توليد نموذج سرطان الثدي المنتشر مورين أورثوتوبيك والقيام باستئصال الثدي الجذري مورين

Summary

نحن نقدم استئصال الثدي الجذري ونموذج سرطان الثدي مورين أورثوتوبيك مع تقنية الإضاءة الحيوية لتقدير عبء الورم لمحاكاة تطور سرطان الثدي البشرية.

Abstract

ماوس المجراة في نماذج لتقييم تطور سرطان الثدي ضرورية لبحوث السرطان، بما في ذلك التطورات العقاقير السريري. ومع ذلك، يتم حذف معظم التفاصيل العملية والتقنية عادة في نشر المخطوطات التي، لذلك، يجعل من تحدي إعادة إنتاج النماذج، وبخاصة عندما تنطوي على التقنيات الجراحية. تسمح تكنولوجيا الإضاءة الحيوية لتقييم كميات صغيرة من الخلايا السرطانية حتى عندما لا يكون وجود ورم محسوس. استخدام التعبير عن لوسيفراس الخلايا السرطانية، نقوم بإنشاء تقنية تطعيم أورثوتوبيك سرطان الثدي بنسبة توموريجينيسيس عالية. ورم خبيث في الرئة ويتم تقييم استخدام أسلوب السابقين فيفو . ثم، نحن، وضع نموذج استئصال الثدي بمعدل تكرار منخفض محلية لتقييم عبء الورم المنتشر. هنا، يصف لنا، بالتفصيل، التقنيات الجراحية لزرع أورثوتوبيك واستئصال الثدي لسرطان الثدي بنسبة توموريجينيسيس عالية ومعدلات تكرار المحلية منخفضة، على التوالي، لتحسين كفاءة نموذج سرطان الثدي.

Introduction

نماذج حيوانية تلعب دوراً رئيسيا في أبحاث السرطان. عندما ثبت فرضية في المختبر، فإنه ينبغي اختبار المجراة لتقييم أهميتها السريرية. وتطور سرطان خبيث يتم التقاطها غالباً أفضل من النماذج الحيوانية مقارنة بنماذج في المختبر، ومن الضروري لاختبار دواء جديد في نموذج حيوان كدراسة الإكلينيكية للمخدرات التنمية^1،2. بيد أن التفاصيل التقنية للتجارب على الحيوانات غالباً ما ليست وصفاً جيدا في المواد المنشورة، ويجعلها صعبة استخراج النموذج بنجاح. في الواقع، ذهب المؤلفون الذين قاموا بتأسيس هذه النماذج التطعيم واستئصال الثدي أورثوتوبيك من خلال عمليات طويلة وصارمة من التجربة والخطأ. دراسة معدل نجاح tumorigenesis بعد تلقيح خلايا السرطان هو أحد العوامل الرئيسية تحديد مدى نجاح وكفاءة الحيوان³. خط الخلية والعدد من الخلايا لتطعيم وتلقيح الموقع والسلالة من الفئران، كلها عوامل هامة. فمن المعروف جيدا أن هناك اختلافات كبيرة في نتائج التجارب على الحيوانات بسبب الفروق الفردية، مقارنة بتقنيات في المختبر. ولذلك، باستخدام نموذج راسخة مع تقنية قياسية من المهم الحصول على نتائج مستقرة، لتحسين الكفاءة التجارب على الحيوانات، وتجنب نتائج مضللة.

وتقدم هذه الورقة تقنيات راسخة⁴ لتوليد نماذج الماوس أورثوتوبيك واستئصال سرطان الثدي. تهدف هذه الأساليب 1) تحاكي تطور سرطان الثدي البشرية ودورات العلاج، و 2) لإجراء تجارب في المجراة مع قدر أكبر من الكفاءة ومعدلات نجاح أعلى مقارنة بتقنيات استئصال الثدي أو تطعيم سرطان الثدي الأخرى. في تلقيح خلايا السرطان أورثوتوبيك، لمحاكاة تطور سرطان الثدي البشرية، نختار اللوحة #2 الدهون الثديية كموقع لتطعيم، الذي يقع في الصدر. وفي معظم الدراسات، يتم تلقيح خلايا سرطان الثدي تحت الجلد⁵. هذا الأسلوب لا يتطلب عملية جراحية، وهكذا، بسيط ومباشر. ومع ذلك، المكروية تحت الجلد يختلف تماما عن المكروية الغدة الثديية، الذي يؤدي إلى تطور سرطان مختلفة وملامح الجزيئية حتى^6،7. استخدام بعض الدراسات الغدة الثديية #4، الذي يقع في البطن، كما موقع تطعيم⁶. لكن منذ #4 الغدد الثديية الموجودة في البطن، هو النمط المنتشر الأكثر شيوعاً سرطاني البريتوني⁷، الذي يحدث مع أقل من 10 في المائة من سرطان الثدي المنتشر⁸. سرطان الثدي التي تولدها هذه التقنية المقدمة هنا، في الغدة الثديية #2، مستطير للرئة، وواحد من المواقع المنتشر من سرطان الثدي الأكثر شيوعاً⁹.

مع هذا الأسلوب، الهدف أيضا لتحقيق معدل أعلى tumorigenesis مع تقلب حجم الورم أقل مقارنة بغيرها من تقنيات التطعيم سرطان الثدي. للقيام بذلك، يتم تلقيح خلايا السرطان قد علقت في خليط بروتين هلامية تحت الرؤية المباشرة من خلال شق جدار صدر أمامي متوسط. ينتج هذا الأسلوب بمعدل توموريجينيسيس عالية مع أقل تغير في حجم الورم والشكل مقارنة بالحقن تحت الجلد أو غير الجراحية، كما ذكر سابقا^3،7.

ونحن أيضا إدخال تقنية استئصال الثدي جذري ماوس الذي هو مستأصل أورثوتوبيك الثدي الورم مع الأنسجة المحيطة به والعقد الليمفاوية إبطي. في الإعداد السريرية، هو مستوى الرعاية لمرضى سرطان الثدي مرض خبيث البعيدة دون استئصال الثدي^10،11. قبل عملية استئصال الثدي، يتم مسح الانبثاث العقدة الليمفاوية إبطي بالتصوير والحارس خزعة العقدة الليمفاوية. إذا لم يكن هناك أي دليل على وجود ورم خبيث إبطي العقدة الليمفاوية، ثم يعالج المريض باستئصال الثدي التام أو الجزئي، الذي تم حذف استئصال العقدة الليمفاوية إبطي. استئصال الثدي التام تقنية للالتئام سرطان الثدي مع أنسجة الثدي كله كتلة، بينما يتم استئصال الثدي الجزئي الالتئام سرطان الثدي مع هامش المحيطة بأنسجة الثدي الطبيعية فقط، وبالتالي المحافظة على أنسجة الثدي الطبيعية المتبقية في المريض. ومع ذلك، تتطلب المرضى الذين الحفاظ على بقاء أنسجة الثدي الطبيعية بعد عملية استئصال الثدي جزئي العلاج الإشعاعي بعد الجراحة لتجنب تكرار المحلية¹⁰. المرضى الذين يعانون من ورم خبيث إبطي العقدة الليمفاوية القيام باستئصال الثدي الجذري الذي يزيل سرطان الثدي مع عادي جميع الثدي الليمفاوية الابطية والأنسجة، وغزت الأنسجة أون الكتلة^10،11. في طراز الماوس، مراقبة للإشعاع إبطي العقدة الليمفاوية خبيث و/أو مرحلة ما بعد المنطوق ليس معقولاً أو ممكناً. وهكذا، فنحن نستخدم تقنية استئصال الثدي الجذري لتجنب الانبثاث العقدة الليمفاوية المحلية أو إبطي.

سرطان الخلية التطعيم عن طريق الوريد الذيل هو الأكثر شيوعاً الرئة ورم خبيث الماوس نموذج¹²، ما يسمى "ورم خبيث التجريبية". هذا النموذج من السهل أن تولد ولا تتطلب عملية جراحية؛ ومع ذلك، لا تقليد تطور سرطان الثدي البشرية مما قد يتسبب في سلوك المرض المنتشر مختلفة. من أجل محاكاة دورة علاج سرطان الثدي البشرية حيث غالباً ما يحدث بعد استئصال الثدي ورم خبيث، تتم إزالة الورم الرئيسي بعد تلقيح خلايا السرطان أورثوتوبيك. هذا الأسلوب تنتج أقل تكرار المحلية مقارنة باستئصال ورم بسيط، كما ذكر سابقا¹³، وهو مفيد لرواية المداواة، الدراسات الإكلينيكية، ودراسات أبحاث سرطان الثدي المنتشر. وتطبق الأساليب الموصوفة هنا لمعظم تجارب نموذجية أورثوتوبيك سرطان الثدي. ومع ذلك، من المهم أن تنظر أن خليط البروتين هلامية يمكن أن تؤثر المكروية والجراحة يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية الإجهاد/¹⁴. ولذلك ينبغي تدرك إمكانات عوامل الالتباس المحققين يدرسون المكروية و/أو الاستجابة المناعية الإجهاد/.

Protocol

تم الحصول على الموافقة من روزويل بارك سرطان مركز المؤسسية الحيوان الرعاية الشاملة واستخدام اللجنة لجميع التجارب.

ملاحظة: يتم الحصول على تسعة إلى اثني عشر أسبوعا من العمر الإناث بالب/ج الفئران. وتستخدم الخلايا 4T1-luc2، ماوس غدية الثديية خلية خط المستمدة من بالب/ج الفئران التي تم إجراء هندسة عكسية للتعبير عن لوسيفراس،. تستزرع هذه الخلايا في المتوسط 1640 معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).

1-إعداد الصكوك

1. ذوبان الجليد خليط بروتين هلامية مجمدة (مثلاً، ماتريجيل) على الجليد في غطاء زراعة الأنسجة.
2. تنظيف والاوتوكلاف مجموعتين من الأدوات الجراحية (ميكروديسيكتيون المقص والملقط أدسون حامل إبرة) قبل الجراحة. إعداد معقمة 5-0 خيوط الحرير والجاف المعقمات (عند التخطيط للعمليات الجراحية المسلسل).
3. مقطع شعر الصدر الأوسط الفئران باستخدام ماكينة ومارك الفئران لتحديد الهوية باللكم الإذن قبل وقت الجراحة.
4. إعداد جدول الإجراءات، التي يمكن استخدامها فورا للعملية.
   1. انتشار جهاز pad ماصة وإصلاح الزوايا مع الشريط وإصلاح المخروطات التخدير مع الشريط، وضع المعقمات والمطهرات (الكلورهكسيدين واليود الإيثانول 75%) بجوار مساحة التشغيل ووضع الفئران في عملية النظام.

2-إعداد الخلايا (بالنسبة للفئران 10)

ملاحظة: يجب تلقيح الخلايا ضمن ح 1 بعد يجري فصل من الطبق لتجنب بقاء الخلية انخفض. على وجه التحديد، ينبغي أن مختلطة تعليق خلية في خليط البروتين هلامية خلال 15 دقيقة بعد فصل الخلايا من طبق للحفاظ على قدرتها على البقاء.

1. الثقافة الخلايا 4T1-luc2، وخط خلية غدية الثديية ماوس معربا عن لوسيفراس، في وسائل الإعلام RPMI 1640 مع 10% FBS في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية في شركة 5%₂.
2. تغسل الخلايا ملتصقة 4T1-luc2 في صحن 10 سم مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. إضافة 1 مل من 0.25% التربسين استخدام ماصة P1000، وثم احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم قم بإضافة 4 مل وسائط النمو (1640 RPMI مع 10% FBS) استخدام 5 مل مصلية "الماصة؛" ونقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل في غطاء زراعة الأنسجة. الطرد المركزي بتعليق خلية في 180 x ز لمدة 5 دقائق.
3. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني؛ بعد ذلك، عد الخلايا باستخدام في هيموسيتوميتير.
4. تعليق 2 × 10⁶ 4T1-luc2 الخلايا في 40 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة (درجة الحموضة 7.4، 4 درجة مئوية) في هود زراعة الأنسجة.
5. يخلط تعليق خلية 40 ميكروليتر ميكروليتر 360 من خليط البروتين هلامية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على الجليد في هود زراعة الأنسجة.
   ملاحظة: أن تركيز النهائي 1 × 10⁵20 ميكروليتر (PBS 1:9: خليط البروتين هلامية). لنموذج أورثوتوبيك (لا استئصال الثدي)، استخدمت 1 × 10⁴20 ميكروليتر من تركيز النهائي، لتجنب الوصول إلى معايير القتل الرحيم (ورم حجم > 2 سم) خلال أسبوعين.

3-سرطان الخلية تلقيح

1. وضعت الفئران في قاعة تحريض التخدير مع تدفق الأوكسجين isoflurane و 0.2 لتر في الدقيقة 2-4% حتى الفئران التنفس بهدوء (2-3 دقيقة).
2. أمسك الماوس وحقن البوبرينورفين 0.05 مغ/كغ على الكتف تحت الجلد.
3. تأكيد التخدير الكافي بعدم وجود رد فعل لقرصة أخمص القدمين. إدراج الآنف الماوس في الحفرة قناع الماوس، والذي يسمح للتخدير استنشاق مع إيسوفلوراني 2-4% وتدفق الأوكسجين 2 لتر في الدقيقة المرفقة إلى وحدة اسطوانة فحم.
4. تقييد أطرافهم الماوس استخدام الشريط مختبر وتعقيم الجلد باستخدام الإيثانول 75%، باستخدام مسحات القطن الكلورهيكسيدين واليود.
5. جعل شق جلد 5 ملم في منتصف جدار الصدر الأمامي استخدام مقص ميكروديسيكشن العقيمة، رفع الجانب الأيمن الجلد بجوار الشق وفصل الجلد من جدار الصدر باستخدام المقص، وثم، عكس الجلد لفضح الحق #2 لوحة الدهون الثديية.
6. حقن 20 ميكروليتر من تعليق خلية السرطان باستخدام حقنه الأنسولين 1 مل بإبرة ز 28.5 في لوحة الدهون تحت الرؤية المباشرة من خلال الجرح بعناية.
   ملاحظة: الإبرة يمر الجرح، لا الجلد. تبقى عقد الإبرة في لوح الدهون 5 s قبل أن يسحب بها، مما يتيح وقتاً لخليط البروتين هلامية ترسيخ.
7. إغلاق شقوق الجلد بخياطة، استخدام خيوط عقيمة 5-0 غير-قابلة للامتصاص.
8. بعد الجراحة، وإرجاع الحيوانات إلى قفص نظيف ورصد لهم حتى أنهم استعادوا وتتحرك بحرية (بعد ~ 1 – 2 دقيقة). إذا لم يظهر حيوان بصحة جيدة خلال 24 ساعة من عملية جراحية، إدارة البوبرينورفين (0.2 مغ/كغ).
9. إزالة خيوط تحت التخدير (راجع الخطوة 3.1) د 7 بعد الجراحة.

4-استئصال الثدي

ملاحظة: توقيت استئصال الثدي مهم جداً. إذا كان يتم ذلك في وقت مبكر جداً، لم يحدث ورم خبيث في الرئة. إذا كان يتم ذلك في وقت متأخر جداً، غزت الورم الابتدائي الأوعية الدموية الكبرى، التي تجعل من استئصال الأورام كاملة تحديا. وهكذا، تم اختبار نقاط زمنية متعددة لاستئصال الثدي لتحديد النقطة الزمنية التي أنتجت التوازن المناسب في انتظار ورم خبيث قبل بتر أصبحت صعبة جداً. بعد القيام بذلك في ما يزيد على 50 الماوس التجارب، اتضح أن استئصال الثدي في 8 أيام بعد تلقيح خلايا السرطان (أو عندما يصل حجم الورم إلى 5 ملم) كان المثل الأعلى الوقت نقطة تحقيق توازن بين¹³.

1. تخدير ماوس مع إيسوفلوراني 2-4 ٪ استنشاقه وحقن البوبرينورفين (انظر الخطوات 3.1 و 3.2).
2. كبح جماح الماوس وتعقيم الجلد (راجع الخطوة 3، 4).
3. جعل شق جلد مم 5 مم 2 إلى اليسار من الندبة الجراحية التي تم إجراؤها في تلقيح خلايا السرطان الأولى، استخدام مقص ميكروديسيكشن. تمديد الشق نحو الجذر من فوريليمب لإزالة الورم، والجلد بما في ذلك الندبة الجراحية، والآفة على اتصال الورم، فضلا عن حوض إبطي العقدة الليمفاوية فيه معظم الوقت لا تظهر العقدة الليمفاوية موجودة في الوقت ماستيكت omy¹³. تأكد من عدم تلف الوريد الابطي.
4. إغلاق عيوب الجلد بخياطة، استخدام خيوط غير الامتصاص العقيمة 5-0 في شكل "Y".
5. هي نفسها كما في الخطوة 3، 8، العودة الماوس إلى القفص نظيفة ومراقبة حتى أنهم استعادوا.
6. إزالة خيوط تحت التخدير (راجع الخطوة 3.1) 7 أيام بعد الجراحة.

5-طرحه الكمي للورم الرئيسي (التطعيم أورثوتوبيك دون استئصال الثدي) أو ورم خبيث في الرئة (استئصال الثدي نموذج)

ملاحظة: لتحديد مقدار العبء الورم الرئيسي، هو الإضاءة الحيوية قياس 2 × مدة أسبوع اعتبارا من اليوم بعد التطعيم أورثوتوبيك. للرئة ورم خبيث الكمي، هو الإضاءة الحيوية قياس 2 × مدة أسبوع اعتبارا من اليوم التالي استئصال الثدي.

1. حل لوسيفرين د في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) إلى تركيز نهائي 15 ملغ/مل في غطاء زراعة الأنسجة. اليكووت فالي ميكروسينتريفوجي محمية من الضوء 1.5 مل أنابيب. مخزن الحل المخفف في-80 درجة مئوية.
   ملاحظة: ماوس ز 20، مطلوب 200 ميليلتر من لوسيفرين د المخفف.
2. افتح برنامج أخذ الصور، ثم انقر فوق تهيئة.
   ملاحظة: يستغرق حوالي 15 دقيقة لتبرد جهاز اقتران (CCD). عندما يصل اتفاقية مكافحة التصحر إلى درجة الحرارة المحددة، يتغير لون شريط درجة الحرارة من اللون الأحمر إلى الأخضر.
3. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2-4% في غرفة مخصصة التعريفي قبل التصوير (راجع الخطوة 3.1).
4. وزن الفئران.
5. ضخ 150 مغ/كغ لوسيفرين د إينترابيريتونيلي عند نقطة منتصف البطن، باستخدام إبرة ز 28.5.
6. تناسب كل الماوس مع مخروط الآنف داخل نظام التصوير في موقف ضعيف (مكان كحد أقصى خمسة فئران في نفس الوقت). المحافظة على التخدير في إيسوفلوراني 1%-3% (في الأكسجين 100%) عن طريق المخروطات أثناء التصوير.
7. قم بالتقاط صورة كل 5 دقيقة للكشف عن الإضاءة الحيوية الذروة لمدة 50 دقيقة (أو حتى الإضاءة الحيوية ذروة مؤكدة).
   1. حدد التﻷلؤ السيارات، Binning متوسط، و مجال الرؤية د.
   2. انقر فوق الحصول التقاط الصورة.
8. تعود الفئران إلى cage(s) بهم ورصد لهم حتى أنهم استعادوا (راجع الخطوة 3، 8).

6-الرئة ورم خبيث عبء التحديد الكمي بتصوير السابقين فيفو

ملاحظة: الرئة ورم خبيث الكمي قابل للتطبيق لتلقيح أورثوتوبيك سواء مع أو دون استئصال الثدي نماذج. في النموذج، واستئصال الثدي هو اختيار السابقين فيفو التصوير أو بقاء المراقبة، تبعاً للغرض. في نموذج التطعيم (بدون استئصال الثدي) أورثوتوبيك، تنتج معظم الحالات معايير القتل الرحيم حجم الورم الرئيسي (> 2 سم) حوالي 21 يوما بعد التلقيح.

1. التحديد الكمي لآفات الرئة المنتشر بعد تلقيح خلايا السرطان بالسابقين فيفو تصوير 21 يوما.
2. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني 2-4% في غرفة مخصصة التعريفي (راجع الخطوة 3.1).
3. وزن الفئران.
4. ضخ 150 مغ/كغ لوسيفرين د إينترابيريتونيلي (راجع الخطوة 5، 6).
5. Euthanize الفئران بسرطان عنق الرحم التفكك، 15 دقيقة بعد الحقن.
6. فتح البطن بقطع الجلد والصفاق في منتصف البطن، باستخدام منحنى مايو كلينيك المقص. تمديد شق إلى اليمين واليسار على حد سواء. سحب الكبد مع الملقط حتى يتم تصور الحجاب الحاجز؛ وبعد ذلك، قطع الحجاب الحاجز.
7. باستخدام مقص مايو كلينيك المنحنية، قطع الأضلاع ثنائية من كاوداد (الأضلاع 12) إلى سيفالاد (أضلاعه الأولى) كشف الرئتين عن طريق التقليب جدار الصدر الأمامي.
8. تحديد المريء والصدر، الذي يبدو وكأنه سلك توصيل الرئتين للعمود الفقري، وعن طريق رفع الرئتين باستخدام الملقط، وبعد ذلك، قطع المريء باستخدام مقص ميكروديسيكتيون.
9. رفع الثنائية في الرئتين والقلب باستخدام الملقط (تطبيق الجر سحب لأسفل، باتجاه سيفالاد إلى كاوداد)، وثم قطع القصبة الهوائية وسفن كبيرة إلى قمة الرئة في سيفالاد، باستخدام مقص ميكروديسيكشن.
   ملاحظة: وهذا يسمح لعزل الرئة والقلب من الجسم.
10. إزالة القلب من الرئة باستخدام مقص ميكروديسيكشن.
11. وضع الرئتين 10 سم طبق بيتري.
12. التقاط الصورة الإضاءة الحيوية (راجع الخطوات 5.7.1 و 5.7.2) 5 دقائق بعد القتل الرحيم (20 دقيقة بعد حقن لوسيفرين).

النتائج

غرض طراز أورثوتوبيك لمحاكاة تطور السرطان البشري (أي، نمو الورم الرئيسي تليها الانبثاث العقدة الليمفاوية والرئة ثم البعيدة ورم خبيث)¹⁵. بعد تلقيح خلايا السرطان، هو كمياً الإضاءة الحيوية بصورة منتظمة (مرتين إلى ثلاث مرات/الأسبوع) (الشكل 1A)....

Discussion

في العقد الماضي، ونحن إنشاء نماذج سرطان مورين متعددة، بما في ذلك الثدي سرطان نماذج^3،7،،من^1316،،من²⁰²¹. سابقا، أثبتنا أن الثدي سرطان الخلية أورثوتوبيك التطعيم في أنسجة الغدة الثديية ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture