小鼠原位转移性乳腺癌模型的建立及小鼠根治性乳房切除术

摘要

我们介绍了小鼠原位乳腺癌模型和根治性乳房切除术模型与生物发光技术, 以量化肿瘤负担, 以模拟人类乳腺癌的进展。

摘要

在体内小鼠模型, 以评估乳腺癌进展是必不可少的癌症研究, 包括临床前的药物开发。然而, 大多数的实际和技术细节通常被省略在出版的手稿, 因此, 这使得它的挑战, 重现模型, 特别是当它涉及手术技术。生物发光技术允许评估少量的癌细胞, 即使在肿瘤无法感觉到的情况下也是如此。利用荧光素酶表达癌细胞, 我们建立了一个乳腺癌原位接种技术具有较高的肿瘤发生率。肺转移是通过体外技术评估的。然后, 我们建立了一个低局部复发率的乳房切除术模型, 以评估转移性肿瘤负担。本文分别详细介绍了肿瘤发生率高、局部复发率低的乳腺癌原位植入术和乳房切除术的手术技术, 以提高乳腺癌模型的效率。

引言

动物模型在癌症研究中发挥着关键作用。当一个假设在体外得到证实时, 应该在体内进行测试, 以评估其临床相关性。与体外模型相比, 动物模型往往更好地捕获癌症进展和转移, 在动物模型中测试一种新药作为药物开发^的临床前研究 1^{, 2 是}至关重要的。然而, 动物实验的技术细节往往在发表的文章中没有得到很好的描述, 因此很难成功地复制这个模型。事实上, 建立这些原位接种和乳房切除术模型的作者经历了漫长而严格的试验和错误过程。癌细胞接种后肿瘤发生的成功率是决定动物研究成功和效率的关键因素之一.小鼠的细胞系和接种细胞数量、接种部位和菌株都是重要因素。众所周知, 与体外技术相比, 由于个体差异, 动物实验的结果有巨大的差异。因此, 使用具有标准技术的成熟模型对于获得稳定的结果、提高动物实验的效率、避免误导结果具有重要意义。

本文为建立乳腺癌原位切除术和乳房切除术小鼠模型提供了完善的技术。这些方法的目的是: 1) 模仿人类乳腺癌的进展和治疗课程, 2) 进行体内实验, 与其他乳腺癌接种或乳房切除术技术相比, 效率更高, 成功率更高。在原位癌细胞接种中, 为了模仿人类乳腺癌的进展, 我们选择 #2 乳腺脂肪垫作为接种部位, 位于胸部。在大多数研究中, 乳腺癌细胞是皮下注射 5.这种技术不需要手术, 因此, 它是简单和直接的。然而, 皮下微环境与乳腺微环境有很大的不同, 导致不同的癌症进展, 甚至分子谱^6,7。一些研究使用位于腹部的乳腺 #4 作为接种部位⁶。然而, 由于 #4 乳腺位于腹部, 最常见的转移模式是腹膜癌^{病 7}, 它发生与少于10% 的转移性乳腺癌⁸。乳腺癌所产生的技术, 在 #2 乳腺, 转移到肺, 这是最常见的乳腺癌转移部位^之一9。

与其他乳腺癌接种技术相比, 与其他乳腺癌接种技术相比, 该技术的目标也是实现更高的肿瘤发生率, 肿瘤大小变异性最小。为此, 在胶质蛋白质混合物中悬浮的癌细胞通过胸壁前半切口在直视下接种。与皮下或非手术注射相比, 这种技术产生了较高的肿瘤发生率, 肿瘤大小和形状的变异性较小, 如先前报道^{的 3,7}。

我们还介绍了一种小鼠根治性乳房切除术技术, 其中原位乳腺肿瘤切除与周围的组织和腋窝淋巴结。在临床环境中, 无远处转移疾病乳腺癌患者的护理标准是乳房切除术 10^,11。在乳房切除术前, 通过影像学和前哨淋巴结活检测量腋窝淋巴结转移。如果没有腋窝淋巴结转移的证据, 病人则接受全或部分乳房切除术, 其中省略腋窝淋巴结切除术。全乳房切除术是一种将乳腺癌切除为整体的技术, 而部分乳房切除术则是以周围正常乳房组织的边缘切除乳腺癌, 从而保存乳房内剩余的正常乳房组织。病人。然而, 在乳房部分切除术后保持剩余正常乳房组织的患者需要术后放疗^,以避免局部复发10。腋窝淋巴结转移的患者进行根治性乳房切除术, 切除乳腺癌, 所有正常的乳房组织和腋窝淋巴结, 并侵入组织^{共 10,11}。在小鼠模型中, 对腋窝淋巴结转移和/或术后辐射的监测是不合理或不可行的。因此, 我们利用根治性乳房切除术技术, 以避免局部或腋窝淋巴结转移。

肿瘤细胞通过尾静脉接种是最常见的肺转移小鼠型 12, 即所谓的 "实验转移"。此模型易于生成, 不需要手术;然而, 它不模仿人类乳腺癌的进展, 这可能会导致不同的转移性疾病行为。为了模仿乳房切除术后经常发生转移的人类乳腺癌治疗过程, 在原位癌细胞接种后切除原发肿瘤。与先前报道的¹³例单纯肿瘤切除相比, 这种技术产生的局部复发较少, 对新的治疗、临床前研究和转移性乳腺癌研究非常有用。这里描述的技术适用于大多数乳腺癌原位模型实验。然而, 重要的是要考虑到, 胶状蛋白混合物可以影响微环境和手术可以影响压力免疫反应 14.因此, 研究微环境和压力/免疫反应的研究人员应意识到潜在的混淆因素。

研究方案

所有实验均获得罗斯威尔公园综合癌症中心机构动物护理和使用委员会的批准。

请注意:获得了9到12周的雌性 balb1 小鼠。4t1-幸运2细胞, 一种小鼠乳腺腺癌细胞系, 来自自 balbse 小鼠, 已被设计为表达荧光素酶, 被使用。这些细胞在罗斯威尔公园纪念研究所 (rpmi) 1640 培养基中培养, 培养基中含有10% 的胎儿牛血清 (fbs)。

1. 仪器的制备

1. 在组织培养罩中的冰上解冻冷冻凝胶状蛋白质混合物 (如 matrigel)。
2. 手术前清洁和高压灭菌两套手术器械 (显微解剖剪刀、adson 钳子和针架)。准备消毒的5-0 真丝缝线和干燥的消毒剂 (计划进行连续手术时)。
3. 用剪子夹住老鼠的中间胸毛, 并在手术前对耳朵拳打脚踢, 对老鼠进行鉴定。
4. 准备过程表, 该过程表可立即用于操作。
   1. 铺上吸水垫, 用胶带固定眼角, 用胶带固定麻醉鼻锥, 在操作空间旁边放置消毒剂和消毒剂 (氯己定、碘和75% 乙醇), 并将小鼠按操作顺序放置。

2. 细胞的制备 (10 小鼠)

请注意:细胞应接种1小时后, 脱离菜品, 以避免降低细胞活力。具体而言, 细胞悬浮液应在15分钟内混合到胶状蛋白质混合物中, 将细胞从盘子中分离出来, 以保持其活力。

1. 在 rpmi 1640 培养基中培养 4t1-幸运2细胞, 在 5% co 2 的37°c 加湿孵化器中, 在10% 的 fbs 中表达荧光素酶.
2. 用10毫升血清学移液器用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗10厘米的10厘米的盘子中的粘附 4t1-luc2 细胞。使用 p1000 移液器加入1毫升0.25% 胰蛋白酶, 然后在37°c 孵育样品5分钟。然后, 使用5毫升血清学移液器添加4毫升生长介质 (rpmi-1640, 含 10% fbs), 并将细胞悬浮液转移到组织培养罩中的15-ml 锥形管中。以 180 x g 离心细胞悬浮液 5分钟 。
3. 在 pbs 2 毫升中吸收上清液并重新悬浮细胞;然后, 使用血细胞仪计算细胞数数。
4. 将 2 x 10 6 4t1-luc2^细胞悬浮在组织培养罩中40μl 的冷 pbs (ph 7.4, 4°c) 中。
5. 将40μl 细胞悬浮液与凝胶蛋白混合物的360μl 混合在组织培养罩冰上的 1.5 ml 微离心管中。
   请注意:最终浓度为 1 x 10 5/20μl (1:9 pbs:胶状蛋白质混合物).对于原位模型 (无乳房切除术), 使用了 1 x 10 4/20μl^的最终浓度, 以避免达到安乐死标准 (肿瘤大小 & gt; 2 厘米) 在两周内。

3. 癌细胞接种

1. 将小鼠放入麻醉诱导室, 用2-4 异氟烷和 0.2 lmmin 氧气流动, 直到小鼠平静呼吸 (2-4)。
2. 抓住小鼠, 皮下将 0.05 mg/kg 丁丙诺非注射到其肩部。
3. 通过对脚趾捏缺乏反应来确认充分的麻醉。将鼠标的鼻子插入小鼠面罩的孔, 从而可以吸入麻醉2-4 异氟醚和 2 l/min 氧气流动连接到木炭罐单元。
4. 使用实验室胶带约束老鼠的四肢, 用氯己定、碘和75% 乙醇对皮肤进行消毒, 用棉签对其进行消毒。
5. 用无菌显微解剖剪刀在胸前壁中间做一个5毫米的皮肤切口, 提起切口旁边的右侧皮肤, 用剪刀将皮肤从胸壁上拆开, 然后将皮肤倒置, 露出右 #2乳房脂肪垫。
6. 用1毫升的胰岛素注射器将20μl 的癌细胞悬浮液用 28.5 g 针注射到直接视觉下的脂肪垫中。
   请注意:针头穿过伤口, 而不是皮肤。在取出针头之前, 请将针头保持在脂肪垫中 5秒, 这样凝胶状蛋白质混合物就可以固化。
7. 用5-0 不吸收的缝线缝合皮肤切口。
8. 手术后, 将动物送回干净的笼子, 并对其进行监测, 直到它们恢复并自由移动 (约1-2分钟后)。如果动物在手术后24小时内似乎身体不好, 则应服用丁丙诺非 (0.2 mg/2 kg)。
9. 手术后 7 d 在麻醉下取下缝合线 (见步骤 3.1) 7 d。

4. 乳房切除术

请注意:乳房切除术的时间是非常重要的。如果做得太早, 就不会发生肺转移。如果做得太晚, 原发肿瘤已经侵入了主要血管, 这使得完整的肿瘤切除具有挑战性。因此, 对乳房切除术的多个时间点进行了测试, 以确定在切除前等待转移时, 哪个时间点产生了适当的平衡。在50多个小鼠实验中, 结果表明, 在癌细胞接种后 8天 (或当肿瘤大小达到5毫米) 乳房切除术是实现这一平衡13的理想时间点.

1. 用2-4 吸入异氟烷并注射丁丙诺非的小鼠 (见步骤3.1 和 3.2)。
2. 约束鼠标并对其皮肤进行消毒 (参见步骤 3.4)。
3. 用显微解剖剪刀, 在最初的癌细胞接种时留下的手术疤痕左侧做一个5毫米的皮肤切口2毫米。将切口伸向前肢根部, 以切除肿瘤、包括手术疤痕在内的皮肤、与肿瘤接触的病变, 以及大部分时间在乳房时没有明显淋巴结的腋窝淋巴结盆地体¹³。确保不要损坏腋窝静脉。
4. 缝合皮肤缺陷, 使用无菌5-0 不可吸收的缝合形状的 "y"。
5. 与步骤3.8 中的一样, 将鼠标返回到干净的笼子和监视器, 直到它们恢复。
6. 手术后 7天, 在麻醉下取出缝合线 (参见步骤 3.1)。

5. 原发肿瘤 (无乳房切除术的原位静脉接种) 或肺转移 (乳房切除术模型) 的生物发光定量

请注意:对于原发肿瘤负担的定量, 生物发光从原位接种后的第二天开始每周测量2倍。对于肺转移定量, 从乳房切除术后的第二天开始, 每周测量2倍的生物发光。

1. 在 dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dpbs) 中溶解 d-荧光素, 最终浓度为 15 mg/ml, 在组织培养罩中。将其注入光屏蔽 1.5 ml 微离心管中。将稀释后的溶液存放在-80°c。
   请注意:对于20克小鼠, 需要200μl 的稀释 d-荧光素。
2. 打开映像软件, 然后单击 "初始化"。
   请注意:冷却电荷耦合器件 (ccd) 大约需要15分钟。当 ccd 达到设定温度时,温度条的颜色从红色变为绿色。
3. 在成像之前, 将2-4 异氟醚对小鼠进行成像, 并在专用的诱导室中进行处理 (见步骤 3.1)。
4. 称重老鼠。
5. 使用 28.5 g 针, 在腹中的腹腔内注射 150 mg/kg d-荧光素。
6. 将每个鼠标与成像系统内的鼻锥安装在仰角位置 (同时最多放置5只小鼠)。在成像过程中, 通过鼻锥保持麻醉在 1%-3% 异氟醚 (100% 氧气)。
7. 每5分钟拍摄一次图像, 以检测峰值生物发光 50分钟 (或直至确认的峰值生物发光)。
   1. 选择"发光" "为"自动 "、" 作为"中"、 "视场" ("视场") "为d"。
   2. 单击 "获取"以捕获图像。
8. 将老鼠送回笼子里, 并对它们进行监测, 直到它们恢复 (见步骤 3.8)。

6. 肺转移瘤负担的前体成像定量

请注意:肺转移定量适用于有乳房切除术和无乳房切除术模型的原位接种。在乳房切除术模型中, 根据目的选择体外成像或存活观察。在原位接种 (无乳房切除术) 模型中, 大多数病例在接种后约21天产生原发肿瘤大小的安乐死标准 (& gt; 2 厘米)。

1. 通过体外成像在癌细胞接种21天后定量肺转移性病变。
2. 将2-4 异氟醚的小鼠在专用的诱导室中进行麻醉 (见步骤 3.1)。
3. 称重老鼠。
4. 腹腔内注入 150 mg/kg d-荧光素 (见步骤 5.6)。
5. 注射15分钟后, 用颈椎脱位对小鼠进行安乐死。
6. 用弯曲的梅奥剪刀切开腹部中部的皮肤和腹膜, 打开腹部。将切口向左和向左延伸。用钳子拉出肝脏, 直到横隔膜被可视化;然后, 切断隔膜。
7. 使用弯曲的梅奥剪刀, 削减双侧肋骨从 caudad (第12肋骨) 头 (第一肋骨) 通过翻转胸前壁暴露肺部。
8. 识别胸腔食道, 它看起来像一根连接肺部和脊柱的绳子, 通过抬起肺部使用钳子, 然后, 用微解剖剪刀切割食道。
9. 使用钳子 (使用牵引拉向下, 在头的方向到 caudad) 抬起双侧肺和心脏, 然后, 用显微解剖剪刀将气管和主要血管切割到头部的肺先端。
   请注意:这就可以将肺和心脏与身体隔离。
10. 用显微解剖剪刀将心脏从肺部取出。
11. 把肺放在10厘米的培养皿里。
12. 在安乐死后 5分钟 (注射荧光素后 20分钟), 捕捉生物发光图像 (参见步骤5.7.1 和 5.7.2)。

结果

原位模型的目的是模仿人类癌症的进展 (即, 原发肿瘤的生长, 其次是淋巴结转移, 然后是远处的肺转移)¹⁵。癌细胞接种后, 定期量化生物发光 (2 至 3个星期) (图 1a)。肺部的生物发光比原发性病原发病变更深、更小。生物发光主要反映活小鼠³的原发肿瘤负担 (图 1b和1B)。肿瘤...

讨论

在过去的十年里, 我们已经建立了多种小鼠癌症模型, 包括乳腺癌模型^{3、7、13、}16^、20^、21.此前 , 我们证明 , 乳腺癌细胞在直视下对乳腺组织进行原位接种 , 产生的肿瘤比在周围注射细胞时没有手术切口 7 的肿瘤体积变化较小 ..通过...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture