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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aunque muchos insectos en el suborden Heteroptera (Insecta: Hemiptera) son venenoso, su composición del veneno y las funciones de las toxinas de su veneno son en su mayoría desconocidas. Este protocolo describe métodos para cosechar heteropteran venenos de más caracterización, mediante electroestimulación, acoso y disección de la glándula.

Resumen

Heteropteran insectos tales como chinches (Reduviidae) de asesino y gigante chinches de agua (Belostomatidae) descienden de un antepasado común de colocar y venenoso, y la mayoría de las heteropterans mantener esta estrategia trófica. Algunos heteropterans han pasaron a alimentarse de sangre vertebrado (como vinchucas, Triatominae; y chinches, Cimicidae) mientras otros han vuelto a alimentarse de las plantas (la mayoría Pentatomomorpha). Sin embargo, a excepción de saliva utilizado por vinchucas para facilitar la alimentación de sangre, poco se sabe sobre venenos heteropteran comparados con los venenos de arañas, escorpiones y serpientes.

Uno de los obstáculos a la caracterización de las toxinas del veneno de la heteropteran es la estructura y función de las glándulas de veneno labial, que son morfológicamente complejos y realizar múltiples funciones biológicas (defensa, captura de presas y digestión extra oral). En este artículo, se describen tres métodos que hemos utilizado con éxito para recoger heteropteran venenos. En primer lugar, presentamos la electroestimulación como una manera conveniente de recoger veneno que suele ser letal cuando se inyecta en animales de presa, y que evita la contaminación por el tejido glandular. En segundo lugar, mostramos que el acoso suave de animales es suficiente para producir extrusión de veneno de la probóscide o veneno escupe en algunos grupos de heteropterans. En tercer lugar, se describen métodos para sacar las toxinas del veneno por la disección de animales anestesiados para obtener de las glándulas de veneno. Este método es complementario a otros métodos, como pueden permitir extracción de toxinas de taxa en los que la electroestimulación y el acoso son ineficaces. Estos protocolos permiten a los investigadores recoger toxinas de insectos heteropteran para la caracterización de la estructura y función y posibles aplicaciones en medicina y agricultura.

Introducción

Heteropteran venenos son sustancias potencialmente bioactivas1. Por ejemplo, las secreciones de saliva/veneno de Heteroptera alimentan de sangre como vinchucas (Triatominae) y chinches de cama (Cimicidae) facilita la alimentación alteran la hemostasia2. Las toxinas de estos venenos objetivo múltiples vías incluyendo la coagulación, agregación plaquetaria y vasoconstricción, así como el dolor y pican caminos. Venenos de la mayoría de otras especies de heteropteran se adaptan para facilitar la depredación más que alimentan de sangre. Sus venenos causan parálisis, muerte y licuefacción del tejido cuando se inyecta en invertebrados3,4. Cuando se inyecta en los vertebrados, su veneno también puede tener efectos drásticos. Por ejemplo, inyección de veneno de insecto asesino Holotrichius innesi en vertebrados provoca parálisis del músculo, dolor y hemorragia; ratones envenomated por este fallo mueren rápidamente debido a la parálisis respiratoria5.

Estudios transcriptómicos, proteómicos han revelado la composición proteica de algunos venenos heteropteran. Venenos de las especies depredadoras son ricos en proteasas, enzimas y péptidos y proteínas de estructura desconocida y función6,7,8. Veneno de la vinchuca es rica en la familia de proteínas de triabin, cuyos miembros afectan profundamente a la coagulación, agregación plaquetaria y vasoconstricción2,9. Sin embargo, no se sabe que las toxinas subyacen la mayoría bioactividades del veneno. Por ejemplo, veneno de la vinchuca Triatoma infestans se ha divulgado para ser analgésico e inhibir los canales de sodio10, pero los componentes responsables siguen siendo ser aclarado. Asimismo, no se sabe qué componentes del veneno de insecto asesino de causan dolor o parálisis. Un requisito previo para identificar las toxinas responsables bioactividades veneno particular y para la caracterización de la estructura y función de las toxinas del veneno de la novela, es la obtención de veneno.

Veneno ha sido obtenido de heteropterans por electroestimulación5,6,7,8,11,12,13, provocación de defensiva respuestas4,8, mecánicamente exprimiendo el tórax12,14,15,16, disección de las glándulas de veneno8,17 ,18,19,20,21,22y la aplicación de agonistas del receptor muscarínico23. Juzgar las posibles ventajas y desventajas de cualquier método es complicado por la morfología de glándulas heteropteran, que consisten en una glándula principal con dos lúmenes separados, la glándula principal anterior (AMG) y posterior glándula principal (PMG), así como un glándula accesoria asociada (AG). Estos compartimientos diferentes glándulas producen secreciones diferentes de proteínas, que pueden ser especializadas para diferentes funciones biológicas incluyendo la captura de presas, defensa y digestión extra oral8,17. En peiratine y ectrichodiine insectos de asesino, el AMG se ha asociado con la captura de presas y el PMG con digestión extra oral17. Sin embargo, en el harpactorine error plagipennis de Pristhesancus el PMG está especializada para la captura de presas y la digestión mientras que el AMG se presume para secretar veneno defensivo8. El AG se ha descrito como teniendo poca función secretora en insectos asesinos8 o como un sitio principal de almacenamiento de información de proteasa en chinches de agua gigantes23. Claramente, más trabajo es necesario aclarar la función de cada compartimiento de la glándula entre distintos subgrupos de heteropteran y para determinar la función de más toxinas del veneno. En este informe se describen los protocolos para la recolección de las toxinas del veneno de heteropterans hacia esta meta.

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Protocolo

Este protocolo cumple con la política de la Universidad de Queensland en el cuidado responsable y uso de animales en docencia e investigación (PPL 4.20.11) así como la Nacional de salud y de Consejo de investigación médica Código Australiano para el cuidado y uso de animales para fines científicos (8th edición 2013).

PRECAUCIÓN: tenga cuidado para no ser envenomated al manipular insectos asesinos. Tenga cuidado para proteger los ojos al manipular especies que escupen veneno defensivo. Tenga cuidado en no para herir a los animales experimentales. Esto incluye la monitorización de la presión sobre restricciones tales como gomas y asegurando que la probóscide no está rota.

Nota: Opcionalmente, anestesiar animales por la exposición a CO2 por 0.5-2 min o 4-10 ° c de enfriamiento antes de la cosecha de veneno en tiene como objetivo 1-3 para facilitar la transferencia segura y moderación. Para la anestesia no es estrictamente necesaria pero puede facilitar la sujeción segura de ejemplares ágiles y fuertes. Sin embargo, animales deben estar despiertos para permitir la recolección de veneno. Tener aplicaciones posteriores en cuenta al decidir si o no agregar inhibidores de la proteasa.

1. extracción de toxinas del veneno por electroestimulación

  1. Obtener a especímenes vivos de que cosecha las toxinas.
  2. Pinzas plásticas preparadas de uso con los electrodos positivos y negativos montan en cada extremo. Conectar pinzas electrificadas a un electroestimulador o una fuente de tensión constante que permite el ajuste de la tensión.
    1. De pequeño (~ 10 mm) y grande (~ 25 m m) insectos de asesino, utilizar tensiones de pico de 15 y 25 V respectivamente.
    2. Para mayor heteropterans como chinches de agua gigantes, usar hasta 40 V.
  3. Contener errores vivo por cercar a una plataforma, usando una banda elástica sobre el tórax.
  4. Coloque la punta de la probóscide en una punta de recogida adecuada. Insectos de asesino, utilice una punta de pipeta P200. Gigante chinches de agua, cortar la extremidad de una punta de P200 para aumentar el tamaño de la abertura.
    1. Suavemente Levante la probóscide con una pinzas limpiamos cerrado y empuje la abertura abierta de la punta de la colección sobre el final de la probóscide.
    2. Si lo desea, punta de agua ultrapura de absorción ~ 5 μl antes de colocar la probóscide en la recolección. Esto reduce las pérdidas de veneno restante dentro de la punta, aunque el veneno cosechado se diluirá.
  5. Aplicar electroestimulación. Sumergir los electrodos estimulantes en gel conductor, tales como 2, 5 M NaCl/50% glicerol. Aplique los electrodos en el tórax. Para belostomatids, aplicar los dos electrodos a la superficie dorsal posterior de la cabeza.
  6. Almacenar el veneno para evitar autodegradation. Después se saca el veneno, transferir rápidamente a un tubo a-20 ° C o -60 ° C, o un tubo que contiene el cóctel de inhibidor de la proteasa.
  7. Repita los pasos del 1.5 y 1.6 hasta que se adquiere la suficiente veneno o no hay veneno más próxima.

2. extracción de toxinas del veneno por acoso

  1. Preparar animales para cosechar el veneno y la punta de la probóscide en un vestíbulo de colección, como se describe en los subapartados 1.1 y 1.3-1.4.
  2. Si espontáneamente se saca veneno, vaya al paso 2.3. Si no, acosar a los animales tocándolo suavemente en las piernas, abdomen y antenas con pinzas hasta que se produce el veneno.
  3. Transferir rápidamente veneno a un tubo a-20 ° C o -60 ° C o un tubo que contiene inhibidor de la proteasa coctel, si lo desea.

3. extracción de toxinas del veneno por el acoso de "Escupir" especie de veneno

  1. Anestesiar o anestesie parcialmente, el insecto antes de sacar de su gabinete para evitar cualquier escupir defensiva prematura.
  2. Provocar la conducta de escupir veneno. Contienen y vuelva a colocar el insecto usando la tapa profunda de un estándar 90 x 16 mm plato de Petri. Sostenga la tapa ligeramente posterior y 1-4 cm por encima de los insectos para evitar que el vuelo. Mayoría de los insectos escupirá varias veces, a menudo en rápida sucesión. Asegúrese de que todo veneno es recogido en la parte inferior del plato.
  3. Recoger el veneno en la parte inferior de la caja Petri mediante enjuague con 10 μl de agua ultrapura. Transferir rápidamente a un tubo a-20 ° C o -60 ° C, o un tubo que contiene el cóctel de inhibidor de la proteasa.

4. extracción de toxinas del veneno por la disección de la glándula

  1. Sacrificio de animales. Muy anestesiar o matar animales con > 5 minutos de exposición al CO2. Tubo de puro CO2 directamente en los agujeros de aire de cerramiento de cubierta del animal.
  2. Insecto de PIN a la bandeja de disección. Insectos de asesino, disecar a través de la superficie ventral (4.3). Para chinches de agua gigantes, disecar a través de la superficie dorsal (4.4).
  3. Disección ventral
    1. Inserte las clavijas de tres en el abdomen posterior presionado el insecto sin pinchar las glándulas de veneno.
    2. Cortar una incisión de línea media corta en la superficie ventral del abdomen con un bisturí miniatura. Utilizar tijeras de miniatura para extender la incisión de línea media anterior a la cabeza, teniendo cuidado de cortar sólo el exoesqueleto y no dañar las estructuras internas.
    3. Para exponer las estructuras internas, hacer varios cortes laterales que se extienden desde la incisión de línea media hacia el lado del insecto. Entonces, el perno detrás cada aleta de exoesqueleto ventral para revelar las estructuras internas.
    4. Grandes insectos de asesino, hacer cuatro incisiones laterales, en el abdomen abdomen medio, anterior, entre las piernas primeras y segunda y delante de la primera etapa.
  4. Disección dorsal
    1. Quitar las alas cerca de la base. Inserte las clavijas de tres en el abdomen posterior presionado el insecto sin pinchar las glándulas de veneno.
    2. Cortar una incisión de línea media de la cabeza al abdomen con miniatura tijeras y bisturí, teniendo cuidado de cortar sólo el exoesqueleto y no dañar las estructuras internas.
    3. Fuerza aparte de las dos mitades del insecto. Colocar varios pernos lateralmente a lo largo de la longitud del insecto a salir de la cavidad interna expuesta.
    4. Quitar los músculos de vuelo con unas pinzas.
  5. Inunde la bandeja de disección. Añadir PBS hasta que el fallo esté sumergido para permitir que las estructuras internas flotan para arriba y ser más fácilmente visualizado.
  6. Utilizando pinzas y tijeras micro, retire con cuidado conectivo y tejido nervioso y la tráquea. Las glándulas de veneno aparecen como alargado, estructuras translúcidas que se extiende a lo largo de cada lado del canal alimenticio.
    1. Identificar la glándula principal por su aspecto característico, con lóbulos anteriores y posteriores y los dos conductos en el hilio.
    2. Si lo desea, identificar la glándula accesoria trazando el conducto desde el hilio. Libre la glándula principal, cortando los dos conductos que emana desde el hilio.
  7. Cosechar los lúmenes glándula deseada. Transferencia de la glándula en una microcentrífuga en hielo con 30 μl de PBS o PBS plus inhibidor de la proteasa cóctel. Lanza las glándulas con un alfiler limpio agudo.
    1. Vortex de 10 s y centrífuga (1 min, 5.000 × g, 4 º C) para vaciar los lúmenes de la glándula. Eliminar el tejido glandular con unas pinzas.
  8. Aclarar el extracto de la toxina. Centrífuga (5 min, 17.000 x g, 4° C) para extraer las partículas sólidas, conservar el sobrenadante y desechar el precipitado. Almacenar a-20 ° C o -60 ° C para evitar la degradación de autoproteolytic.

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Resultados

Algunas especies heteropteran como la harpactorine p. plagipennis y el reduviine Platymeris Radamanto, fiable rendimiento grandes cantidades (5-20 μl) de venom en respuesta a la electroestimulación (tabla 1). En general, más peiratine, reduviine y harpactorine bugs rendimiento veneno en respuesta a este método. Entre stenopodaine bugs, electroestimulación produce veneno de Oncocephalus SP., pero no Thodelmus sp. Los errores holopti...

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Discusión

El paso más crítico en la recolección de veneno de insecto asesino es seleccionar el método apropiado dependiendo de los propósitos del estudio. Cada uno de los tres métodos presentados para la recolección de heteropteran venenos tiene ventajas y desventajas dependiendo de aplicaciones posteriores.

Inducir a errores a expulsar el veneno de la probóscide (protocolos 1-3) evita la contaminación de veneno por los tejidos glandulares. Además, estos métodos son no letales y pueden repeti...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos financieros de apoyo del Consejo australiano de investigación (becas DP130103813 y LP140100832 a G.F.K., DECRAN beca DE160101142 a EABU), el Australian National Health & Medical Research Council (beca de investigación Principal APP1044414 a G.F.K.) y la Universidad de Queensland (Beca Postdoctoral a A.A.W.).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
ElectostimulatorGrass TechnologiesS48 Square Pulse StimulatorElectrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezersAustralian Entomological SuppliesE122BFor handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktailSigma4693124001For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipmentAustralian Entomological SuppliesE152MicroFor fine dissections
Insect pinsAustralian Entomological SuppliesE162For fine dissections

Referencias

  1. Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43(2016).
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  4. Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
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  7. Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
  8. Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755(2018).
  9. Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44(2016).
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  16. Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
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  26. Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
  27. Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).

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