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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.

Abstract

Heteropteran insetti ad esempio assassin bug (Reduviidae) e insetti giganti di acqua (Belostomatidae) discendono da un antenato comune selvatiche e velenoso, e la maggior parte dei heteropterans esistenti conserva questa strategia trofica. Alcuni heteropterans hanno effettuato la transizione a nutrire il sangue dei vertebrati (ad esempio i bug baciare, eziologico; e cimici, Cimicidae) mentre gli altri sono ritornati all'alimentazione sulle piante (la maggior parte Pentatomomorpha). Tuttavia, con l'eccezione della saliva utilizzata da kissing bugs per facilitare l'alimentazione di sangue, poco è conosciuta circa i veleni di heteropteran rispetto ai veleni di ragni, scorpioni e serpenti.

Un ostacolo alla caratterizzazione delle tossine del veleno di heteropteran è la struttura e la funzione delle ghiandole labiali/veleno, che sono entrambi morfologicamente complessa e svolgere più ruoli biologici (difesa, cattura di prede e digestione extra-orale). In questo articolo, descriviamo tre metodi che abbiamo usato con successo per raccogliere heteropteran veleni. In primo luogo, vi presentiamo l'elettrostimolazione come un modo pratico per raccogliere il veleno che è spesso letale quando iniettato in preda di animali, e che previene la contaminazione di tessuto ghiandolare. In secondo luogo, indichiamo che dolce molestie degli animali sono sufficiente a produrre estrusione di veleno dalla proboscide e/o veleno sputare in alcuni gruppi di heteropterans. In terzo luogo, descriviamo i metodi per raccogliere le tossine veleno tramite la dissezione di animali anestetizzati per ottenere le ghiandole velenifere. Questo metodo è complementare ad altri metodi, come può consentire la raccolta delle tossine da taxa in cui l'elettrostimolazione e molestie sono inefficaci. Questi protocolli permetterà ai ricercatori di raccogliere le tossine da insetti di heteropteran per la caratterizzazione di struttura-funzione e possibili applicazioni in medicina e agricoltura.

Introduzione

Heteropteran veleni sono sostanze bioattive potentemente1. Ad esempio, le secrezioni di veleno/saliva di sangue-alimentazione Heteroptera come kissing bugs (eziologico) e cimici (Cimicidae) facilita l'alimentazione interrompendo l'emostasi2. Tossine in questi veleni bersaglio vie multiple compreso coagulazione, aggregazione piastrinica e vasocostrizione, come pure il dolore e prurito vie. Veleni dalla maggior parte delle altre specie di heteropteran sono adattati per facilitare la predazione, piuttosto che sangue-alimentazione. Loro veleni causano paralisi, morte e liquefazione del tessuto quando iniettato in invertebrati3,4. Quando iniettato in vertebrati, il loro veleno può anche avere effetti drastici. Ad esempio, l'iniezione di veleno dal assassin bug Holotrichius interno nei vertebrati provoca dolore, paralisi del muscolo e l'emorragia; topi envenomated da questo bug muoiono rapidamente a causa di paralisi respiratoria5.

Trascrittomica e proteomica hanno rivelato la composizione proteica di alcuni veleni di heteropteran. Veleni di specie selvatiche sono ricchi di proteasi, altri enzimi e peptidi e proteine di struttura sconosciuta e funzione6,7,8. Bug baciare veleno è ricca di famiglia delle proteine triabin, i cui membri influenzano profondamente la coagulazione, l'aggregazione piastrinica e vasocostrizione2,9. Tuttavia, non è noto quali tossine sono alla base della maggior parte bioattività di veleno. Ad esempio, il veleno del bug baciare Triatoma infestans è stata segnalata per essere analgesico ed inibire i canali di sodio10, ma i componenti responsabili restano delucidare. Allo stesso modo, non è noto quali componenti di assassin bug veleno causano paralisi o dolore. Un prerequisito per l'identificazione le tossine responsabili bioattività particolare veleno e per la caratterizzazione di struttura e funzione delle tossine veleno romanzo, è l'ottenimento di veleno.

Veleno è stata ottenuta da heteropterans da elettrostimolazione5,6,7,8,11,12,13, provocazione di difensivo le risposte4,8, meccanicamente comprimendo il torace12,14,15,16, dissezione veleno ghiandole8,17 ,18,19,20,21,22e applicazione di agonisti del recettore muscarinico23. A giudicare i potenziali vantaggi e gli svantaggi di ogni metodo è complicata dalla morfologia delle ghiandole velenifere heteropteran, che consistono di una ghiandola principale con due separati lumen, la ghiandola principale anteriore (AMG) e la ghiandola principale posteriore (PMG), nonché un associato ghiandola accessoria (AG). Questi scomparti di diverse ghiandole producono secrezioni proteiche diverse, che possono essere specializzate per le diverse funzioni biologiche tra cui la cattura di prede, difesa e digestione extra-orale8,17. In peiratine ed ectrichodiine assassin bug, la AMG è stata associata con la cattura di prede e il PMG con digestione extra-orale17. Tuttavia, nel harpactorine bug Pristhesancus plagipennis PMG è specializzata per la cattura di prede e digestione mentre la AMG è supposto a secernere veleno difensivo8. L'AG è stato descritto come avendo poco funzione secretiva in assassin bug8 o come un importante sito di stoccaggio di proteasi in insetti giganti acqua23. Chiaramente, ulteriore lavoro è necessario per chiarire la funzione di ciascun comparto di ghiandola tra vari sottogruppi di heteropteran e per determinare la funzione della maggior parte delle tossine del veleno. In questo rapporto descriviamo i protocolli per la raccolta le tossine veleno da heteropterans verso questo obiettivo.

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Protocollo

Questo protocollo conforme alle politiche di The University of Queensland enunciati in Responsible Care e utilizzare degli animali nell'insegnamento e nella ricerca (PPL 4.20.11) così come il National Health e Medical Research Council codice australiano per la cura e uso di animali per fini scientifici (8th edizione 2013).

Attenzione: fare attenzione a non per essere envenomated quando si gestisce assassin bug. Fare attenzione a proteggere gli occhi quando si maneggia la specie che sputare veleno sulla difensiva. Prendersi cura in tutto di non ferire gli animali sperimentali. Questo include il monitoraggio della pressione sulle restrizioni come elastici e garantendo che la proboscide non è rotta.

Nota: Facoltativamente, anestetizzare gli animali tramite l'esposizione al CO2 per 0,5-2 min o raffreddamento a 4-10 ° C prima della raccolta di veleno mira 1-3 per facilitare il trasferimento sicuro e fermo. Anestetizzazione non è strettamente necessaria, ma può facilitare sicuro contenimento degli esemplari agili o forti. Tuttavia, gli animali devono essere svegli per consentire la raccolta di veleno. Mantenere le applicazioni a valle in mente quando si decide o meno di aggiungere gli inibitori della proteasi.

1. tossine veleno da elettrostimolazione di raccolta

  1. Ottenere esemplari vivi da cui raccogliere le tossine.
  2. Pinzette di plastica pre-preparate di uso con elettrodi positivi e negativi montato su qualsiasi suggerimento. Connettersi elettrificate pinzette un elettrostimolatore o una fonte di tensione costante che permette la regolazione della tensione.
    1. Per le piccole (~ 10 mm) e grandi (circa 25 mm) assassin bug, utilizzare tensioni di picco di 15 e 25 V rispettivamente.
    2. Per heteropterans più grandi come insetti giganti di acqua, utilizzare fino a 40 V.
  3. Trattenere gli insetti vivi di reggiatura li a una piattaforma, utilizzando un nastro di gomma sopra il torace.
  4. Posizionare la punta della proboscide in una punta di raccolta adatta. Per assassin bug, usare una punta di pipetta P200. Per insetti giganti di acqua, tagliare l'estremità fuori una punta di P200 per aumentare la dimensione dell'apertura.
    1. Sollevare la proboscide con un paio di pinzette pulite chiusi delicatamente e spingere il diaframma aperto della collezione punta sopra l'estremità della proboscide.
    2. Se lo si desidera, prima di mettere la proboscide nella raccolta dell'acqua ultrapura assorbimento ~ 5 µ l suggerimento. Questo riduce le perdite di veleno rimanendo all'interno della punta, anche se il veleno raccolto sarà diluito.
  5. Applicare l'elettrostimolazione. Immergere gli elettrodi stimolanti in gel conduttivo, come glicerolo NaCl/50% 2,5 M. Applicare gli elettrodi al torace. Per belostomatids, applicare i due elettrodi di superficie dorsale posteriore della testa.
  6. Memorizzare il veleno per evitare autodegradation. Dopo veleno viene estruso, rapidamente di trasferirla a un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.
  7. Ripetere i passaggi 1.5 e 1.6 è acquisito sufficiente veleno o nessun ulteriore veleno è imminente.

2. raccolta delle tossine veleno da molestie

  1. Preparare gli animali per la raccolta del veleno e posizionare la punta della proboscide in un vestibolo di collezione, come descritto nei paragrafi 1.1 e 1.3-1.4.
  2. Se il veleno viene estruso spontaneamente, passare al punto 2.3. In caso contrario, molestare gli animali toccandola delicatamente sulle gambe, addome e antenne con pinzette fino a quando il veleno è prodotto.
  3. Trasferire rapidamente il veleno in una provetta a-20 ° C o da-60 ° C o un inibitore della proteasi che contengono tubo cocktail, se lo si desidera.

3. raccolta delle tossine veleno da molestie da Venom "Sputare" specie

  1. Anestetizzare, o anestetizzare parzialmente, l'insetto prima di rimuoverla dal suo alloggiamento per prevenire qualsiasi prematuro sputare sulla difensiva.
  2. Provocare il comportamento di sputare veleno. Contenere e riposizionare l'insetto con il coperchio profondo della standard 90 x 16mm di Petri. Tenere il coperchio leggermente posteriore e 1-4 cm sopra l'insetto per impedire il volo. Maggior parte degli insetti sputerà spesso parecchie volte, in rapida successione. Garantire che tutti i venom sono raccolti sul lato inferiore del piatto.
  3. Raccogliere il veleno sulla parte inferiore del piatto Petri risciacquando con 10 µ l di acqua ultrapura. Rapidamente di trasferirlo in un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.

