JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Her ne kadar alt Heteroptera içinde birçok böcekler (Insecta: Hemiptera) zehirli, onların venom kompozisyon ve onların venom toksinleri işlevleri vardır çoğunlukla bilinmeyen. Bu iletişim kuralı heteropteran zehirlerini elektrostimülasyon, taciz ve bezi diseksiyon kullanarak daha fazla karakterizasyonu için hasat yöntemleri açıklar.

Özet

Heteropteran böcekler katil böcekler (Reduviidae) ve dev su böcekleri (Belostomatidae) gibi ortak bir predaceous ve zehirli atadan soyundan ve trofik bu strateji kaybolmamış heteropterans çoğunluğu korumak. Bazı heteropterans omurgalı kanıyla beslemeye geçiş (kissing hataları, Triatominae; gibi ve tahtakurusu, Cimicidae) diğerleri bitkiler (en Pentatomomorpha) beslemeye yayıncısıysanız iken. Ancak, kan besleme, küçük kolaylaştırmak için kissing böcek tarafından kullanılan tükürük dışında örümcekler, Akrep ve yılan zehirlerini karşılaştırıldığında heteropteran zehirlerini hakkında bilinir.

Yapısı ve fonksiyonu olan hem morfolojik karmaşık ve birden fazla biyolojik rolü (Savunma, av yakalama ve ekstra oral sindirim) gerçekleştirmek venom/Labyal bezlerinin heteropteran zehir toksin karakterizasyonu için bir engeldir. Bu makalede, biz başarılı bir şekilde heteropteran zehirlerini toplamak için kullanılan üç yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, biz mevcut elektrostimülasyon kez içine enjekte edildiğinde öldürücü zehir toplamak için kullanışlı bir yol av hayvanları ve hangi tarafından glandüler doku kirlenme namussuz. İkinci olarak, hayvanların nazik taciz hortum ve/veya heteropterans bazı gruplar halinde tükürük venom zehir ekstrüzyon üretmek için yeterli olduğunu göstereceğiz. Üçüncü olarak, zehir toksin zehir bezleri elde etmek için anaesthetized hayvanlar diseksiyon tarafından hasat yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer yöntemler için tamamlayıcı olduğu takson elektrostimülasyon ve taciz etkisiz neden olan toksinlerin hasat izin verebilir. Bu protokoller araştırmacılar heteropteran böcekler yapı-fonksiyon karakterizasyonu ve olası uygulamaları tıp ve tarım için toksinlerin hasat için olanak sağlar.

Giriş

Heteropteran zehirlerini kuvvetli biyoaktif maddeler1vardır. Örneğin, kan besleme Heteroptera kissing böcekler (Triatominae) ve yatak hata (Cimicidae) gibi zehir/tükürük salgılarını kolaylaştırır hemostaz2kesintiye tarafından besleme. Bu zehirlerini toksinler koagülasyon, trombosit toplama ve vazokonstriksiyona yanı sıra ağrı da dahil olmak üzere birden çok yolları hedef ve yolları kaşınıyor. Diğer çoğu heteropteran tür zehirlerini kan besleme yerine predasyona kolaylaştırmak için uyarlanmış. Onların zehirlerini felç, ölüm ve omurgasızlar3,4enjekte edildiğinde doku الرسالة neden. Omurgalılar enjekte edildiğinde onların venom aynı zamanda ciddi etkileri olabilir. Örneğin, omurgalıların içine assassin hata Holotrichius innesi zehir enjeksiyonu, ağrı, kas felci ve kanama neden olur; Fareler envenomated bu hata nedeniyle solunum felci5hızlı bir şekilde ölür.

Transcriptomic ve proteomik çalışmalar bazı heteropteran zehirlerini protein bileşimi ortaya çıkardı. Predaceous türlerin zehirlerini proteaz, diğer enzimler, peptidler ve proteinler bilinmeyen yapısı ve işlevi6,7,8de zengindir. Kissing böcek zehiri üyeleri derinden etkileyen koagülasyon, trombosit toplama ve vazokonstriksiyona2,9triabin protein ailesinden, zengindir. Ancak, hangi toksinler zehir çoğu bioactivities altında yatan bilinmemektedir. Örneğin, Triatoma infestans öpüşme böcek zehiri analjezik ve sodyum kanalları10inhibe bildirilmiştir, ama aydınlatılmamıştır için bileşenleri sorumlu kalır. Aynı şekilde, ne bileşenleri assassin böcek zehiri, felç veya ağrı neden bilinmemektedir. Belirli zehir bioactivities ve yapısı ve fonksiyonu romanı zehir toksinlerin karakterize sorumlu toksinler tanımlamak için bir ön koşul zehir almaktır.

Heteropterans elektrostimülasyon5,6,7,8,11,12,13tarafından savunma araçları provokasyon zehir elde edilen yanıt-e doğru4,8mekanik zehir bezleri8,17 dissekan Toraks12,14,15,16, sıkma, ,18,19,20,21,22ve23muscarinic asetilkolin reseptör agonistleri uygulanması. Potansiyel avantajları ve dezavantajları, herhangi bir yöntemin yargılamak karmaşık morfolojisi ile iki ayrı lümen, ön ana bezi (AMG) ve posterior ana bezi (PMG), ana bir bezi oluşur heteropteran zehir bezleri tarafından yanı sıra bir Aksesuar bezi (AG) ilişkili. Bu farklı bezi bölmeleri av yakalama, savunma ve ekstra oral sindirim8,17gibi farklı biyolojik işlevi için özelleştirilmiş farklı protein salgıları üretmek. Peiratine ve ectrichodiine assassin hataları, AMG av yakalama ve ekstra oral sindirim17ile PMG ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. AMG savunma zehir8salgılaması için olan ise ancak, içinde harpactorine hata Pristhesancus plagipennis PMG av yakalama ve sindirim için uzmanlaşmıştır. AG assassin hata8 ' küçük salgı işleve sahip veya proteaz depolama dev su böcekleri23yılında büyük bir site olarak tarif edilmiştir. Açıkçası, daha fazla çalışma çeşitli heteropteran alt gruplar arasında her bezi bölmesi işlevini açıklığa kavuşturmak ve en zehir zehirli işlevini belirlemek için gereklidir. Bu raporu heteropterans bu hedefe doğru toksinlerin zehir hasat için protokolleri açıklamak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu iletişim kuralı sorumlu bakım ve hayvanların kullanımı öğretim ve araştırma (PPL 4.20.11) yanı sıra ulusal sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi Avustralya şifre için kaygı ve kullanımı içinde yola University in Queenslands İlkesi ile uyumludur. hayvanların bilimsel amaçlar için (8th Edition 2013).

Dikkat: envenomated assassin hataları işlerken olmaması için dikkat ediniz. Zehir savunma tükürmek türler işlerken gözleri korumak için özen gösterin. Kendine iyi bak boyunca deneysel hayvan incitmek değil. Bu bağlar gibi lastik bantlar üzerinde baskı izleme ve hortum kırık değil sağlanması içerir.

Not: İsteğe bağlı olarak, CO2 0,5-2 için maruz hayvanlar uyuşturan min veya içinde zehir hasat öncesi 4-10 ° C'ye soğutma güvenli aktarımı ve kısıtlama kolaylaştırmak için 1-3 amaçlamaktadır. Anestezi kesinlikle gerekli değildir ancak güvenli kısıtlama çevik veya güçlü örneklerin kolaylaştırabilir. Ancak, hayvan zehir hasat izin vermek için uyanık olması gerekir. Aşağı akım uygulamaları proteaz inhibitörleri eklemek olup olmadığını karar verirken göz önünde bulundurun.

1. hasat zehir toksin elektrostimülasyon tarafından

  1. Toksinler hasat edilecek canlı örnekleri edinin.
  2. Kullanım önceden hazırlanmış plastik cımbız pozitif ve negatif elektrotlar ile her iki ucuna monte. Elektrikli cımbız bir electrostimulator veya gerilim ayarlanmasını sağlar sabit voltaj kaynağı bağlanın.
    1. Küçük (~ 10 mm) ve büyük (~ 25 mm) katil böcekler için en yüksek voltaj 15 ve 25 V sırasıyla kullanın.
    2. Dev su böcekleri gibi daha büyük heteropterans için 40 V kullanın.
  3. Canlı hata onlara göğüs üzerinde bir lastik bant kullanarak bir platforma şeritleme dizginlemek.
  4. Hortum ucu uygun bir toplama ucu yerleştirin. Assassin hatalar için P200 pipet ipucu kullanın. Dev su böcekleri için kapalı diyafram boyutunu artırmak için P200 bahşiş ekstremite kesti.
    1. Yavaşça hortum temiz cımbız kapalı bir çift ile Asansör ve hortum sonunda üzerinde toplama ucu açık diyafram itin.
    2. İstenirse, hortum toplama içine yerleştirerek önce µL ultrasaf su alımını ~ 5 ipucu. Hasat zehir seyreltilmiş rağmen bu ipucu içinde kalan zehir kayıplarını azaltır.
  5. Elektrostimülasyon uygulanır. 2.5 M NaCl/50% gliserol gibi iletken jel uyarıcı elektrotlar daldırma. Elektrotlar Toraks için geçerlidir. Belostomatids için iki elektrot başın arka dorsal yüzeye uygulanır.
  6. Autodegradation önlemek için zehir saklayın. Hızlı bir şekilde zehir kalıptan çekilmiş sonra bir tüp-20 ° C veya-60 ° C veya proteaz inhibitörü kokteyl içeren bir tüp aktarın.
  7. 1,5 ve 1,6 yeterli zehir kazanılır veya başka hiçbir zehir gelecek kadar yineleyin.

2. zehir toksin tarafından taciz hasat

  1. Hayvanlar zehir hasat için hazırlamak ve alt bölümleri 1.1 ve 1.3-1.4 açıklandığı gibi bir koleksiyon giriş hortum ucu yerleştirin.
  2. Zehir kendiliğinden kalıptan çekilmiş, 2.3 adıma gidin. Eğer değilse, hayvanların zehiri üretilen kadar yavaşça bu bacaklar, karın ve anten cımbız ile dokunmak tarafından taciz.
  3. Hızlı bir şekilde zehir bir tüp-20 ° C-60 ° C veya bir tüp içeren proteaz inhibitörü kokteyl, istenirse aktarın.

3. hasat tarafından taciz "Türler tükürme" Venom zehir toksinlerin

  1. Uyuşturan veya kısmen uyuşturan, böcek herhangi bir erken savunma tükürme önlemek için onun muhafaza--dan çıkarmadan önce.
  2. Davranış tükürme zehir kışkırtmak. İçeren ve bir standart 90 x 16 mm Petri kabına derin kapağını kullanarak böcek yeniden konumlandırmak. Kapak biraz arka ve 1-4 cm uçuş önlemek için böcek yukarıda tutun. Çoğu böcek birkaç kez, genellikle hızlı bir şekilde tükürmek. Tüm zehir çanak alt toplanan emin olun.
  3. Venom 10 µL ultrasaf su ile durulama tarafından Petri kabına alt toplamak. Hızlı bir şekilde bir tüp-20 ° C veya-60 ° C veya proteaz inhibitörü kokteyl içeren bir tüp aktarın.

4. hasat zehir toksin bezi diseksiyon tarafından

  1. Hayvanlar kurban. Ağır uyuşturan veya öldürmek kullanarak Hayvanlar > 5 dk pozlama CO2. Saf CO2 doğrudan air-deliklere hayvanın konut bariyer boru.
  2. Diseksiyon tepsi için PIN böcek. Assassin hatalar için menfez yüzey (4.3) incelemek. Dev su böcekleri için sırt yüzey (4.4) incelemek.
  3. Ventral diseksiyon
    1. Üç pimleri böcek zehiri bezleri Delme olmadan basılı posterior karın içine takın.
    2. Kısa bir ensizyon minyatür neşter kullanarak karın ventral yüzeyde kesti. Minyatür makas Ensizyon exoskeleton sadece kesip iç yapıları zarar vermemeye dikkat çekici kafaya anteriorly genişletmek için kullanın.
    3. İç yapıları ortaya çıkarmak için Ensizyon böcek tarafına uzanan birden çok yan kesim yapmak. Sonra her flep iç yapıları ortaya çıkarmak için ventral ezilecektir pin.
    4. Büyük katil böcekler için dört yan kesik, orta Karin, ön karın, birinci ve ikinci bacak arasına ve ilk ayağı önünde olun.
  4. Dorsal diseksiyon
    1. Kanatları üssü yakınlarında kaldırın. Üç pimleri böcek zehiri bezleri Delme olmadan basılı posterior karın içine takın.
    2. Bir ensizyon baş minyatür makas ve neşter, exoskeleton sadece kesip iç yapıları zarar vermemeye dikkat çekici kullanarak karın kesme.
    3. Böcek iki yarısını ayrı zorlamak. Yanal iç boşluğu maruz bırakmak böcek uzunluğu boyunca birkaç iğne yerleştirin.
    4. Cımbız kullanarak uçuş kasları kaldırın.
  5. Diseksiyon tepsi sel. Hata iç yapıları yukarı yüzer ve olmak izin vermek için batık kadar PBS daha kolayca görselleştirildiği ekleyin.
  6. Cımbız ve mikro-makas kullanarak, bağ ve sinir dokusu ve trakea dikkatli bir şekilde çıkarın. Zehir bezleri, yarı saydam yapıları kurbanın kanal her kenarı boyunca uzanan uzamış gibi görünür.
    1. Ana bezi tarafından anterior ve posterior LOB ve iki kanalları hilus toplantı ile karakteristik görünümünü tanımlayın.
    2. İstenirse, Aksesuar bezi kanal üzerinden hilus izini sürerek tanımlayın. Ana bezi hilus yayılan iki boru kesim tarafından ücretsiz.
  7. İstenen bezi Lümen hasat. Bezinin bir microcentrifuge için PBS veya PBS 30 µL içeren buza aktarım proteaz inhibitörü kokteyl artı. Temiz keskin iğne ile bezleri lance.
    1. 10 s ve bezi Lümen boşaltmak için santrifüj (1 dk, 5000 × g, 4 ° C) için girdap. Glandüler doku cımbız kullanarak kaldırın.
  8. Toksin özü netleştirmek. Santrifüj (5 dk, 17.000 × g, 4° C) süpernatant istinat ve Pelet atarak herhangi bir katı parçacıkları kaldırmak için. -20 ° C veya autoproteolytic yıkımı önlemek için-60 ° C saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Harpactorine P. plagipennis ve reduviine Platymeris rhadamanthus, bazı heteropteran türlerin büyük miktarlarda (5-20 µL) zehir elektrostimülasyon (Tablo 1) karşılık olarak, güvenilir bir şekilde verim. Genel olarak, çoğu peiratine, reduviine ve harpactorine böcek zehiri yanıt olarak bu yöntem verim. Stenopodaine böcek arasında elektrostimülasyon zehir Oncocephalus sp. ama sp Thodelmus elde edildi. Örnek holoptiline v...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Assassin böcek zehiri hasat en kritik adımı uygun yönteme bağlı olarak çalışma amacı seçmektir. Heteropteran zehirlerini hasat için sunulan üç yöntemlerinden her birinin avantajları ve dezavantajları bağlı olarak aşağı akım uygulamaları vardır.

Böcek zehri gelen hortum (protokoller 1-3) sınırdışı inducing zehir kirlenme tarafından glandüler doku önler. Buna ek olarak, bu yöntemleri öldürücü olmayan ve birçok kez bir böceğin yaşamı boyunca tekrar edil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Mali anıyoruz Avustralya Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (asıl araştırma bursu Avustralya Araştırma Konseyi (hibe DP130103813 ve LP140100832 G.F.K., DECRA bursu DE160101142 için EABU için), destek APP1044414 G.F.K. için) ve Queensland Üniversitesi (doktora sonrası bursu A.A.W. için).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ElectostimulatorGrass TechnologiesS48 Square Pulse StimulatorElectrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezersAustralian Entomological SuppliesE122BFor handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktailSigma4693124001For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipmentAustralian Entomological SuppliesE152MicroFor fine dissections
Insect pinsAustralian Entomological SuppliesE162For fine dissections

Referanslar

  1. Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43(2016).
  2. Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
  3. Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
  4. Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
  5. Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
  6. Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
  7. Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
  8. Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755(2018).
  9. Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44(2016).
  10. Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
  11. Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
  12. Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
  13. Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
  14. Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
  15. Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
  16. Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
  17. Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
  18. Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
  19. Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
  20. Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
  21. Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
  22. Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
  23. Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
  24. Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
  25. Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
  26. Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
  27. Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 134Heteropterager ek hataReduviidaeBelostomatidaezehirzehirt k r kelektrostim lasyontacizzehir bezinindudaks beziT k r k bezi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır