マウス実験転移性乳癌癌モデルを生成、およびマウス乳癌根治術を実行

要約

マウス実験乳房癌モデルと人間の胸の癌の進行を模倣する腫瘍負荷を定量化する発光技術と根治的乳房切除モデルを紹介しています。

要約

乳房癌の進行を評価するために生体内でのマウス ・ モデルは、がん研究、前臨床試験の医薬品開発を含むに不可欠です。ただし、実用的な技術的な詳細の大半は、したがって、それは手術の技術を含む場合は特に、モデルの再現を困難には、公開された原稿でよく省略されます。発光技術は、腫瘍が触知できない場合でも少量のがん細胞の評価のためことができます。ルシフェラーゼ発現がん細胞を利用して、率が高い腫瘍乳房癌同所性同種接種技術を確立します。肺転移は、 ex vivo法を用いた評価されます。我々 は、転移性腫瘍の負担を評価するために低局所再発率と乳房切除術モデルを確立します。ここで、我々 について詳しく説明、同所性同種移植と高い発癌率と低い再発率、乳がんの乳房切除術の手術手技, 乳房癌モデルの効率を改善します。

概要

動物モデルは、がん研究の重要な役割を再生します。仮説は生体外で実績のあると、その臨床的意義を評価する生体内でテストしてください。がんの進展と転移は良くとしての in vitro モデルと比較すると動物モデルによってキャプチャされ、薬物開発^1,2のための前臨床研究として動物モデルで新しい薬をテストが不可欠です。しかし、動物実験の技術的な詳細は公開されている記事で、モデルが正常に再生するために挑戦に記述されて頻繁にしません。確かに、これらの同所性同種の接種と乳房のモデルを確立した著者は、試行錯誤の長いと厳格なプロセスを行った。腫瘍癌細胞接種は、成功を決定する重要な要因の 1 つと動物の効率化後の成功率は、³を研究します。細胞株と細胞接種、接種サイト、およびマウスの系統数は、すべての重要な要因です。In vitro における技術と比較して、個体差により動物実験の結果にはばらつきがあることが知られています。したがって、標準的な技術確立モデルを用いた動物実験の効率を改善するために、誤解を招く結果を避けるために、安定した結果を得ることが重要です。

このペーパーは、よく確立された技術⁴乳房癌同所性同種と乳房切除マウス モデルを生成するを提供します。これらのメソッドの目的は、1) 人間の胸の癌の進行や治療コースを模倣し、2) 効率性と他の乳がんがん接種または乳房切除術の技術と比較して高い成功率と生体内の実験を実施します。同所性同種癌細胞接種、人間の胸の癌の進行を模倣するように我々 は選択 #2 乳腺の脂肪パッド胸に位置する接種サイトとして。研究のほとんどは、乳癌細胞は皮下接種した⁵。この手法は手術を必要としません、したがって、それはシンプルで簡単です。ただし、皮下微小環境は乳腺の微小環境は、異なる癌の進行とも分子プロファイル^6,7で結果は大違い。いくつかの研究は、接種サイト⁶として腹部に位置する #4 乳腺を使用します。ただし、#4 乳腺、腹部に位置し、最も一般的な転移パターンは癌性腹膜炎⁷、転移性乳癌癌⁸の 10% 未満で発生します。#2 乳腺の紹介技術によって生成された乳がんは⁹最も一般的な乳房癌の転移巣の 1 つである肺に転移します。

この技術の目的はまた最小限腫瘍サイズ可変他乳房がん接種技術と比較して高い発癌率を達成するために。これを行うには、ゼラチン状の蛋白質の混合物中に浮遊がん細胞は前胸部の中央壁切開直視下再接種します。この手法は、腫瘍サイズと以前に報告された^3,7として、皮下または非外科的注入と比較して形状により少ない可変性と高い発癌率を生成します。

同所性同種乳腺腫瘍を周囲の組織と腋窩リンパ節にて切除マウス乳癌根治術テクニックを紹介します。臨床場面における遠隔転移疾患のない乳癌患者のための標準治療は乳房切除術^10,11です。乳房切除術、前にイメージングとセンチネル リンパ節生検による腋窩リンパ節転移を調査します。腋窩リンパ節転移の証拠がない場合は、合計または部分的な乳房切除術、腋窩リンパ節の切除を省略すると、患者は扱われます。全乳房切除術のみ、正常な乳房組織の周囲の余白と乳がんを切除する部分切除術は en のブロック、全乳腺と乳がんを切除する技術である節約の残りの正常な乳房組織、患者。ただし、部分的な乳房切除後の残りの正常な乳房組織を維持する患者¹⁰局所再発を避けるために術後の放射線治療が必要です。すべての通常の乳癌を除去する根治的乳房切除を行う腋窩リンパ節転移のある患者は、乳房の組織および腋窩リンパ節と組織 en bloc^10,11に侵攻します。マウス モデルで腋窩リンパ節転移および術後放射線の監視が合理的なまたは不可能です。このように、ローカルまたは腋窩のリンパ節転移を避けるために根治的乳房切除技術を利用します。

尾静脈を介して癌細胞接種は最も一般的な肺転移マウス モデル¹²、いわゆる「実験的転移」です。このモデルは簡単に生成し、手術を必要としません。しかし、転移性疾患の異なる動作可能性があります人間の胸癌進行の模倣はしません。転移が起きる乳房切除後のヒト乳がんがん治療コースを模倣するためには、原発腫瘍が同所性同種癌細胞接種後削除されます。この手法は以前に報告した¹³として、単純な切除と比較して少ない局所再発を生じ、治療、臨床研究、および転移性乳癌癌研究に便利しまいます。ここで説明したテクニックは、ほとんど乳房癌同所性モデル実験に適用されます。ただし、ゼラチン状の蛋白質の混合物は、微小環境に影響を与える手術できる応力/免疫応答¹⁴に影響を与えることを考慮する重要です。したがって、調査官、微小環境やストレス ・免疫応答の勉強は、潜在的な交絡因子のことがあります。

プロトコル

ロズウェル パーク包括的がんセンター機関動物ケアおよび使用委員会から承認が得られたすべての実験。

注:9 つの 12 週齢雌性 balb/c マウスが得られます。4T1 luc2 細胞、マウス乳腺腺癌セルライン BALB/c マウス由来、特急のルシフェラーゼに設計されていますが、使用されます。これらの細胞 10% 牛胎児血清 (FBS) とロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培地で培養されます。

1. 楽器の準備

1. ティッシュ文化フードの氷に凍結ゼラチン質蛋白質の混合物 (例えば、マトリゲル) を解凍します。
2. きれいにしオートクレーブ 2 は手術前に手術器具 (顕微解剖はさみ、アドソン鉗子、持針器) のセットします。滅菌 5-0 絹糸を準備し、(シリアル手術が予定されて) 場合、滅菌剤を乾燥します。
3. クリッパーを使用してマウスの真ん中の胸の毛をクリップし、手術の時の前に耳を打つことによって識別のためマウスをマークします。
4. 操作ですぐに使用することができますプロシージャ テーブルを準備します。
   1. 吸収パッドを広げるとテープのコーナーを修正、作動領域の横にある滅菌と消毒 (クロルヘキシジン、ヨウ素、および 75% エタノール) を入れて、テープで麻酔ノーズコーンを修正し、操作の順序でマウスを配置します。

2. (10 マウス) 用細胞の調製

注:セルは、減らされた細胞生存率を避けるために皿から外れた後 1 h 内接種する必要があります。具体的には、細胞懸濁液、生存を維持するためにお皿からセルをデタッチ後 15 分以内でゼラチン状の蛋白質の混合物にミックスします。

1. 10% RPMI 1640 メディアで、ルシフェラーゼを発現マウス乳腺腺癌細胞株 4T1 luc2 細胞の文化 5% CO₂の 37 ° C で加湿のインキュベーターで政府短期証券。
2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL の血清ピペットを使用して 10 cm 皿の付着 4T1 luc2 セルを洗浄します。0.25% トリプシン P1000 ピペットを使用しての 1 つの mL を追加し、その後、5 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。その後、成長媒体の 4 つの mL を追加 (10% RPMI 1640 FBS) ピペット 5 mL の血清を使用して、ティッシュ文化フードで 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送。180 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心します。
3. 上清を吸引し、2 mL の PBS; で細胞を再懸濁しますその後、検定を使用してセルをカウントします。
4. ティッシュ文化フードの冷 PBS (pH 7.4, 4 ° C) の 40 μ L で 2 x 10⁶ 4T1 luc2 細胞を中断します。
5. ティッシュ文化フードの氷の上の 1.5 mL 遠心チューブにゼリー状のタンパク質混合物の 360 μ L で 40 μ L 細胞懸濁液を混ぜます。
   注:最終濃度が 1 × 10⁵20 μ L (1:9 PBS: ゼラチン状の蛋白質の混合物)。直交異方性モデル (ない乳房切除術)、最終濃度 1 × 10⁴20 μ L 2 週間以内安楽死の基準 (腫瘍サイズ > 2 cm) に達しないように使用されました。

3. 癌細胞接種

1. マウスが冷静に呼吸まで麻酔誘導チャンバー内に 2-4% イソフルランと 0.2 L/分の酸素流量でマウスを置く (2-3 分)。
2. マウスをつかんで、その肩にブプレノルフィン 0.05 mg/kg を皮下注入します。
3. つま先のピンチに反応の欠如によって適切な麻酔を確認します。マウスの鼻を 2-4% イソフルランとキャニスター ユニットに接続されている 2 L/分の酸素流量と吸入麻酔を可能にするマウスのマスクの穴に挿入します。
4. ラボのテープを使用してマウスの四肢を抑制し、クロルヘキシジン、ヨウ素、および 75% エタノール、綿棒を使用して使用して、皮膚を消毒します。
5. 滅菌顕微解剖はさみ、右側に皮膚の切開の横に、はさみを使用して胸壁から皮膚をデタッチし、#2 右公開する皮膚を反転し、リフトを利用した胸壁の真ん中に 5 mm の皮膚切開を行う乳腺の脂肪パッド。
6. 28.5 G 針の傷口から直視下脂肪パッドに 1 mL インスリン注射器を使用して癌細胞の懸濁液の 20 μ L を慎重に挿入します。
   注:針は、傷のない皮膚を通過します。固めるためのゼラチン質蛋白質の混合物のための時間を可能にする、それを引き出してする 5 秒前の脂肪パッドで針を押さえておく。
7. 滅菌 5-0 非吸収性縫合糸を用いたステッチ、皮膚切開を閉じる。
8. 手術後、きれいなケージに動物を返すし、までは回復しているし、自由に動いているか監視 (後 〜 1-2 分)。手術の 24 時間以内に健康にする動物が表示されない場合は、ブプレノルフィン (0.2 mg/kg) を管理します。
9. 麻酔下で抜糸 (手順 3.1 参照) 手術後 7 d。

4. 乳房切除術

注:乳房切除術のタイミングは非常に重要です。それがあまりにも早く行われ、肺転移は発生しません。遅すぎるわ、原発の腫瘍は、腫瘍の切除に挑戦する主要な血管にしました。したがって、複数の時間ポイントはどの時点生産切除になったも挑戦前に転移を待っての適切なバランスを決定する乳房切除術を調べた。50 以上のマウス実験でそう後がん細胞接種後 8 日目に乳房切除術 (または腫瘍径 5 mm に達したとき) が理想であることが実証された¹³のバランスを達成するためにポイントの時間します。

1. イソフルラン吸入 2-4% とマウスを麻酔し、ブプレノルフィンを注入 (3.1 と 3.2 の手順を参照してください)。
2. マウスを抑制し、皮膚を消毒する (3.4 の手順を参照してください)。
3. 顕微解剖はさみを使って、初期癌細胞接種で作られた手術痕から左に 5 mm の皮膚切開 2 mm を確認します。Mastect の時に目に見えるリンパ節が存在しない時間のほとんどの手術痕と腋窩リンパ節流域と同様に、腫瘍に接触して病変を含む皮膚腫瘍を切除する前肢のルートに向かって切開を延長します。omy¹³。腋窩静脈に損害を与えないことを確認します。
4. 「Y」形をした滅菌 5-0 非吸収性縫合糸を用いたステッチ皮膚欠陥を閉じます。
5. 手順 3-8 と同じは彼らが回復するまできれいなケージとモニターにマウスを返します。
6. 麻酔下で抜糸 (手順 3.1 参照) 術後後 7 日目。

5 原発腫瘍 (乳房切除せず同所性同種接種) または肺転移 (乳房切除術モデル) の生物発光の定量化

注:原発腫瘍の負担の定量化, 発光は同所性同種接種翌日から一週間 x 測定 2 です。発光は、肺転移定量化測定 2 倍、乳房切除後の日から 1 週間です。

1. ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 15 mg/mL ティッシュ文化フードの最終濃度に D-ルシフェリンを溶かしてください。因数に光シールド 1.5 mL 容マイクロ チューブします。-80 ° C で希釈した溶液を保存します。
   注:20 g マウス希薄 D-ルシフェリンを 200 μ l 添加が必要です。
2. イメージング ソフトウェアを開き、[初期化] をクリックします。
   注:電荷結合素子 (CCD) を冷却する約 15 分かかります。CCD では、設定温度に達すると、温度のバーの色が赤から緑に変わります。
3. イメージ作成前商工会議所専用の誘導で 2-4% イソフルランとマウスの麻酔 (ステップ 3.1 を参照してください)。
4. マウスの重量を量る。
5. 28.5 G 針を使用して中間の腹部の時点で腹腔 D-ルシフェリンを 150 mg/kg を注入します。
6. 仰臥位 (最大同時に 5 匹の場所) でイメージング システムの内部の鼻の円錐形の各マウスを合わせてください。イメージ投射の間鼻の円錐形を 1%-3% (100% の酸素) のイソフルレンで麻酔を維持します。
7. 50 分間 (または確認されたピーク発光まで) ピーク発光を検出する 5 分ごとのイメージをキャプチャします。
   1. 自動、ビニングを媒体として、ビューのフィールドをDとして発光を選択します。
   2. イメージをキャプチャを取得をクリックします。
8. 彼らの cage(s) にマウスを戻り、(手順 3.8 参照) 回復しているまで、それらを監視します。

6. 肺転移腫瘍負担 Ex Vivo イメージングによる定量化

注:肺転移の定量化は、同所性同種接種と乳房切除モデルなしに適用されます。乳房モデルで前のヴィヴォのイメージングや生存率を観察は、目的に応じて選択されます。同所性同種接種 (乳房) なしモデルでほとんどの場合は接種後約 21 日原発腫瘍サイズの安楽死の条件 (> 2 cm) を生成します。

1. 肺転移巣の ex vivo イメージングによるがん細胞接種後 21 日を定量化します。
2. 2-4% イソフルラン専用誘導室でマウスの麻酔 (ステップ 3.1 を参照してください)。
3. マウスの重量を量る。
4. D-ルシフェリンを 150 mg/kg を腹腔内注入 (手順 5.6 を参照してください)。
5. 頚部転位、注射後 15 分でマウスを安楽死させます。
6. 湾曲したマヨはさみを使用して中間の腹部で皮膚と腹膜を切断することによって腹部を開きます。右と左の両方に切開を拡張します。横隔膜を視覚化; まで鉗子で肝を抜くその後、横隔膜をカットします。
7. 尾の方から両側の肋骨曲線マヨはさみを使用して切り (12 肋骨) に頭の方 (第 1 肋骨) 胸郭の前部壁を反転して肺を公開します。
8. 鉗子による肺を持ち上げることによって、背骨に肺を接続するコードのように見える胸部の食道を識別し、顕微解剖はさみを使って食道を切ってください。
9. 両側肺と心臓鉗子 (牽引、ダウンの方向に頭の方に引っ張って尾の方を適用) を使用し、その後、気管、大血管をカットで肺尖に持ち上げ、頭の方、顕微解剖はさみを使ってします。
   注:これは肺と体から心を分離をできます。
10. 顕微解剖はさみを使って肺から心臓を削除します。
11. 肺を 10 cm シャーレに入れてください。
12. 発光イメージをキャプチャ (5.7.1、5.7.2 手順参照) 安楽死 (ルシフェリン注射後 20 分) 後 5 分。

結果

直交異方性モデルの目的 (すなわち、続いてリンパ節転移と、遠くの肺転移腫瘍の成長) の人間癌の進行を模倣することです¹⁵。がん細胞接種後の発光が定期的に定量化 (2 ~ 3 回/週) (図 1 a)。肺の発光より深く、原発巣よりも小さいです。発光は、主に生きたマウス³ (図 1 bと1 ...

ディスカッション

過去 10 年間の乳がんがんモデル^{3,7,13,16,20,21}を含む複数のマウス癌モデルを確立しています。以前は、乳房癌細胞同所性同種接種直視下乳腺組織ではした外科的切開^{7 なし乳首の周りの細胞を注入することと比較してより少ないサイ...}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture