Génération d’un modèle de Cancer du sein métastatique orthotopique murin et effectuant une mastectomie radicale Murine

Résumé

Nous introduisons un modèle de cancer du sein orthotopique murin et modèle de mastectomie radicale avec la technologie de la bioluminescence pour quantifier le fardeau tumoral pour imiter la progression du cancer du sein humain.

Résumé

Modèles de souris in vivo pour évaluer la progression du cancer du sein sont essentiels pour la recherche sur le cancer, y compris les développements précliniques de médicaments. Cependant, la majorité des détails techniques et pratiques est généralement omise dans les manuscrits publiés qui, par conséquent, fait qu’il est difficile de reproduire les modèles, en particulier lorsqu’il s’agit de techniques chirurgicales. Bioluminescence technologie permet l’évaluation de petites quantités de cellules cancéreuses même lorsqu’une tumeur n’est pas palpable. Utilisant les cellules cancéreuses exprimant luciférase, nous établissons une technique d’inoculation d’orthotopique du sein cancer avec un taux élevé de tumorigenèse. Métastases pulmonaires est évaluée en utilisant une technique ex vivo . Nous, ensuite, établir un modèle de mastectomie avec un taux faible de récidive locale pour évaluer la charge de tumeur métastatique. Dans les présentes, nous décrire en détail, les techniques chirurgicales d’implantation orthotopique et mastectomie pour cancer du sein avec un taux élevé de tumorigenèse et les taux de récidive locale faible, respectivement, pour améliorer l’efficacité de modèle pour le cancer du sein.

Introduction

Modèles animaux jouent un rôle clé dans la recherche sur le cancer. Quand une hypothèse est démontrée in vitro, il devrait être testé in vivo pour évaluer sa pertinence clinique. La progression du Cancer et des métastases sont souvent mieux captés par des modèles animaux par rapport à des modèles in vitro, et il est essentiel de tester un nouveau médicament chez un modèle animal d’une étude préclinique pour drug development^1,2. Toutefois, les détails techniques de l’expérimentation animale ne sont souvent pas bien décrites dans les articles publiés, rendant difficile à reproduire le modèle avec succès. En effet, les auteurs qui ont établi ces modèles orthotopiques de l’inoculation et la mastectomie a traversé un processus long et rigoureux de tâtonnements. Le taux de réussite de tumorigénèse après que inoculation de cellules de cancer est un des facteurs clés pour déterminer le succès et l’efficacité d’un animal étude³. La lignée cellulaire et le nombre de cellules à ensemencer, le site de l’inoculation et la souche des souris sont tous des facteurs importants. Il est bien connu qu’il y a des énormes variations dans les résultats de l’expérimentation animale en raison des différences individuelles, par rapport aux techniques in vitro. À l’aide d’un modèle bien établi avec une technique standard est donc important d’obtenir des résultats constants, pour améliorer l’efficacité de l’expérimentation animale et d’éviter des résultats trompeurs.

Cet article fournit des techniques bien établies⁴ pour générer des modèles du cancer du sein orthotopique et la mastectomie de souris. Les objectifs de ces méthodes sont 1) pour imiter la progression du cancer du sein humain et cours de traitement et 2) pour mener des expériences in vivo avec une plus grande efficacité et les taux de réussite plus élevés par rapport aux autre inoculation de cancer du sein ou des techniques de mastectomie. Dans inoculation de cellules du cancer orthotopique pour imiter la progression du cancer du sein humain, nous choisissons les coussinets adipeux mammaire #2 comme un site d’inoculation, qui se trouve dans la poitrine. Dans la plupart des études, les cellules cancéreuses du sein sont inoculées par voie sous-cutanée⁵. Cette technique ne nécessite pas de chirurgie et, par conséquent, il est simple et directe. Toutefois, le microenvironnement sous-cutanée est très différent du microenvironnement de la glande mammaire, qui se traduit par la progression du cancer différentes et des profils moléculaires même^6,7. Certaines études utilisent la glande mammaire #4, qui se trouve dans l’abdomen, comme un lieu d’inoculation⁶. Toutefois, puisque les glandes mammaires #4 sont localisés dans l’abdomen, le patron le plus souvent métastatique est carcinose péritonéale⁷, qui se produit avec moins de 10 % de cancer du sein métastatique du cancer⁸. Générée par la technique présentée ici, dans la glande mammaire #2, le cancer du sein métastase dans le poumon, qui est l’un des plus courants sites métastatiques du sein cancer⁹.

Avec cette technique, le but est aussi de parvenir à un taux plus élevé de la tumorigenèse avec variabilité de taille de tumeur minime par rapport à d’autres techniques d’inoculation du cancer du sein. Pour ce faire, les cellules cancéreuses en suspension dans un mélange de protéines gélatineux sont inoculés sous vision directe par une incision de paroi thoracique antérieur médian. Cette technique produit un taux élevé de tumorigenèse avec moins de variabilité dans la taille de la tumeur et de la forme par rapport à l’injection sous-cutanée ou non chirurgicales, comme indiqué précédemment^3,7.

Nous introduisons également une technique de mastectomie radicale de souris dans lequel la tumeur du sein orthotopique est réséquée avec les tissus environnants et les ganglions lymphatiques axillaires. Dans le contexte clinique, la norme de soins pour les patients atteints de cancer du sein sans maladie de métastases à distance est une mastectomie^10,11. Avant la mammectomie, métastases ganglionnaires axillaires est recensée par imagerie et sentinelle biopsie ganglionnaire. S’il n’y a aucun signe de métastases aux ganglions axillaires, le patient est ensuite traité avec une mastectomie totale ou partielle, dans laquelle la résection des ganglions axillaires est omise. Mastectomie totale est une technique de résection du cancer avec le tissu mammaire tout en bloc, tandis que Mastectomie partielle est à la résection du cancer avec une marge d’entourant le tissu mammaire normal seulement, conservant ainsi le tissu mammaire normal restant dans le patient. Cependant, les patients qui préservent le tissu mammaire normal qui reste après une mastectomie partielle doivent radiothérapie postopératoire pour éviter une récidive locale¹⁰. Les patients ayant des métastases ganglionnaires axillaires procéder à une mastectomie radicale qui supprime le cancer du sein avec la normale tous les ganglions axillaires et de tissus des seins et envahirent les tissus en bloc^10,11. Chez la souris, la surveillance des radiations de métastases et/ou post-opératoire des ganglions axillaires n’est pas raisonnable ni réalisable. Ainsi, nous utilisons la technique de la mastectomie radicale pour éviter les métastases ganglionnaires axillaires ou local.

Inoculation de cellules de cancer par l’intermédiaire de la veine caudale est le plus commun poumon métastase souris modèle¹², la soi-disant « métastases expérimentale ». Ce modèle est facile à produire et ne nécessite pas de chirurgie ; Cependant, il n’imite pas la progression du cancer du sein humain qui peut entraîner un comportement différent de la maladie métastatique. Pour imiter la cure de cancer du sein humain où les métastases se produit souvent après une mastectomie, la tumeur primitive est retirée après l’inoculation de cellules orthotopique du cancer. Cette technique produit moins récidive locale par rapport à la résection de tumeur simple, comme indiqué précédemment¹³et est utile pour les nouvelles thérapeutiques, des études précliniques et pour les études de recherche pour le cancer du sein métastatique. Les techniques décrites ici sont appliquent pour la plupart breast cancer orthotopique modèle expériences. Toutefois, il est important de considérer que le mélange gélatineux de protéine peut affecter le microenvironnement et chirurgie peut influer sur la réponse de stress/immunitaire¹⁴. Donc, les enquêteurs étudient le microenvironnement et/ou le stress/système immunitaire devraient être conscients du risque, facteurs de confusion.

Protocole

L’approbation de la Roswell Park Cancer Center Institutional Animal prise en charge globale et utilisation a été obtenue pour toutes les expériences.

Remarque : Neuf à douze semaines femelles BALB/c souris sont obtenus. Les cellules 4 t 1-luc2, une souris Adénocarcinome mammaire lignée cellulaire provenant de souris BALB/c qui a été conçu à la luciférase express, sont utilisés. Ces cellules sont cultivées dans un milieu 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % sérum fœtal (SVF).

1. préparation des Instruments

1. Décongeler un mélange de protéine gélatineux congelés (p. ex., Matrigel) sur la glace dans une hotte de culture de tissus.
2. Nettoyer et stériliser deux ensembles d’instruments chirurgicaux (microdissection ciseaux, pince Adson et un porte-aiguille) avant la chirurgie. Préparer stérilisé 5-0 des sutures en soie et sèche stérilisant (séries chirurgies sont prévues).
3. Couper les cheveux de poitrine moyen des souris avec la pince et marquer les souris pour identification par poinçonnage de l’oreille avant l’heure de la chirurgie.
4. Préparer la table de la procédure, qui peut être utilisée immédiatement pour l’opération.
   1. Répandre un tampon absorbant et fixer les coins avec du ruban, fixer les coiffes anesthésie avec du ruban, mettre stérilisant et désinfectant (chlorhexidine, iode et 75 % d’éthanol) à côté de l’espace de manoeuvre et placez les souris dans l’ordre d’opération.

2. préparation des cellules (pour 10 souris)

Remarque : Les cellules doivent être utilisés moins de 1 h après détaché de la capsule afin d’éviter une diminution de la viabilité. Plus précisément, la suspension cellulaire doit être jetée dans le mélange de protéines gélatineux dans 15 min après avoir détaché les cellules du plat pour maintenir leur viabilité.

1. La culture des cellules 4 t 1-luc2, une lignée de cellules d’Adénocarcinome mammaire de souris exprimant la luciférase, en milieu RPMI 1640 avec 10 % FBS dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO₂à humidifié.
2. Laver les cellules 4 t 1-luc2 adhérente dans un plat de 10 cm avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine à l’aide d’une pipette P1000 et, ensuite, incuber les échantillons à 37 ° C pendant 5 min. Puis, ajouter 4 mL de milieux de culture (RPMI-1640 avec 10 % FBS) à l’aide de 5 mL sérologique Pipeter et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL sous une hotte de culture de tissus. Centrifuger la suspension cellulaire à 180 x g pendant 5 min.
3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 mL de PBS ; Ensuite, compter les cellules à l’aide de l’hémocytomètre.
4. Suspension 2 x 10⁶ cellules 4 t 1-luc2 40 μl de PBS froid (pH 7,4, 4 ° C) dans la hotte de la culture de tissus.
5. Mélanger la suspension cellulaire 40 μL avec 360 μl du mélange protéique gélatineux dans un tube de microtubes de 1,5 mL sur la glace dans la hotte de la culture de tissus.
   Remarque : La concentration finale est de 1 x 10⁵20 μL (1:9 PBS : mélange de protéines gélatineux). Pour le modèle orthotopique (sans mastectomie), 1 x 10⁴20 μL de la concentration finale a été utilisé, pour éviter d’atteindre les critères de l’euthanasie (tumeur taille > 2 cm) dans les deux semaines.

3. Inoculation de cellules de Cancer

1. Mettre les souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie avec 2 à 4 % isoflurane et 0,2 L/min débit d’oxygène jusqu'à ce que les souris respirent calmement (2 – 3 min).
2. Saisissez la souris et injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine dans son épaule par voie sous-cutanée.
3. Confirmez anesthésie adéquate en l’absence de réaction à une pincée d’orteil. Insérez les nez de la souris dans l’orifice du masque souris, qui permet une anesthésie par inhalation avec 2-4 % isoflurane et 2 L/min débit d’oxygène attaché à une unité de filtre à charbon actif.
4. Empêcher les membres de la souris à l’aide de ruban adhésif lab et stériliser sa peau à l’aide de chlorhexidine, iode et 75 % d’éthanol, à l’aide de tampons de coton.
5. Faire une incision cutanée de 5 mm au milieu de la paroi thoracique antérieure utilisant des ciseaux stériles microdissection, ascenseur droite à côté de l’incision de la peau et détacher la peau de la paroi thoracique à l’aide des ciseaux et ensuite, inverser la peau afin d’exposer le droit #2 coussinets adipeux mammaire.
6. Soigneusement injecter 20 μL de la suspension de cellules de cancer à l’aide d’une seringue à insuline 1 mL avec une aiguille de 28,5 G dans les coussinets adipeux sous vision directe par le biais de la plaie.
   Remarque : L’aiguille traverse la plaie, pas la peau. Gardez maintenant l’aiguille dans la grosse garniture pour 5 avant de s à tirant, qui permet à temps pour le mélange de protéines gélatineux se solidifier.
7. Fermer les incisions cutanées par une couture, à l’aide de sutures non résorbables stériles 5-0.
8. Après la chirurgie, retourner les animaux à une cage propre et de les surveiller jusqu'à ce qu’ils ont récupéré et sont déplacent librement (après environ 1-2 min). Si un animal ne semble pas être en bonne santé dans les 24h de la chirurgie, administrer la buprénorphine (0,2 mg/kg).
9. Enlever les sutures sous anesthésie (voir étape 3.1) 7D après la chirurgie.

4. mastectomie

Remarque : Le calendrier de la mastectomie est très important. Si c’est fait trop tôt, les métastases pulmonaires ne se produit pas. Si elle est faite trop tard, la tumeur primitive a envahi des principaux vaisseaux sanguins, rendant difficile une résection oncologique complète. Ainsi, plusieurs points dans le temps ont été testés pour la mastectomie déterminer quel point de temps produit un juste équilibre dans l’attente de métastases avant résection ne devienne trop difficile. Après cela dans plus de 50 expériences de souris, il a été démontré que la mastectomie à 8 jours après l’inoculation de cellules de cancer (ou lorsque la taille de la tumeur atteint 5 mm) était l’idéal temps point pour atteindre qui équilibrent le¹³.

1. Anesthésier une souris avec 2 à 4 % par inhalation isoflurane et injecter la buprénorphine (voir étapes 3.1 et 3.2).
2. Bloquer la souris et stériliser sa peau (Voir l’étape 3.4).
3. Faire une incision cutanée de 5 mm 2 mm à gauche de la cicatrice chirurgicale qui a été faite à l’inoculation de cellules du cancer initial, en utilisant les ciseaux de microdissection. Prolonger l’incision vers la racine de la patte avant pour enlever la tumeur, la peau dont la cicatrice chirurgicale et la lésion au contact de la tumeur, ainsi que le bassin de ganglions axillaires dans laquelle la plupart du temps qu'aucun ganglion visible n’existe au moment de la mastect Omy¹³. Veillez à ne pas endommager la veine axillaire.
4. Fermer les défauts de l’épiderme par une couture, à l’aide de sutures non résorbables stériles 5-0 dans la forme d’un « Y ».
5. Les mêmes qu’à l’étape 3.8, retourner la souris à une cage propre et moniteur jusqu'à ce qu’ils ont récupéré.
6. Enlever les sutures sous anesthésie (voir étape 3.1) 7 jours après la chirurgie.

5. bioluminescente Quantification de la tumeur primitive (orthotopique Inoculation sans mastectomie) ou métastases pulmonaires (modèle de mastectomie)

Remarque : Pour la quantification de la tumeur primaire de fardeau, la bioluminescence est mesurée 2 x par semaine à compter du jour suivant l’inoculation orthotopique. Pour la quantification de métastases pulmonaires, la bioluminescence est mesurée 2 x par semaine à compter du lendemain de la mastectomie.

1. D-luciférine dissoudre tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) à une concentration finale de 15 mg/mL dans une hotte de culture de tissus. Aliquote dans microcentrifugeuse blindé léger 1,5 mL tubes. Stocker la solution diluée à-80 ° C.
   Remarque : Pour une souris de 20 g, 200 µL de D-luciférine dilué est requise.
2. Ouvrez le logiciel d’imagerie, puis cliquez sur initialiser.
   Remarque : Il faut environ 15 min pour refroidir le dispositif couplage de charge (CCD). Lorsque le CCD atteint la température réglée, la couleur de la barre de température passe du rouge au vert.
3. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2 à 4 % dans une chambre à induction dédié avant l’imagerie (voir étape 3.1).
4. Peser les souris.
5. Injection D-luciférine de 150 mg/kg par voie intrapéritonéale au point le milieu de l’abdomen, à l’aide d’une aiguille de 28,5 G.
6. Placer chaque souris avec un cône de nez à l’intérieur du système d’imagerie en décubitus dorsal (lieu un maximum de cinq souris en même temps). Maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 1 % - 3 % (à 100 % d’oxygène) par le biais de la coiffe en imagerie.
7. Capturer une image toutes les 5 min pour détecter la bioluminescence de crête pendant 50 min (ou jusqu'à la bioluminescence pic confirmés).
   1. Sélectionnez Luminescence Auto, Binning comme médiumet champ de vision comme D.
   2. Cliquez sur acquérir pour capturer l’image.
8. Retourner les souris à leurs cages et analysez-les jusqu'à ce qu’ils ont récupérés (voir étape 3,8).

6. poumon métastase tumorale fardeau Quantification par imagerie Ex Vivo

Remarque : Quantification de métastases pulmonaires est applicable pour l’orthotopic inoculation avec et sans des modèles de mastectomie. Dans le modèle de la mastectomie, ex vivo imagerie ou la survie observation est choisie, selon le but. Dans le modèle de l’inoculation (sans mastectomie) orthotopique, la plupart des cas produisent des critères d’euthanasie taille tumeur primitive (> 2 cm) environ 21 jours après l’inoculation.

1. Quantifier des lésions métastatiques 21 jours après l’inoculation de cellules de cancer par imagerie ex vivo.
2. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2 à 4 % dans une chambre à induction dédié (voir étape 3.1).
3. Peser les souris.
4. Injecter par voie intrapéritonéale de 150 mg/kg D-luciférine (voir point 5.6).
5. Euthanasier les souris par dislocation cervicale, 15 min après les injections.
6. Ouvrir l’abdomen en coupant la peau et le péritoine dans le milieu de l’abdomen, à l’aide des ciseaux de Mayo courbés. Prolonger l’incision à droite et à gauche. Sortez le foie avec une pince jusqu'à ce que le diaphragme est visualisé ; Ensuite, couper la membrane.
7. En utilisant les ciseaux Mayo courbés, couper les côtes bilatéraux de caudale (12 côtes) à céphalique (1ère côtes) pour exposer les poumons par retournement de la paroi du thorax antérieur.
8. Identifier le œsophage thoracique, qui ressemble à une corde reliant les poumons à la colonne vertébrale, en soulevant les poumons à l’aide de pinces et, ensuite, couper le œsophage à l’aide des ciseaux de microdissection.
9. Soulevez le bilatérales poumons et le coeur avec une pincette (tirant tirant vers le bas, en direction de céphalique à caudale) et, ensuite, couper la trachée et les gros bateaux à l’apex du poumon à la céphalique, à l’aide de ciseaux de microdissection.
   Remarque : Cela permet d’isoler les poumons et le cœur du corps.
10. Retirer le cœur des poumons à l’aide de ciseaux de microdissection.
11. Mettre les poumons dans une boîte de Pétri de 10 cm.
12. Capturer l’image de la bioluminescence (voir étapes 5.7.1 et 5.7.2) 5 min après l’euthanasie (20 min après l’injection de la luciférine).

Résultats

Le but du modèle orthotopique consiste à mimer la progression du cancer chez l’humain (c'est-à-dire, la croissance de la tumeur primitive, suivie de métastases ganglionnaires et métastases pulmonaires puis lointain)¹⁵. Après l’inoculation de cellules de cancer, la bioluminescence est quantifiée régulièrement (deux à trois fois / semaine) (Figure 1 a). La bioluminescence dans les poumons est plus profond et plus p...

Discussion

Pour la dernière décennie, nous avons mis en place plusieurs modèles de cancer murine, y compris du sein cancer modèles^{3,7,13,16,20,21}. Auparavant, nous avons démontré que breast cancer cell orthotopique l’inoculation dans le tissu de la glande mammaire sous vision directe produit une tumeur plus grande avec moins de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture