팁에 장착. 전기 족집게는 electrostimulator 또는 전압의 조정을 허용 하는 일정 한 전압 소스를 연결 합니다.
   1. 작은 (~ 10 m m)와 큰 (25 mm) 암살자 버그, 15, 25 V의 피크 전압을 각각 사용 합니다.
   2. 거 대 한 물 버그 등 더 큰 heteropterans에 대 한 최대 40 V를 사용 합니다.
3. 흉부에 고무 밴드를 사용 하 여 플랫폼에 달아서 여 라이브 버그를 제 지.
4. 적합 한 수집 팁에는 코의 끝을 놓습니다. 암살자 버그, P200 피 펫 팁을 사용 합니다. 거 대 한 물 버그에 대 한 조리개의 크기를 늘리기 위해 P200 끝에서 끝을 잘라.
   1. 부드럽게 깨끗 한 핀셋의 닫힌 쌍 코를 리프트와 코의 끝 컬렉션 팁의 개방 조리개를 밀어.
   2. 원하는 경우, 수집에 코를 배치 하기 전에 이해 ~ 5 µ L 초순 팁. 비록 수확된 독이 희석 될 것입니다 팁, 안에 남아 있는 독의 손실이 줄어듭니다.
5. 통해 적용 됩니다. 2.5 M NaCl/50% 글리세롤 등 전도성 젤에 자극 전극을 담근 다. 가슴에 전극을 적용 됩니다. Belostomatids, 2 개의 전극은 머리의 등 쪽 후부 표면에 적용 됩니다.
6. Autodegradation를 방지 하기 위해 독을 저장 합니다. 독 압출 후-20 ° C 또는-60 ° C, 튜브 또는 튜브 프로 테아 제 억제 물 칵테일 포함 된 전송 신속 하 게.
7. 때까지 충분 한 독 인수 또는 아무 더 독은 1.5-1.6 단계를 반복 합니다.

2. 성희롱으로 독 독 소의 수확

1. 독이 수확에 대 한 동물을 준비 하 고 1.1 및 1.3-1.4 하위 섹션에 설명 된 대로 컬렉션 현관에는 코 끝을 배치.
2. 독이 저절로 돌출 되 면 2.3 단계로 이동 합니다. 그렇지 않은 경우에 만져 부드럽게 그것은 다리, 복 부 및 안테나에 핀셋으로 독이 생성 될 때까지 동물을 괴 롭 히.
3. 신속 하 게 원하는 경우 독-20 ° C 또는-60 ° C, 또는 튜브 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 튜브에 전송.

3. 독 독 독 "침" 종에서에서 괴롭힘에 의해의 수확

1. Anaesthetize, 또는 부분적으로 anaesthetize, 어떤 조 수 비 침 방지 하기 위해 그것의 케이스에서 그것을 제거 하기 전에 곤충.
2. 독 침을 뱉는 행동을 자극 합니다. 포함 하 고 표준 90 x 16 mm 페 트리 접시의 깊은 뚜껑을 사용 하 여 곤충을 재배치. 잡고 약간 후부 뚜껑과 곤충 비행을 방지 하기 위해 위의 1-4 cm. 대부분의 곤충은 뱉 어 여러 번 자주 빠른 승계에서. 모든 독은 접시의 아래쪽에서 수집 된 확인 하십시오.
3. 초순의 10 µ L로 헹 궈 서 페 트리 접시의 아래쪽에서 독을 수집 합니다. 신속 하 게 전송 그것은-20 ° C 또는-60 ° C, 튜브 또는 튜브를 포함 하는 프로 테아 제 억제 물 칵테일.

4. 수확 동맥 해 부에 의해 독 독

1. 동물을 희생. 무 겁 게 anaesthetize 또는 사용 하 여 동물을 죽 일 > 5 분 노출 CO₂. 동물의 주택 첨부물의 공기 구멍에 직접 순수 CO₂ 를 파이프 합니다.
2. 해 부 트레이 핀 곤충. 암살자 버그에 대 한 복 부 표면 (4.3)을 통해 해 부. 거 대 한 물 버그, 등 쪽 표면 (4.4)을 통해 해 부.
3. 복 부 절 개
   1. 독 샘을 puncturing 없이 벌레를 후부 복 부에 3 개의 핀을 삽입 합니다.
   2. 미니어처 메스를 사용 하 여 복 부의 복 부 표면에는 짧은 중간 절 개를 잘라. 미니어처가 위를 사용 하 여 확장 외 골격만을 잘라내어 내부 구조를 손상 하지 돌 머리에 anteriorly 중간 절 개.
   3. 내부 구조를 노출 하려면 여러 측면 컷 곤충의 측에 중간 절 개에서 확장을 확인 합니다. 그런 다음, 다시 내부 구조를 나타내기 위해 복 부 외 골격의 각 플랩 핀.
   4. 큰 암살자 버그에 대 한 중간 복 부, 이전 복 부, 첫 번째와 두 번째 다리 사이 첫 번째 다리 앞에 4 개의 옆 절 개를 확인 합니다.
4. 지 해 부
   1. 기지 근처에 날개를 제거 합니다. 독 샘을 puncturing 없이 벌레를 후부 복 부에 3 개의 핀을 삽입 합니다.
   2. 미니어처가 위 및 외 골격만을 잘라내어 내부 구조를 손상 하지 돌보는 메스를 사용 하 여 복 부에 머리에서 중간 절 개를 잘라.
   3. 힘 떨어져는 곤충의 두 반쪽. 여러 핀 노출 내부 구멍을 떠나 벌레의 길이 따라 옆으로 놓습니다.
   4. 핀셋을 사용 하 여 비행 근육을 제거 합니다.
5. 해 부 트레이 홍수. 더 쉽게 시각 버그 내부 구조를 플 로트 및 수 있도록 빠져들 때까지 PBS를 추가 합니다.
6. 핀셋과 마이크로-가 위를 사용 하면, 신중 하 게 결합 하 고 신경 조직 및 기관 제거할. 독 샘 길쭉한, 반투명 구조 영양 운하의 각 면을 따라 확장으로 나타납니다.
   1. 앞쪽 및 후부 엽와 2 개의 덕트는 hilus에서 특성의 외관에 의해 주요 동맥을 식별 합니다.
   2. 원하는 경우는 hilus에서 덕트를 추적 하 여 부속 동맥을 식별 합니다. 주요 동맥은 hilus에서 나오는 2 개의 덕트를 절단 하 여 무료.
7. 원하는 선 루멘을 수확. 전송 선 얼음 PBS 또는 PBS의 30 µ L을 포함 하는 microcentrifuge 프로 테아 제 억제 물 칵테일 플러스. 깨끗 한 날카로운 핀 선 창
   1. 10 s 및 원심 분리기 (1 분, 5000 × g, 4 ° C) 동맥 루멘을 소용돌이. 선의 조직 핀셋을 사용 하 여 제거 합니다.
8. 독 소 추출 명확히. 원심 분리기 (5 분, 17000 × g, 4 ° C) 유지 하는 상쾌한 펠 릿 삭제 모든 고체 입자를 제거 하 -20 ° C 또는 autoproteolytic 저하를 방지 하기 위해-60 ° C에 저장 합니다.

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결과

Harpactorine P. plagipennis , Platymeris rhadamanthus, reduviine 등 일부 heteropteran 종 안정적으로 독을 통해 (표 1)에 대 한 응답의 대량 (5-20 µ L) 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 대부분 peiratine, reduviine, 및 harpactorine 버그 독이이 방법에 대 한 응답에서을 얻을. Stenopodaine 버그 통해 sp. Oncocephalus 하지 Thodelmus sp에서 독을 elicited. 샘플 holoptiline 및 emesine ?...

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토론

자 객 벌레 독을 수확 하는 가장 중요 한 단계는 연구의 목적에 따라 적절 한 방법을 선택 하 고 있다. 각 heteropteran venoms 수확에 대 한 제시 하는 세 가지 메서드는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 장단점이 있습니다.

코 (프로토콜 1-3)에서 독을 추방 하는 버그를 유도 선 조직에 의해 독의 오염을 방지 합니다. 또한, 이러한 메서드는 비-치명적인 있으며 버그의 생활의 과정 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electostimulator	Grass Technologies	S48 Square Pulse Stimulator	Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezers	Australian Entomological Supplies	E122B	For handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktail	Sigma	4693124001	For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipment	Australian Entomological Supplies	E152Micro	For fine dissections
Insect pins	Australian Entomological Supplies	E162	For fine dissections