4. raccolta Venom tossine tramite la dissezione della ghiandola

  1. Sacrificare gli animali. Pesantemente anestetizzare o uccidere animali utilizzando > 5min esposizione al CO2. Tubo puro CO2 direttamente in aria-fori della recinzione di alloggiamento dell'animale.
  2. Insetto di pin al vassoio di dissezione. Per assassin bug, dissecare attraverso la superficie ventrale (4.3). Per insetti giganti di acqua, dissecare attraverso la superficie dorsale (4.4).
  3. Dissezione ventrale
    1. Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.
    2. Tagliare un'incisione del midline breve nella superficie ventrale dell'addome usando un bisturi in miniatura. Usare le forbici in miniatura per estendere l'incisione del midline anteriormente alla testa, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.
    3. Per esporre le strutture interne, rendono più tagli laterali che si estende dall'incisione del midline al lato dell'insetto. Quindi, pin indietro ogni lembo di esoscheletro ventrale per rivelare strutture interne.
    4. Per grande assassino insetti, fare quattro incisioni laterali, in metà di-addome, anteriore addome, tra le gambe di prime e seconda e di fronte la prima tappa.
  4. Dissezione dorsale
    1. Rimuovere le ali vicino alla base. Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.
    2. Tagliare un'incisione mediana dalla testa all'addome con delle miniatura forbici, bisturi, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.
    3. Forza a parte le due metà dell'insetto. Posto diversi pin lateralmente lungo la lunghezza dell'insetto per lasciare la cavità interna esposta.
    4. Rimuovere i muscoli di volo con una pinzetta.
  5. Inondare il vassoio di dissezione. Aggiungere PBS fino a quando il bug è sommerso per consentire strutture interne galleggiano ed essere più facilmente visualizzati.
  6. Micro-forbici e pinzette, rimuovere delicatamente con connettivo e tessuto nervoso e della trachea. Le ghiandole velenifere appaiono come allungata, costruzioni trasparenti che si estendono lungo ciascun lato del canale alimentare.
    1. Identificare la ghiandola principale per il suo aspetto caratteristico, con lobi anteriori e posteriori e due condotti incontro al hilus.
    2. Se lo si desidera, è possibile identificare la ghiandola accessoria tracciando il condotto da hilus. Gratis la ghiandola principale tagliando i due condotti che emana dal hilus.
  7. Raccogliere i lumen della ghiandola desiderata. Trasferire la ghiandola in una microcentrifuga sul ghiaccio contenente 30 µ l di PBS o PBS più inibitore di proteasi cocktail. Lancia le ghiandole con un pin pulito tagliente.
    1. Vortexare per 10 s e centrifugare (1 min, 5.000 × g, 4 ° C) per svuotare i lumen della ghiandola. Rimuovere il tessuto ghiandolare con una pinzetta.
  8. Chiarire l'Estratto di tossina. Centrifugare (5 min, 17.000 × g, 4° C) per rimuovere eventuali particelle solide, conservando il supernatante e scartando il pellet. Conservare a-20 ° C o da-60 ° C per evitare la degradazione di autoproteolytic.

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Risultati

Alcune specie di heteropteran, come harpactorine p. plagipennis e il reduviine Platymeris rhadamanthus, resa in modo affidabile grandi quantità (5-20 µ l) di veleno in risposta all'elettrostimolazione (tabella 1). In generale, peiratine, reduviine e harpactorine maggior parte dei bug resa veleno in risposta a questo metodo. Tra stenopodaine bug, elettrostimolazione ha suscitato veleno da sp. Oncocephalus ma non Thodelmus sp. I bug di ...

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Discussione

La fase più critica nella raccolta del veleno assassin bug sta selezionando il metodo appropriato a seconda della finalità dello studio. Ognuno dei tre metodi presentati per la raccolta heteropteran veleni ha vantaggi e svantaggi a seconda delle applicazioni a valle.

Inducendo il bug di espellere il veleno da proboscide (protocolli 1-3) evita la contaminazione del veleno dai tessuti ghiandolari. Inoltre, questi metodi sono non-letale e possono essere ripetuti più volte nel corso della vita ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Riconosciamo finanziari di sostegno dall'Australian Research Council (sovvenzioni DP130103813 e LP140100832 a G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 a ELHAJEB), l'Australian National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 a G.F.K.) e la University of Queensland (Postdoctoral Fellowship a A.A.W.).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ElectostimulatorGrass TechnologiesS48 Square Pulse StimulatorElectrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezersAustralian Entomological SuppliesE122BFor handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktailSigma4693124001For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipmentAustralian Entomological SuppliesE152MicroFor fine dissections
Insect pinsAustralian Entomological SuppliesE162For fine dissections

Riferimenti

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