Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

요약

Murine orthotopic 유 방 암 모델 및 과격 한 유 방 절제술 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방 하기 위해 종양 부담 척도를 생물 발광 기술을 소개 합니다.

초록

유 방 암 진행을 평가 하기 위해 vivo에서 마우스 모델 연구, 전 임상 약물 개발을 포함 한 필수적입니다. 그러나, 실용적이 고 기술적인 내용의 대다수는, 그러므로, 도전 수술 기법을 포함 하는 경우에 특히, 모델을 재현 하는 출판된 원고에 일반적으로 생략 됩니다. 생물 발광 기술 종양은 만져 서 하는 경우에 적은 양의 암 세포의 평가 대 한 수 있습니다. 암 세포 luciferase 표현에 활용 하 여, 우리 높은 tumorigenesis 속도와 유 방 암 orthotopic 접종 기법을 설정 합니다. 폐 전이 비보 전 기술을 활용 하 여 평가 됩니다. 우리, 그럼, 전이성 종양 부담을 평가 하기 위해 낮은 로컬 재발 률과 유 방 절제술 모델을 설정 합니다. 여기, 우리, 자세히 설명, orthotopic 주입 및 높은 tumorigenesis 속도와 낮은 로컬 되풀이 요금, 유방암을 위한 유 방 절제술의 수술 기법 각각, 유 방 암 모델 효율을 향상 시킨다.

서문

동물 모델 연구에 핵심 역할을 한다. 가설을 생체 외에서 입증 하는 때 그것의 임상 관련성을 평가 하는 vivo에서 시험 되어야 한다. 암 진행과 전이 종종 더 나은 잡혀 체 외 모델에 비해 동물 모델 그리고 약물 개발^1,2에 대 한 전 임상 연구로 동물 모델에서 신약을 테스트 것이 필수적입니다. 그러나, 동물 실험의 기술적인 세부 사항은 종종 모델을 성공적으로 재현에 도전 하는 게시 된 기사에서 잘 기술 된다. 사실, 이러한 orthotopic 접종 및 절제술 모델 설립 저자는 시행 착오의 길고 엄격한 과정을 통해 갔다. Tumorigenesis 후 암 세포 접종 중 하나 이며 성공 여부를 결정 하는 주요 인 동물의 효율성의 연구³. 셀 라인 및 세포 접종, 접종 사이트 및 쥐의 긴장의 수는 모두 중요 한 요소. 그것은 잘 알려진 체 외 기법에 비해 개별 차이 동물 실험의 결과에 큰 변화는. 따라서, 표준 기술로 잘 설립 모델을 사용 하 여 안정적인 결과, 동물 실험의 효율성을 개선 하 고 잘못 된 결과 피하기 위해 중요 하다.

이 종이 잘 설립 기법⁴ 유 방 암 orthotopic 및 절제술 마우스 모델을 생성 하를 제공 합니다. 이 방법의 목표 1) 인간의 유방암 암 진행 및 치료 과정을 모방 하 고 2) 더 큰 효율성과 다른 유 방 암 접종 또는 유 방 절제술 기법에 비해 높은 성공률 생체 조건 실험을 실시 하. Orthotopic 암 세포 접종에서 인간의 유방암 암 진행, 모방을 우리 선택 #2 유 방 지방 패드 접종 사이트로, 가슴에 있는. 연구의 대부분에서는, 유 방 암 세포는 피하 주사는⁵. 이 기술은 수술을 요구 하지 않는다 그리고, 따라서, 그것은 간단 하 고 간단. 그러나, 피하 microenvironment 다른 암 진행에도 분자 프로 파일^6,7결과 유선 microenvironment에서 매우 다르다. 일부 연구는 복 부에 있는 #4 유선을 사용 하 여 접종 사이트⁶. 그러나, #4 유 방 동맥은 복 부에 위치 하 고 있습니다, 가장 일반적인 전이성 패턴 이므로 복 수⁷, 전이성 유방암 암⁸의 10% 미만으로 발생 하는. 유 방 암 #2 유선에 여기 제시 하는 기술에 의해 생성 된 가장 일반적인 유 방 암 전이성 사이트⁹중 폐에 metastasizes.

이 기술은 목표와 다른 유 방 암 접종 기법에 비해 최소한의 종양 크기 변화 더 높은 tumorigenesis 속도 달성 하기 위해 이기도 합니다. 이렇게 하려면 암 세포는 젤라틴 단백질 혼합물에 중간 앞쪽 가슴 벽 절 개를 통해 직접 비전 주사 됩니다. 이 기술은 종양 크기와 모양이 이전에 보고 된^3,7피하 또는 비-외과 주사에 비해 적은 변동성으로 높은 tumorigenesis 속도 생성 합니다.

우리는 또한 orthotopic 유 방 종양 주변 조직 및 겨드랑이 림프절 절제는 마우스 급진적 절제술 기법을 소개 합니다. 임상 설정에서 먼 전이 질병 없이 유방암 환자에 대 한 치료의 표준 유 방 절제술^10,11이다. 유 방 절제술, 전에 겨드랑이 림프절 전이 이미징 및 센 티 넬 림프절 생 검에 의해 조사 했다. 겨드랑이 림프절 전이의 증거가 있는 경우에, 환자는 전체 또는 부분 유 방 절제술, 겨드랑이 림프절 절제를 생략 하면 다음 처리 됩니다. 총 유 방 절제술은 일괄적, 전체 유 방 조직으로 유방암 resect 기술 부분 유 방 절제술은 정상 유 방 조직만, 주변의 여백으로 유방암 resect 반면 나머지 정상 유 방 조직에 따라서 보존은 환자입니다. 그러나, 부분 유 방 절제술 후 남아 있는 정상적인 유 방 조직을 유지 하는 환자¹⁰현지 재발 피하기 위해 수술 후 방사선 치료를 필요 합니다. 겨드랑이 림프절 전이 수행 모든 정상으로 유방암을 제거 하는 과격 한 유 방 절제술 환자 조직과 겨드랑이 림프절을 유 방 하 고 조직 en 블록^10,11을 침공. 마우스 모델에서 겨드랑이 림프절 전이 및 수술 후 방사선에 대 한 감시가 아니다 합리적인 또는 가능한. 따라서, 우리는 로컬 또는 겨드랑이 림프절 전이 피하기 위해 과격 한 유 방 절제술 기법을 이용 한다.

꼬리 정 맥을 통해 암 세포 접종은 가장 일반적인 폐 전이 마우스 모델¹², 소위 "실험적인 전이". 이 모델 생성 하기 쉽습니다와 수술; 필요 하지 않습니다. 그러나, 그것은 결과가 발생할 수 있습니다 다른 전이성 질병을 인간의 유방암 암 진행을 모방 하지 않습니다. 전이 종종 유 방 절제술 후 발생 하는 인간의 유방암 암 치료 과정을 모방 하기 위해 기본 종양 orthotopic 암 세포 접종 후 제거 됩니다. 이 기술은 이전에 보고 된¹³, 간단한 종양 절제술에 비해 적은 지역 되풀이 생성 하 고 새로운 치료제, 임상 연구, 그리고 전이성 유 방 암 연구 연구에 대 한 유용. 여기서 설명 대부분 유 방 암 orthotopic 모델 실험에 대 한 적용 됩니다. 그러나, 그것은 젤라틴 단백질 혼합물은 microenvironment에 영향을 미칠 수 있습니다 수술 스트레스/면역 응답¹⁴에 영향을 미칠 수 있습니다 고려 하는 것이 중요. 따라서, 조사자는 microenvironment / 스트레스/면역 응답을 공부 하 고 잠재적인 혼동 요인의 알고 있어야 합니다.

프로토콜

로스웰 파크 종합 암 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인을 얻은 모든 실험에 대 한.

참고: 12 주 오래 된 여성 BALB/c 마우스 9 얻을 수 있습니다. 4T1 luc2 셀, 마우스 유 방 선 암 세포 라인 BALB/c 마우스에서 파생 된 표현 luciferase 하도록 설계 되었습니다 사용 됩니다. 이러한 세포 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체에 교양.

1입니다. 악기의 준비

1. 조직 문화 후드에 얼음에 냉동된 젤라틴 단백질 혼합물 (예를들면, Matrigel)를 녹여.
2. 깨끗 하 고 압력솥 2 수술 전에 수술 악기 (기정, Adson 집게가 위와 바늘 홀더)의 세트. 멸 균된 5-0 비단 봉합 준비 하 고 (때 직렬 수술은 계획 되는) sterilant를 건조.
3. 클립은 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 중간 가슴 털 고 펀칭 수술 전 귀 여 식별에 대 한 마우스를 표시 합니다.
4. 작업에 즉시 사용할 수 있는 프로시저 테이블을 준비 합니다.
   1. 흡수 성 패드를 확산 하 고 테이프로 모서리를 수정, 운영 공간 옆에 있는 테이프, sterilant 및 살 균 제 (액체, 요오드, 및 75% 에탄올)을 넣어 마 취 코 콘을 수정 작업 순서에 쥐를 놓습니다.

2. (10 쥐)에 대 한 셀의 준비

참고: 셀을 감소 세포 생존 능력을 피하기 위해 접시에서 분리 되 고 후 1 시간 이내 주사 한다. 특히, 세포 현 탁 액 15 분 이내 젤라틴 단백질 혼합물으로 그들의 생존을 유지 하기 위해 접시에서 세포를 분리 후 혼합 한다.

1. 문화 4T1 luc2 셀 마우스 유 방 선 암 셀 라인 표현 luciferase RPMI 1640 미디어 10%에서 5% CO₂에서 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 FBS.
2. 워시와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 10 cm 접시에 부착 4T1 luc2 셀. P1000 피 펫을 사용 하 여 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고, 다음, 5 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어. 그런 다음, 성장 미디어의 4 개 mL를 추가 (RPMI-1640 10 %FBS) 5 mL 혈 청 학적인를 사용 하 여 플라스틱 및 조직 문화 후드에 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 180 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액 원심
3. 발음은 상쾌한 고 2 ml PBS;의 셀 resuspend 그런 다음는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
4. 조직 문화 후드에 차가운 PBS (pH 7.4, 4 ° C)의 40 μ 2 x 10⁶ 4T1 luc2 셀을 일시 중단 합니다.
5. 조직 문화 후드에 얼음에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 젤라틴 단백질 혼합물의 360 μ와 40 μ 세포 현 탁 액을 섞는다.
   참고: 최종 농도 1 x 10⁵/20 μ (1:9 PBS: 젤라틴 단백질 혼합물). Orthotopic 모델 (절제술), 1 x 10⁴/20 μ 최종 농도의 2 주 안에 안락사 기준 (종양 크기 > 2 c m)를 도달 하는 피하기 위해, 사용 되었다.

3. 암 세포 접종

1. 생쥐는 침착 하 게 숨을 쉴 때까지 2-4 %isoflurane 및 0.2 L/min 산소 흐름 마 취 유도 실에서 쥐를 넣어 (2-3 분).
2. 마우스를 파악 하 고 그것의 어깨에 0.05 mg/kg buprenorphine를 피하 주사.
3. 발가락 핀치에 반응의 부족으로 적절 한 마 취를 확인 합니다. 2-4 %isoflurane 숯 용기 단위에 연결 된 2 L/min 산소 흐름 inhalational 마 취 수 있는 마우스 마스크의 구멍으로 마우스의 코를 삽입 합니다.
4. 랩 테이프를 사용 하 여 마우스의 사지를 구속 하 고 액체, 요오드, 면봉을 사용 하 여 75% 에탄올을 사용 하 여 피부를 소독.
5. 메 마른 서가 위, 오른쪽 절 개 옆 피부 고 피부는가 위를 사용 하 여 가슴 벽에서 분리 하 고 다음, 오른쪽 #2 노출 피부 반전 리프트를 이용 하 여 앞쪽 가슴 벽 중간에 5mm 피부 절 개를 하 게 유 방 지방 패드입니다.
6. 신중 하 게 20 μ 28.5 G 바늘으로 상처를 통해 직접적인 비전 아래 지방 패드에 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 암 세포 현 탁 액의 주사.
   참고: 바늘 없는 피부 상처를 통해 간다. 공고히 젤라틴 단백질 혼합물에 대 한 시간을 수 있는 계속 당기는 그것을 밖으로, 5 s 이전에 대 한 지방 패드에 바늘을 들고.
7. 살 균 5-0 비 흡수 봉합을 사용 하 여 바느질, 여 피부 절 개를 닫습니다.
8. 수술 후, 깨끗 한 케이지를 동물을 반환 하 고 그들은 회복 하 고 자유롭게 이동 하는 때까지 그들을 모니터링 (후 ~ 1-2 분). 동물 건강 수술의 24 시간 이내에 표시 되지 않으면, buprenorphine (0.2 mg/kg)를 관리 합니다.
9. 마 취 봉합을 제거 (단계 3.1 참조)는 수술 후 7 d.

4입니다. 유 방 절제술

참고: 유 방 절제술의 타이밍은 매우 중요 하다. 너무 일찍 완료 되 면 폐 전이 발생 하지 않습니다. 너무 늦게 완료 되 면 기본 종양 주요 혈관, 완전 한 종양 절제를 도전 할을 침공 했다. 따라서, 여러 시간 점 어떤 시간 포인트 제작 전에 절제 된 너무 도전적인 전이 대 한 대기에 적절 한 균형을 결정 하는 유 방 절제술에 대 한 테스트 되었습니다. 이렇게 50 마우스 실험에서 그것은 암 세포 접종 후 8 일에 유 방 절제 (또는 종양 크기 5 m m를 도달 하는 때)는 이상적인 시연 했다¹³균형을 달성 하기 위해 포인트를 시간.

1. 2-4% 흡입 isoflurane와 마우스 anesthetize 및 buprenorphine 주사 (3.1, 3.2 단계 참조).
2. 마우스를 억제 하 고 피부를 소독 (단계 3.4 참조).
3. 서가 위를 사용 하 여 초기 암 세포 접종에서 외과 흉터에서 왼쪽에 5mm 피부 절 개를 2 mm를 확인 합니다. 종양 제거 forelimb의 루트 쪽으로 절 개를 확장, 피부 등 수술 흉터, 겨드랑이 림프절 분 지로 서 종양, 연락 병 변에서 대부분의 시간 아니 보이는 림프 노드는 mastect의 시간에 존재 omy¹³. 겨드랑이 정 맥 손상 되었는지 확인 합니다.
4. "Y"의 형태로 살 균 5-0 비 흡수 봉합을 사용 하 여 바느질, 여 피부 결함을 닫습니다.
5. 단계, 3.8에서와 같이 그들이 복구 될 때까지 깨끗 한 케이지 및 모니터에 마우스를 반환 합니다.
6. 마 취 봉합을 제거 (단계 3.1 참조) 수술 후 7 일.

5. 발광 부 량 기본 종양 (유 방 절제술 없이 Orthotopic 접종) 또는 폐 전이 (유 방 절제술 모델)

참고: 기본 종양 부담 정량화는 생물 발광 측정된 2x orthotopic 접종 후 하루에서 일주일입니다. 폐 전이 정량화는 생물 발광 측정된 2x는 유 방 절제술 후 하루에서 일주일입니다.

1. Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 조직 문화 후드에서 15 mg/mL의 최종 농도에서 D-소를 용 해. 1.5 mL 빛 차폐 microcentrifuge로 튜브 aliquot 합니다. -80 ° c.에 희석된 솔루션 저장
   참고: 20 g 마우스 희석된 D-소의 200 µ L가 필요 합니다.
2. 이미징 소프트웨어를 열고 초기화를 클릭 합니다.
   참고: 그것은 충전-결합 소자 (CCD)을 약 15 분 걸립니다. CCD에서 설정된 온도 도달 하면 온도 바의 색 빨강에서 녹색으로 바뀝니다.
3. Anesthetize 영상 전에 전용된 유도 실에서 2-4 %isoflurane 쥐 (단계 3.1 참조).
4. 쥐의 무게.
5. D-소 28.5 G의 바늘을 사용 하 여 중간 복 부 지점에서 intraperitoneally 150mg/kg을 주사.
6. 코 콘 부정사 위치 (장소 최대 동시에 5 쥐)에 이미징 시스템 내부의 각 마우스에 맞게. 코 콘을 통해 이미징 동안 1%-3% (100% 산소)에서 isoflurane에 마 취를 유지 합니다.
7. 50 분 (또는 확인된 피크 생물 발광) 피크 생물 발광을 감지 하는 이미지를 마다 5 분을 캡처하십시오.
   1. 자동, 매체, Binning 및 필드의 보기 D로 발광 을 선택 합니다.
   2. 취득 은 이미지를 클릭 하십시오.
8. 그들의 cage(s)에 쥐를 반환 하 고 그들은 (단계 3.8 참조) 회복 될 때까지 그들을 감시.

6. 폐 전이 종양 부담 정량화 Ex Vivo 영상으로

참고: 폐 전이 정량화 orthotopic 접종 모두와 함께 유 방 절제술 모델 없이 적용 됩니다. 유 방 절제술 모델에서 ex vivo 영상 또는 생존 관찰 목적에 따라, 선택 됩니다. Orthotopic 접종 (절제술) 없이 모델에서 대부분의 경우 기본 종양 크기 안락사 기준 (> 2 cm) 접종 후 약 21 일 생산.

1. Ex vivo 영상에 의해 암 세포 접종 후 21 일 폐 전이성 병 변 계량.
2. Anesthetize 전용된 유도 실에서 2-4 %isoflurane 쥐 (단계 3.1 참조).
3. 쥐의 무게.
4. Intraperitoneally D 소 150 mg/kg을 주사 (단계 5.6 참조).
5. 자 궁 탈, 주사 후 15 분 여 쥐를 안락사.
6. 곡선된 메이 요가 위를 사용 하 여 중간 복 부에 피부와 복을 절단 하 여 복 부를 엽니다. 오른쪽과 왼쪽 모두에 절 개를 확장 합니다. 횡 경 막의 시각 이다; 때까지 집게와 함께 간 밖으로 끌어 그런 다음에 횡 경 막 잘라.
7. Caudad에서 양측 갈비뼈를 잘라 곡선된 메이 요가 위를 사용 하 여 (제 12 늑 골)에 cephalad 앞쪽 가슴 벽을 대칭 이동 하 여 폐를 폭로 (1 골).
8. 집게를 사용 하 여 폐를 해제 하 여 척추, 폐를 연결 코드 처럼 보이는 흉부 식도 식별 하 고, 그러면 서가 위를 사용 하 여 식도 잘라.
9. 양측 폐와 심장 집게 (견인 잡아당기는의 방향에 cephalad에 caudad 적용)을 사용 하 고, 다음, 기관 및 주요 혈관에서 폐 꼭대기 잘라 리프트는 cephalad, 서가 위를 사용 하 여.
   참고: 폐 및 심장 신체에서의 격리에 대 한 수 있습니다.
10. 서가 위를 사용 하 여 폐에서 심 혼을 제거 합니다.
11. 10 cm 배양 접시에에서 폐를 넣어.
12. 생물 발광 이미지를 캡처 (5.7.1 및 5.7.2 단계 참조) 안락사 (소 주사 후 20 분) 후 5 분.

결과

Orthotopic 모델의 목적은 인간의 암 진행 (즉, 림프절 전이 및 다음 먼 폐 전이 기본 종양의 성장)을 모방 하는¹⁵. 암 세포 접종 후는 생물 발광은 정기적으로 계량 (2 3 시간 / 주) (그림 1A). 폐에서 생물 발광 기본 병 변 보다 작은 깊은입니다. 생물 발광은 주로 라이브 마우스³ (그림 1B 및

토론

지난 10 년 동안 우리가 유 방 암 모델^{3,7,13,,1620,21}을 포함 한 여러 murine 암 모델을 수립 되었습니다. 이전에 우리가 직접 비전 유선 조직에 유 방 암 세포 orthotopic 접종^{7 수술 절 개 없이 젖꼭지 주위 세포 주입에 비해 적은 크기 가변성 ?...}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture