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Resumo

Embora muitos insetos da subordem Heteroptera (Insecta: Hemiptera) são venenosa, sua composição de veneno e as funções das suas toxinas de veneno em sua maioria são desconhecidas. Este protocolo descreve métodos para colher heteropteran venenos para mais de caracterização, utilizando a eletroestimulação, assédio e dissecação da glândula.

Resumo

Heteropteran insetos como barbeiros (Reduviidae) e bugs de água gigante (Belostomatidae) descendem de um ancestral comum de predadores e venenoso, e a maioria dos heteropterans existentes manter esta estratégia trófica. Alguns heteropterans ter transferida para alimentando-se de sangue de vertebrados (como os kissing bugs, triatomíneos; e percevejos, Cimicidae) enquanto outros foram revertidos para a alimentação das plantas (mais Pentatomomorpha). No entanto, com exceção de saliva usada por kissing bugs para facilitar a alimentação de sangue, pouco é conhecido sobre venenos de heteropteran em comparação com os venenos de aranhas, escorpiões e cobras.

Um obstáculo para a caracterização de toxinas de veneno de heteropteran é a estrutura e função das glândulas de veneno/labial, que são ambos morfologicamente complexos e executar várias funções biológicas (defesa, captura de presas e digestão extra oral). Neste artigo, descrevemos três métodos que usamos com sucesso para coletar heteropteran venenos. Primeiro, apresentamos a eletroestimulação como uma maneira conveniente para coletar o veneno que muitas vezes é letal quando injetado em animais de rapina, e que elimina a contaminação por tecido glandular. Em segundo lugar, nós mostramos que o assédio suave dos animais é suficiente para produzir a extrusão do veneno do narigudo e/ou veneno cuspir em alguns grupos de heteropterans. Em terceiro lugar, descrevemos os métodos para recolher as toxinas de veneno por dissecação de animais anestesiados para obter as glândulas de veneno. Este método é complementar a outros métodos, como podem permitir colheita de toxinas de táxons em que a eletroestimulação e assédio são ineficazes. Estes protocolos permitirá que pesquisadores colher as toxinas do heteropteran insetos para caracterização de estrutura-função e possíveis aplicações na medicina e na agricultura.

Introdução

Heteropteran venenos são substâncias bioativas potente1. Por exemplo, a secreção de veneno/saliva de sangue-alimentação Heteroptera como kissing bugs (Triatominae) e percevejos (Cimicidae) facilita a alimentação por perturbar a hemostasia2. Toxinas nestes venenos alvo de múltiplas vias, incluindo a coagulação, agregação plaquetária e vasoconstrição, bem como a dor e coceira caminhos. Venenos da maioria das outras espécies de heteropteran são adaptados para facilitar a predação, ao invés de sangue-alimentação. Seus venenos de causam paralisia, morte e liquefação do tecido quando injetado em invertebrados3,4. Quando injetado em animais vertebrados, seu veneno também pode ter efeitos drásticos. Por exemplo, injeção de veneno do inseto assassino Holotrichius innesi em vertebrados causa dor, paralisia muscular e hemorragia; envenomated de ratos por este bug morrer rapidamente devido a paralisia respiratória5.

Transcriptomic e proteomic estudos revelaram a composição de proteína de alguns venenos de heteropteran. Venenos de espécies de predadores são ricos em proteases, outras enzimas e peptídeos e proteínas de estrutura desconhecida e função6,7,8. Kissing bug veneno é rico em triabin proteína da família, cujos membros afetam profundamente a coagulação, agregação plaquetária e vasoconstrição2,9. No entanto, não se sabe quais toxinas subjazem a maioria dos bioactivities de veneno. Por exemplo, o veneno do kissing bug Triatoma infestans foi relatado para ser analgésico e inibe canais de sódio10, mas os componentes responsáveis continuam a ser elucidado. Da mesma forma, não se sabe qual componente ou componentes do veneno de inseto assassino causam paralisia ou dor. Um pré-requisito para identificar as responsável pela bioactivities de veneno especial e para caracterizar a estrutura e função de toxinas de veneno de romance, de toxinas é a obtenção de veneno.

Veneno foi obtido de heteropterans por eletroestimulação5,6,7,8,11,12,13, provocação de defensiva respostas4,8, mecanicamente, apertando o tórax12,14,15,16, dissecando fora as glândulas de veneno8,17 ,18,19,20,21,22e aplicação dos agonistas dos receptores de acetilcolina muscarínicos23. Julgar as potenciais vantagens e desvantagens de qualquer método é complicada pela morfologia das glândulas de veneno heteropteran, que consistem de uma glândula principal com dois lúmens separadas, a glândula principal anterior (AMG) e posterior principal glândula (PMG), bem como um associado a glândula acessória (AG). Esses compartimentos diferentes glândulas produzem secreção de proteínas diferentes, que pode ser especializada para diferentes funções biológicas, incluindo a captura de presas, defesa e digestão extra oral8,17. Em peiratine e ectrichodiine barbeiros, a AMG tem sido associada com a captura de presas e a PMG com digestão extra oral17. No entanto, no harpactorine bug Pristhesancus plagipennis o PMG é especializado para captura de presas e digestão Considerando que a AMG é a hipótese da secretar veneno defensivo8. A AG tem sido descrito como tendo pouca função secretora em barbeiros8 ou como um importante local de armazenamento de protease em bugs de água gigante23. Claramente, mais trabalho é necessário para esclarecer a função de cada compartimento de glândula entre vários subgrupos de heteropteran e para determinar a função da maioria das toxinas do veneno. Neste relatório, descrevemos protocolos para colheita de toxinas de veneno de heteropterans em direção a esse objetivo.

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Protocolo

Este protocolo está em conformidade com a política da Universidade de Queensland estabelecida no cuidado responsável e uso de animais em ensino e pesquisa (PPL 4.20.11), bem como a saúde nacional e do Medical Research Council código australiano para o cuidado e uso de animais para fins científicos (8th edição 2013).

Atenção: Tome cuidado para não ser envenomated quando estiver manipulando barbeiros. Tome cuidado para proteger os olhos ao manusear espécies que cuspir veneno defensivamente. Tome cuidado ao longo para não machucar os animais experimentais. Isso inclui monitoramento de pressão às restrições tais como elásticos e garantindo que o narigudo não está quebrado.

Nota: Opcionalmente, anestesiar animais pela exposição ao CO2 para 0,5-2 min ou resfriamento de 4-10 ° C antes da colheita de veneno em visa 1-3 para facilitar a transferência segura e contenção. Anaesthetization não é estritamente necessário, mas pode facilitar a contenção segura de espécimes ágil ou fortes. No entanto, os animais devem ser acordados para permitir que o veneno da colheita. Lembre-se aplicações a jusante ao decidir se deve ou não adicionar inibidores de protease.

1. colheita de toxinas de veneno por eletroestimulação

  1. Obter espécimes vivos de que a colheita de toxinas.
  2. Pinça de plástico pré-preparadas uso com eletrodos positivos e negativos montado em qualquer dica. Ligue pinça eletrificada a uma Chatta ou uma fonte de tensão constante, o que permite o ajuste da tensão.
    1. Para as pequenas (~ 10 mm) e grande (~ 25mm) barbeiros, use tensões de pico de 15 e 25 V respectivamente.
    2. Para maiores heteropterans como bugs de água gigante, use até 40 V.
  3. Contenha erros ao vivo amarrando-os para uma plataforma, usando uma faixa de borracha sobre o tórax.
  4. Coloque a ponta do probóscide em uma dica de recolha apropriada. Para barbeiros, use uma ponta de pipeta P200. Para bugs de água gigante, corte a extremidade uma ponta de P200 para aumentar o tamanho da abertura.
    1. Delicadamente levante a tromba com um par fechado de uma pinça limpa e empurre a abertura da ponta da coleção sobre o fim do probóscide.
    2. Se desejar, água ultrapura de captação ~ 5 µ l antes de colocar a tromba para a coleta de uma dica. Isto reduz perdas de veneno, permanecendo dentro da ponta, apesar do veneno colhido será diluído.
  5. Aplica a eletroestimulação. Mergulhe os eléctrodos estimulantes em gel condutor, tais como 2,5 M NaCl/50% de glicerol. Aplica os eléctrodos no tórax. Para belostomatids, aplicam-se os dois eletrodos de superfície dorsal posterior da cabeça.
  6. Armazenar o veneno para evitar autodegradation. Depois de veneno é extrudado, transferi-lo rapidamente para um tubo a-20 ° C ou -60 ° C, ou um tubo contendo coquetel de inibidor de protease.
  7. Repita as etapas de 1.5 e 1.6 até veneno suficiente é adquirido ou sem veneno mais próximo.

2. a colheita de toxinas de veneno por assédio

  1. Preparar os animais para colheita de veneno e colocar a ponta da probóscide em um vestíbulo de coleção, conforme descrito nas subseções 1.1 e 1.3-1.4.
  2. Se o veneno é expulso espontaneamente, vá para o passo 2.3. Se não, assediar os animais tocando isso nas pernas, abdômen e antenas com uma pinça até veneno é produzido.
  3. Rapidamente transferi veneno para um tubo de-20 ° C-60 ° C, ou um tubo contendo inibidor da protease cocktail, se desejado.

3. a colheita de toxinas de veneno por assédio de "Cuspir" espécie de veneno

  1. Anaesthetize, ou anaesthetize em parte, o inseto antes de removê-lo do seu gabinete para evitar qualquer prematuro cuspindo na defensiva.
  2. Provoca o veneno cuspindo o comportamento. Conter e reposicionar o inseto usando a tampa profunda de um padrão de 90 x 16 mm placa de Petri. Segure a tampa ligeiramente posterior e 1-4 cm acima do inseto para impedir o voo. A maioria dos insetos vão cuspir várias vezes, muitas vezes em sucessão rápida. Certifique-se de que todo veneno é coletado na parte inferior do prato.
  3. Colete o veneno na parte inferior da caixa de Petri enxaguando com 10 µ l de água ultrapura. Rapidamente transferi-lo para um tubo a-20 ° C ou -60 ° C, ou um tubo contendo coquetel de inibidor de protease.

4. colheita de toxinas de veneno por dissecação da glândula

  1. Sacrificar animais. Fortemente anestesiar ou matar animais usando > 5 min exposição ao CO2. Canalize o puro CO2 diretamente para os buracos de ar do compartimento de habitação do animal.
  2. Inseto de PIN para bandeja de dissecação. Para barbeiros, disse através da superfície ventral (4.3). Para bugs de água gigante, disse através da superfície dorsal (4.4).
  3. Ventral dissecação
    1. Inserir três pinos do abdômen posterior para segurar o inseto sem perfurar as glândulas de veneno.
    2. Corte uma pequena incisão na superfície ventral do abdômen com um bisturi em miniatura. Use tesoura miniatura para estender a incisão anterior para a cabeça, tendo o cuidado de cortar o exoesqueleto apenas e não danificar estruturas internas.
    3. Para expor as estruturas internas, fazer vários cortes laterais, estendendo-se desde a incisão mediana para o lado do inseto. Em seguida, pino volta cada retalho de exoesqueleto ventral para revelar as estruturas internas.
    4. Para grandes barbeiros, fazer quatro incisões laterais, no abdômen médio abdome, anterior, entre as pernas do primeiras e segunda e na frente da perna primeira.
  4. Dorsal-dissecação
    1. Retire as asas perto da base. Inserir três pinos do abdômen posterior para segurar o inseto sem perfurar as glândulas de veneno.
    2. Corte uma incisão mediana da cabeça, no abdômen usando miniatura tesouras e bisturi, tendo o cuidado de cortar o exoesqueleto apenas e não danificar estruturas internas.
    3. Força as duas metades do inseto. Coloque vários pinos lateralmente ao longo do comprimento do inseto para deixar a cavidade interna exposta.
    4. Remova os músculos de voo usando uma pinça.
  5. Inunde a bandeja de dissecação. Adicione PBS até que o bug está submersa para permitir que estruturas internas flutuam acima e ser mais facilmente visualizado.
  6. Usando uma pinça e microtesoura, cuidadosamente remova conjuntivo e o tecido nervoso e traqueia. As glândulas de veneno aparecem como alongado, estruturas translúcidas, estendendo-se ao longo de cada lado do canal alimentar.
    1. Identifica a principal glândula pelo seu aspecto característico, com lobos anteriores e posteriores e duas condutas de reunião para o Hilo.
    2. Se desejado, identifica a glândula acessória ao traçar a conduta do hilo. Livre a principal glândula cortando as duas condutas que emana o Hilo.
  7. Colha os lúmens glândula desejado. Transferir a glândula para microcentrifuga de gelo contendo 30 µ l de PBS ou PBS e coquetel de inibidor de protease. Lance as glândulas com um pino afiada limpa.
    1. Vórtice de 10 s e centrífuga (1 min, 5.000 × g, 4 ° C) para esvaziar os lúmens da glândula. Remova o tecido glandular, usando uma pinça.
  8. Clarificar o extrato de toxina. Centrífuga (5 min, 17.000 × g, 4° C) para remover quaisquer partículas sólidas, retendo o sobrenadante e descartando a pelota. Armazenar a-20 ° C ou -60 ° C para evitar a degradação de autoproteolytic.

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Resultados

Algumas espécies de heteropteran, como o harpactorine p. plagipennis e o reduviine Platymeris Radamanto, confiantemente produzem grandes quantidades (5-20 µ l) de veneno em resposta a eletroestimulação (tabela 1). Em geral, a maioria dos erros de peiratine, reduviine e harpactorine produzem veneno em resposta a esse método. Entre stenopodaine bugs, eletroestimulação suscitou veneno de Oncocephalus SP. mas não Thodelmus sp. Os er...

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Discussão

O passo mais crítico na colheita veneno de inseto assassino está selecionando o método apropriado dependendo os propósitos do estudo. Cada um dos três métodos apresentados para colheita heteropteran venenos tem vantagens e desvantagens dependendo de aplicações a jusante.

Indução de bugs para expelir o veneno de probóscide (protocolos de 1-3) evita a contaminação de veneno por tecidos glandulares. Além disso, esses métodos são não-letal e podem ser repetidos muitas vezes ao lon...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos financeiras suporte do Conselho australiano de pesquisa (bolsas DP130103813 e LP140100832 para G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 para EABU), o Australian National Health & Medical Research Council (bolsa de pesquisa Principal APP1044414 para G.F.K.) e a Universidade de Queensland (Postdoctoral Fellowship para A.A.W.).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ElectostimulatorGrass TechnologiesS48 Square Pulse StimulatorElectrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezersAustralian Entomological SuppliesE122BFor handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktailSigma4693124001For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipmentAustralian Entomological SuppliesE152MicroFor fine dissections
Insect pinsAustralian Entomological SuppliesE162For fine dissections

Referências

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