Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

Zusammenfassung

Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.

Zusammenfassung

In-vivo Mausmodellen Brust Krebs Fortschreiten zu beurteilen sind unerlässlich für die Krebsforschung, einschließlich der präklinischen Medikament Entwicklungen. Der Großteil der praktischen und technischen Daten entfallen jedoch häufig in veröffentlichten Manuskripte, die daher, macht es schwierig, um die Modelle zu reproduzieren, besonders wenn es um chirurgische Techniken geht. Biolumineszenz Technologie ermöglicht die Auswertung von geringen Mengen von Krebszellen auch wenn ein Tumor nicht greifbar ist. Verwendung von Krebszellen Luciferase-zum Ausdruck zu bringen, schaffen wir eine Brust Krebs orthotopen Inokulation Technik mit einer hohen Tumorgenese. Lungenkrebs Metastasen ist ein ex-Vivo -Technik bewertet. Wir etablieren dann eine Mastektomie-Modell mit einer niedrigen lokale Rezidivrate der metastatischen Tumorlast zu beurteilen. Hierin beschrieben, detailliert, die Operationstechniken der orthotopen Implantation und Brustamputation für Brustkrebs mit einer hohen Tumorgenese und niedrigen lokalen Rezidivraten bzw. zur Verbesserung der Brust Krebs Modell Effizienz.

Einleitung

Tiermodelle spielen eine Schlüsselrolle in der Krebsforschung. Wenn eine Hypothese in vitro nachgewiesen ist, sollte es in-vivo auszuwertende ihre klinische Relevanz geprüft werden. Tumorprogression und Metastasierung sind oft besser von Tiermodellen im Vergleich zu in-vitro-Modelle erfasst, und es ist wichtig, ein neues Medikament testen in einem Tiermodell als einer präklinischen Studie für Droge-Entwicklung^1,2. Die technischen Details von Tierversuchen sind jedoch oft nicht gut beschrieben in veröffentlichten Artikeln, so dass es eine Herausforderung, das Modell erfolgreich zu reproduzieren. In der Tat ging die Autoren, die diese orthotopen Inokulation und Mastektomie Modelle hergestellt durch langen und strengen Prozesse von Versuch und Irrtum. Die Erfolgsquote bei der Tumorgenese nach Krebs Zelle Impfung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg und die Effizienz eines Tieres studieren³. Die Zell-Linie und die Anzahl der Zellen zu impfen, die Impfung-Website und die Belastung der Mäuse sind alle wichtigen Faktoren. Es ist bekannt, dass es große Unterschiede in den Ergebnissen von Tierversuchen durch individuelle Unterschiede im Vergleich zu in-vitro-Techniken gibt. Daher ist es wichtig, stabile Ergebnisse zur Verbesserung der Effizienz von Tierversuchen und irreführende Ergebnisse zu vermeiden, mit einem etablierten Modell mit einem standard-Technik.

Dieses Dokument enthält etablierte Techniken⁴ um Brust Krebs orthotopen und Mastektomie Mausmodellen zu generieren. Die Ziele dieser Methoden sind 1) menschliche Muttermilch Tumorprogression und Behandlungszyklen zu imitieren, und (2) in vivo Experimente mit mehr Effizienz und höhere Erfolgsraten im Vergleich zu anderen Brust-Krebs-Impfung oder Mastektomie Techniken. Im orthotopen Krebs Zelle Inokulation um menschliche Muttermilch Tumorprogression, imitieren wählen wir #2 Mamma Fettpolster als Impfung Website, befindet sich in der Brust. In den meisten Studien, Brustkrebs-Zellen werden subkutan geimpft⁵. Diese Technik erfordert keine Operation, und so ist es einfach und unkompliziert. Die subkutane Mikroumgebung unterscheidet sich jedoch von der Brustdrüse Mikroumgebung, die Ergebnisse in verschiedenen Tumorprogression und auch molekularer Profile^6,7. Einige Studien verwenden #4 Brustdrüse, die sich in der Bauchhöhle befindet, als eine Impfung Seite⁶. Da jedoch #4 Milchdrüsen in der Bauchhöhle befinden, ist die häufigste metastasierendem Muster peritonealen Carcinomatosis⁷, die mit weniger als 10 % von metastasierendem Brustkrebs Krebs⁸auftritt. Generiert durch die Technik in der Brustdrüse #2 das hier vorgestellte Brustkrebs metastasiert in die Lunge, die eines der häufigsten Brust Krebs metastasiertem Websites⁹ist.

Mit dieser Technik soll auch eine höhere Tumorgenese mit minimalen Tumor Größe Variabilität im Vergleich zu anderen Brust Krebs Impfung zu erzielen. Hierzu sind Krebszellen, die in eine gallertartige Proteinmischung ausgesetzt unter direkter Sicht durch einen medianen vorderen Brust Wand Schnitt geimpft. Diese Technik sorgt für eine hohe Tumorgenese Rate mit weniger Variabilität in der Größe des Tumors und Form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgische Injektion, wie bereits berichtet^3,7.

Wir führen auch eine Maus radikale Mastektomie Technik in der orthotopen Brusttumor mit dem umliegenden Gewebe und axillären Lymphknoten reseziert wird. In der klinischen Einstellung ist die Standardtherapie für Patientinnen mit Brustkrebs ohne Fernmetastasen Krankheit Mastektomie^10,11. Bevor eine Mastektomie wird axillären Lymphknoten-Metastasen von Bildgebung und Sentinel-Lymphknoten-Biopsie befragt. Wenn es keinen Beweis der axillären Lymphknoten-Metastasen gibt, ist der Patient dann mit eine vollständige oder partielle Mastektomie, behandelt in der axillären Lymphknoten-Resektion weggelassen wird. Totale Mastektomie ist eine Technik, um Brustkrebs mit das ganze Brustgewebe en bloc zu resezieren, während partielle Mastektomie Brustkrebs mit einer Marge von umgebenden normalen Brustgewebe, resezieren somit Erhaltung der verbliebenen normalen Brustgewebe in der Patienten. Patienten, die Erhaltung normalen Brustgewebe nach einer partiellen Mastektomie verbleibende erfordern jedoch postoperative Strahlentherapie Lokalrezidiv¹⁰zu vermeiden. Patienen mit axillären Lymphknoten-Metastasen, die radikale Mastektomie verpflichten sich, wodurch das Brustkrebs mit allen normalen Brust-Gewebe und axillären Lymphknoten und marschierte in Geweben En Bloc^10,11. Im Mausmodell ist die Überwachung für axillären Lymphknoten Metastasen und/oder postoperative Bestrahlung nicht sinnvoll oder machbar. So nutzen wir die radikale Mastektomie-Technik zur Vermeidung von lokalen oder axillären Lymphknoten-Metastasen.

Krebs Zelle Beimpfen über die Rute Vene ist die am weitesten verbreitete Lunge Metastasen Maus Modell¹², die so genannte "experimentelle Metastase". Dieses Modell ist leicht zu generieren und erfordert keine Operation; jedoch ist es nicht menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren die verschiedenen Metastasen Verhalten führen können. Um die menschliche Brust Krebs Behandlung natürlich imitieren wo Metastasierung häufig nach Mastektomie tritt, ist nach der orthotopen Krebs Zelle Inokulation der Primärtumor entfernt. Diese Technik erzeugt weniger Lokalrezidiven im Vergleich zu einfachen Tumor-Resektion, wie bereits berichtet¹³, und eignet sich für neuer Therapeutika, präklinische Studien und für metastasierendem Brustkrebs Krebs Forschungsstudien. Die hier beschriebenen Techniken sind für die meisten Brust Krebs orthotopen Modellversuche. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die gallertartige Proteinmischung die Mikroumgebung beeinflussen und Operation Stress/Immune Antwort^{14 beeinflussen}. Daher sollten Forscher studieren die Mikroumgebung und/oder Stress/Immunantwort Potenzial Störfaktoren berücksichtigen.

Protokoll

Die Genehmigung vom Roswell Park umfassende Cancer Center institutionelle Animal Care und Use Committee war für alle Experimente.

Hinweis: Neun bis zwölf Wochen alten weiblichen BALB/c Mäusen stammen. 4T1-luc2 Zellen, eine Maus Mamma Adenokarzinom Zelllinie von BALB/c Mäusen abgeleitet, die auf ausdrücklichen Luciferase entwickelt, hat dienen. Diese Zellen sind in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert.

1. Vorbereitung der Instrumente

1. Tauen Sie eine gefrorene gallertartige Proteinmischung (z. B. Matrigel) auf dem Eis in einer Gewebekultur-Haube.
2. Reinigen und Autoklav zwei Sätze von chirurgischen Instrumenten (Mikrodissektion Schere, Adson Pinzette und einem Nadelhalter) vor der Operation. Bereiten Sie sterilisiert 5-0 Seide Nähte und trocknen Sie Sterilisationsmittel (wenn serielle Operationen geplant sind).
3. Schneiden Sie die Mitte der Brusthaare der Mäuse mit einer Haarschneidemaschine und markieren Sie die Mäuse für die Identifizierung durch Stanzen das Ohr vor dem Zeitpunkt der Operation.
4. Bereiten Sie die Prozedurentabelle, die für den Betrieb sofort verwendet werden kann.
   1. Verbreiten Sie eine saugfähige Unterlage zu und fixieren Sie die Ecken mit Klebeband, beheben Sie Narkose Nase Kegel mit Klebeband, Sterilisations- und Desinfektionsmittel (Chlorhexidin, Jod, und 75 % Ethanol) setzen neben Betätigungsraum zu, und die Mäuse in Betrieb Reihenfolge.

2. Vorbereitung der Zellen (für 10 Mäuse)

Hinweis: Die Zellen sollten innerhalb 1 h nach losgelöst aus der Schale zu vermeiden verminderte Zellviabilität geimpft werden. Insbesondere sollten die Zellsuspension in die gallertartige Proteinmischung innerhalb von 15 Minuten gemischt werden, nach Abnehmen der Zellen aus der Schale um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.

1. 4T1-luc2 Kulturzellen, eine Maus Mamma Adenokarzinom Zell-Linie mit dem Ausdruck Luciferase in RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO₂.
2. Waschen Sie die anhaftenden 4T1-luc2 Zellen in einer 10 cm Petrischale mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer serologischen 10 mL-Pipette. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Trypsin mit einer Pipette P1000 und dann inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 5 min. Fügen Sie 4 mL Wachstumsmedien (RPMI-1640 mit 10 % FBS) mit einer serologischen 5 mL pipette und übertragen die Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr in einer Gewebekultur-Haube. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 180 X g für 5 min.
3. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen in 2 mL PBS; dann zählen Sie die Zellen unter Verwendung der Hemocytometer.
4. 2 x 10⁶ 4T1-luc2 Zellen in 40 μl von kaltem PBS (pH 7.4, 4 ° C) in der Gewebekultur Haube auszusetzen.
5. Mischen Sie die 40 μl Zellsuspension mit 360 μL der gallertartigen Proteinmischung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis in der Gewebekultur-Haube.
   Hinweis: Die Endkonzentration wird 1 x 10⁵20 μl (1:9 PBS: gallertartige Proteinmischung). Für das orthotopen Modell (keine Mastektomie) war 1 x 10⁴20 μL der endgültige Konzentration verwendet, um zu vermeiden, Euthanasie Kriterien (Tumor Größe > 2 cm) innerhalb von zwei Wochen zu erreichen.

3. Krebs Zelle Inokulation

1. Setzen die Mäuse in der Anästhesie-Induktion-Kammer mit 2-4 % Isofluran und 0,2 L/min Sauerstoff-Fluss, bis die Mäuse ruhig atmen (2 – 3 min.).
2. Fassen Sie die Maus und injizieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin in seiner Schulter subkutan zu.
3. Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch den Mangel an Reaktion auf eine Zehe Prise. Legen Sie die Maus Nase in das Loch der Maske Maus, wodurch inhalativer Anästhesie mit 2-4 % Isofluran und 2 L/min Sauerstoff fließen zu einer Einheit Kohle Behälter befestigt.
4. Die Maus Gliedmaßen mit Lab Klebeband zurückhalten und seine Haut mit Chlorhexidin, Jod und 75 % Ethanol, mit Wattestäbchen zu sterilisieren.
5. Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt in der Mitte der vorderen Brustwand Verwendung steril Mikrodissektion Schere, Aufzug die rechten Seite neben der Schnitt der Haut und die Haut von der Brustwand mit der Schere zu trennen und dann invertieren die Haut um das Recht #2 verfügbar zu machen Mamma Fettlappen.
6. 20 μl Zellsuspension Krebs mit einer Spritze 1 mL Insulin mit einer 28,5 G-Nadel in Fettpolster unter direkter Sicht durch die Wunde sorgfältig zu injizieren.
   Hinweis: Die Nadel geht durch die Wunde, nicht die Haut. Halten Sie die Nadel in die Fettpolster für 5 s vor zu ziehen, die Zeit für die gallertartige Proteinmischung zu erstarren lässt.
7. Schließen Sie die Hautschnitte durch Nähte, mit nicht resorbierbaren Fäden steril 5-0.
8. Nach der Operation, die Tiere wieder einen sauberen Käfig und überwachen sie, bis sie sich erholt haben und sind frei bewegen (nach ~ 1 – 2 min.). Wenn ein Tier nicht angezeigt wird, um bei guter Gesundheit innerhalb von 24 Stunden nach der Operation sein, verwalten Sie Buprenorphin (0,2 mg/kg).
9. Die Nähte in Narkose zu entfernen (siehe Punkt 3.1) 7 d nach der Operation.

(4) Mastektomie

Hinweis: Das Timing der Mastektomie ist sehr wichtig. Wenn sie zu früh erfolgt, tritt Lungenkrebs Metastasen nicht. Wenn sie zu spät erfolgt, eingedrungen der Primärtumor großen Blutgefäße, die eine komplette onkologische Resektion schwierig machen. So wurden mehrere Zeitpunkte für Mastektomie zu bestimmen, welcher Zeitpunkt produziert das richtige Gleichgewicht in der Wartezeit für Metastasen vor Resektion zu schwierig wurde geprüft. Nach dabei in mehr als 50 Maus-Experimente, es zeigte sich, dass Mastektomie 8 Tage nach der Inokulation Krebs Zelle (oder wenn die Größe des Tumors, 5 mm erreicht) die ideale war Zeit Punkt zu erreichen, die¹³Bilanz.

1. Eine Maus mit 2-4 % inhaliert Isofluran zu betäuben und injizieren Buprenorphin (siehe Schritte 3.1 und 3.2).
2. Die Maus zurückhalten und seine Haut zu sterilisieren (siehe Punkt 3.4).
3. Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt 2 mm auf der linken Seite aus die Operationsnarbe, die bei der ursprünglichen Krebs Zelle Inokulation mit der Schere Mikrodissektion erfolgte. Verlängern den Schnitt in Richtung der Wurzel der Vordergliedmaße, den Tumor zu entfernen, die Haut unter anderem die Operationsnarbe und die Läsion in Kontakt mit den Tumor sowie der axillären Lymphknoten-Becken, in dem meiste Zeit keine sichtbaren Lymphknoten existiert zum Zeitpunkt der mastect Konjunktur-¹³. Achten Sie darauf, nicht die axillaris Vene zu beschädigen.
4. Schließen Sie die Hautdefekte durch Nähte, mit nicht resorbierbaren Fäden steril 5-0 in der Form eines "Y".
5. Das gleiche wie in Schritt 3,8, zurück die Maus zu einem sauberen Käfig und Monitor, bis sie sich erholt haben.
6. Die Nähte in Narkose zu entfernen (siehe Punkt 3.1) 7 Tage nach der Operation.

5. Biolumineszenz Quantifizierung des Primärtumors (Orthotopic Impfung ohne Mastektomie) oder Lunge Metastasen (Mastektomie Modell)

Hinweis: Die Biolumineszenz ist für Primärtumor Belastung Quantifizierung gemessenen 2 x pro Woche ab dem Tag nach der Inokulation orthotopen. Für die Lunge Metastasen Quantifizierung ist die Biolumineszenz gemessenen 2 x pro Woche ab dem Tag nach der Mastektomie.

1. D-Luciferin in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS), eine Endkonzentration von 15 mg/mL in einer Gewebekultur Kapuze auflösen. Aliquoten Röhren in 1,5 mL Licht abgeschirmt Microcentrifuge. Speichern Sie die verdünnte Lösung bei-80 ° C.
   Hinweis: Für eine 20 g-Maus ist 200 µL verdünnter D-Luciferin erforderlich.
2. Öffnen Sie die imaging-Software, und klicken Sie auf zu initialisieren.
   Hinweis: Es dauert ca. 15 min. abkühlen – Coupled Ladegerät (CCD). Wenn der CCD die eingestellte Temperatur erreicht, wechselt die Farbe des Balkens Temperatur von rot auf grün.
3. Die Mäuse mit 2-4 % Isofluran in einer dedizierten Induktion Kammer vor Bildgebung zu betäuben (siehe Punkt 3.1).
4. Wiegen Sie die Mäuse.
5. 150 mg/kg D-Luciferin intraperitoneal zum Zeitpunkt der Mitte des Bauches, mit Hilfe einer Nadel 28,5 G zu injizieren.
6. Passen Sie jede Maus mit einer Nase Kegel innerhalb der imaging-System in der Rückenlage (Platz maximal fünf Mäuse zur gleichen Zeit). Anästhesie bei 1 % - 3 % Isofluran (in 100 % Sauerstoff) durch die Nase Kegel während der Bildgebung zu erhalten.
7. Erfassen Sie ein Bild alle 5 min um die Gipfel Biolumineszenz für 50 min (oder bis die bestätigten Peak Biolumineszenz) zu erkennen.
   1. Wählen Sie Auto, Binning , als Mediumund Sichtfeld als D Lumineszenz .
   2. Klicken Sie auf erfassen um das Bild aufzunehmen.
8. Zurückkehren Sie die Mäuse zu ihren Referenzdrehzahl und überwachen sie, bis sie sich erholt haben (siehe Punkt 3.8).

(6) Lunge Metastasen Tumor Belastung Quantifizierung von Ex-Vivo Bildgebung

Hinweis: Lungenkrebs Metastasen Quantifizierung ist für orthotopen Inokulation mit und ohne Mastektomie Modelle anwendbar. Im Modell Mastektomie ist ex-Vivo Bildgebung oder Überleben Beobachtung gewählt, je nach Verwendungszweck. Im orthotopen Inokulation (ohne Mastektomie) Modell produzieren meist Primärtumor Euthanasie Größenkriterien (> 2 cm) ca. 21 Tage nach der Inokulation.

1. 21 Tage nach der Krebs Zelle Inokulation von ex-Vivo Bildgebung Lunge metastatischen Läsionen zu quantifizieren.
2. Die Mäuse mit 2-4 % Isofluran in einer dedizierten Induktion Kammer zu betäuben (siehe Punkt 3.1).
3. Wiegen Sie die Mäuse.
4. 150 mg/kg D-Luciferin intraperitoneale Injektion (siehe Punkt 5.6).
5. Die Mäuse durch zervikale Dislokation, 15 min nach der Injektion einschläfern.
6. Öffnen Sie den Bauch durch Schneiden der Haut und Bauchfell in der Mitte des Bauches, mit Mayo Schere gebogen. Den Schnitt auf der rechten und der linken zu verlängern. Herausziehen der Leberzellkrebs mit der Pinzette, bis das Zwerchfell visualisiert wird; dann schneiden Sie die Membran.
7. Mit der gebogenen Mayo Schere schneiden die bilateralen Rippen aus kaudale (12. Rippen), kopfwärts (1. Rippen), die Lunge aussetzen durch Umklappen der vorderen Thorax-Wand.
8. Identifizieren der thorakalen Ösophagus, die aussieht wie eine Schnur verbindet die Lunge an der Wirbelsäule durch Anheben der Lunge mit Pinzette und dann schneiden mit der Schere Mikrodissektion Speiseröhre.
9. Heben Sie die bilateralen Lunge und Herz mit Zange (Anwendung Traktion herunterziehen, in Richtung der kopfwärts zu kaudale) und dann schneiden Sie die Luftröhre und die großen Schiffe an die Spitze der Lunge bei der kopfwärts, Mikrodissektion Schere verwenden.
   Hinweis: Dies ermöglicht für die Isolierung von Lunge und Herz aus dem Körper.
10. Entfernen Sie das Herz aus der Lunge mit Mikrodissektion Schere.
11. Legen Sie die Lungen in einer 10 cm Petrischale.
12. Erfassen Sie das Abbild der Biolumineszenz (siehe Schritte 5.7.1 und 5.7.2) 5 min nach Euthanasie (20 min nach der Injektion von Luciferin).

Ergebnisse

Orthotopen Modell soll imitieren menschlichen Krebs Fortschreiten (d. h., das Wachstum des Primärtumors gefolgt von Lymphknoten-Metastasen und dann entfernte Lunge Metastasen)¹⁵. Nach Krebs Zelle Inokulation, die Biolumineszenz wird quantifiziert, regelmäßig (zwei-bis dreimal / Woche) (Abbildung 1A). Die Biolumineszenz in der Lunge ist tiefer und kleiner als die primäre Läsion. Die Biolumineszenz spiegelt vor allem die pr...

Diskussion

Für das letzte Jahrzehnt etablieren wir mehrere murinen Krebs-Modelle, einschließlich Brust Krebs Modelle^{3,7,13,16,20,21}. Bisher haben wir gezeigt, dass Brustkrebs Krebs Zelle orthotopen Inokulation in das Brustdrüsengewebe unter direkter Sicht einen größeren Tumor mit weniger Größe Variabilität im Vergleich zu injizi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture