في الموقع تقنيات التهجين لعينات المرجان الكبار جزءا لا يتجزأ من البارافين

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو إجراء التهجين في الموقع على عينات المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. هذا أسلوب نوعية المستخدمة لتصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق معنى المضادة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين.

Abstract

الشعاب المرجانية هي اللافقاريات المحيطات الهامة ذات الأهمية الحاسمة للصحة العامة في المحيطات، فضلا عن صحة الإنسان. ومع ذلك، بسبب التأثيرات البشرية مثل ارتفاع درجات حرارة المحيطات وتحمض المحيطات، الشعاب المرجانية يتزايد تحت التهديد. للتصدي لهذه التحديات، أثبتت التطورات في الخلية والبيولوجيا الجزيئية أن تكون حاسمة بالنسبة لتشخيص صحة الشعاب المرجانية. تعديل بعض التقنيات التي يشيع استخدامها في الطب البشري يمكن أن تحسن كثيرا من قدرة الباحثين على علاج وحفظ الشعاب المرجانية. لمعالجة هذا الوضع، قد وضع بروتوكول التهجين في الموقع تستخدم أساسا في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري تطويعها للاستخدام في الشعاب المرجانية الكبار تحت الضغط.

والغرض من هذا الأسلوب هو تصور التعبير المكاني لإجراء تحقيق الجيش الملكي النيبالي في أنسجة المرجان الكبار التي تم تضمينها في البارافين ومقطوع على الشرائح الزجاجية. ويركز هذا الأسلوب على إزالة البارافين والاماهه للعينة، والمعالجة الأولية للعينة لضمان نفاذية العينة، التهجين ما قبل الحضانة، التهجين لمسبار الحمض النووي الريبي، والتصور لمسبار الحمض النووي الريبي. هذا أسلوب قوية عند استخدام الكائنات الحية غير نموذجية لاكتشاف حيث يتم التعبير عن الجينات محددة، والبروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لغيرها من الكائنات غير نموذجية. ومع ذلك، يقتصر الأسلوب في ذلك فإن النوعية في المقام الأول، نظراً لكثافة التعبير يمكن أن تختلف تبعاً لمقدار الوقت المستخدمة أثناء الخطوة التصور وتركيز التحقيق. وعلاوة على ذلك، الصبر مطلوب، كما هذا البروتوكول يمكن أن تصل إلى 5 أيام (وفي كثير من الحالات، أطول) استناداً إلى أن التحقيق يجري استخدامها. وأخيراً، تلوين الخلفية غير محددة أمر شائع، ولكن يمكن التغلب على هذا القيد.

Introduction

الشعاب المرجانية منشئي النظم الإيكولوجية الحرجة والهامة للتنوع البيولوجي في المحيطات وصحة الإنسان^1،،من²³. أنها تتعرض للتهديد بسبب تغير المناخ وغيرها من الضغوطات البشرية المنشأ، وتعتبر العديد من الأنواع المرجانية المهددة. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لأدوات الخلوية والجزيئية لتشخيص الشعاب المرجانية تحت الضغط. أيضا، هناك القليل من المعلوم حول حيث يتم التعبير عن الجينات داخل أنسجة المرجان الكبار، وذلك القليل فهم وظائف هذه الجينات. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد تكيفت في الموقع التهجين (العش) البروتوكول، يشيع استخدامها في الطب البشري وعلم الأحياء التنموي التطوري، لاستخدامها في عينات الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين المرجان الكبار. هذا الأسلوب أقوى عندما تستخدم على الشعاب المرجانية الكبار التي شهدت حدثاً ضاغطة مثل التعرض للإجهاد الحراري. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدامها على مجموعة واسعة من الأنسجة ومراحل الحياة في الشعاب المرجانية ولا يقتصر على فقط أكد الحرارة المرجان^4،،من⁶⁷. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب في أنسجة أو خلايا من أي تواليات طالما هناك كدنا تسلسل المعلومات المتاحة.

والغرض من هذا الأسلوب هو تصور تحقيقات الجيش الملكي النيبالي داخل أنسجة المرجان الكبار التي تم الحفاظ عليها وجزءاً لا يتجزأ من البارافين ومقطوع على الشرائح. هذا الأسلوب هو أداة تشخيصية قوية تسمح لتصور الأحماض النووية داخل أنسجة المرجان الكبار. وقد وضعت في البداية هذا الأسلوب للتشخيص الطبي، ومنذ ذلك الحين أصبح أداة شعبية في مجالات مثل علم الأحياء التنموي وعلم الأحياء التنموي التطوري^8،،من⁹¹⁰. ايش أيضا طريقة حاسمة، لا سيما في نظم غير نموذجية، عندما الجينوم وترانسكريبتوميك تسلسل البيانات متوفرة ولكن أنماط التعبير الجيني المكاني غير معروفة. للحصول على عمل التشخيص في نظم غير نموذجية، هذا الأسلوب قوية نظراً لأنه يمكن الإشارة إلى الخلايا والأنسجة التي التعبير عن جين للفائدة، ويمكن أن يؤدي إلى أكثر النهج العلاجية المستهدفة^8،،من^{910، 11،12}. وأخيراً، أن هذا الأسلوب النوعية وأكثر قوة عندما يقترن مع البيانات التعبير الجيني الكمي¹¹.

النهج المبين في هذه الورقة سوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستطيعون مصممة بالفعل ديجوكسيجينين (حفر)-المسمى مسبار الحمض النووي الريبي (مجسات الإحساس وأنتيسينسي على السواء)، وهي الآن جاهزة لأداء التهجين في الموقع للتحقيقات بعينه. لتنفيذ هذا الأسلوب، سوف يلزم قسمين المسلسل من الأنسجة البارافين الشعاب المرجانية لكل التحقيقات التي يجري اختبارها. سيتم استخدام مقطع واحد للتحقيق المعني وأخرى للتحقيق العقاقير. التحقيق المعني سيكون عنصر تحكم للإشارة إلى الربط غير محددة. إذا تلطيخ الملاحظ في الإحساس بالتحقيق، ثم التحقيق العقاقير ليست محددة للجيش الملكي النيبالي للفائدة. يمكن تصميم المجسات للجينات أي أعرب. تستخدم العديد من الأمثلة في هذا البروتوكول، التي تم العثور عليها قبل أن يتم التعبير عنها من خلال الإجهاد الحراري في الشعاب المرجانية: فبج osteosarcoma مورين السرطاني الفيروسية هومولوج ب (المنحدر-ب)، البروتين المنشط (AP1)، وعامل نخر الورم مستقبلات 41 (41 تنفر)¹¹. ايش استخدام المسابير المسمى حفر الجيش الملكي النيبالي المفضل على مدى استخدام المجسات الإشعاعية سبب تعاملها كثير أكثر أماناً من¹⁰. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هي حساسة للغاية ويمكن أن يؤديها على طائفة واسعة من الأنسجة والأجنة خارج الشعاب المرجانية الكبار أكد الحرارة^13،14،،من¹⁵¹⁶.

Protocol

1-إزالة البارافين

تحذير: الخطوات التالية تحت غطاء دخان.

1. دو الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين رقيقة-مقطوع بنسبة 100% زيلين نفط تحت غطاء محرك السيارة في الزجاج كوبلين الجرار لمدة 10 دقائق. لا تستخدم البلاستيك كوبلين الجرار، كما زيلين نفط يذوب البلاستيك. تعقيم الزجاجات كوبلين في اﻷوتوكﻻف قبل الاستخدام.
2. إعداد أربعة الجرار كوبلين زجاج معقمة بما يلي: الإيثانول 100%، الإيثانول 80%، 70% إيثانول والايثانول 60%. تمييع الإيثانول مع المياه خالية من رناسي.
   1. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 100% ونقع عليها لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقيقة، إفراغ جرة كوبلين الزجاج واستبدالها جديدة 100% إيثانول. نقع الشرائح مرة أخرى لمدة 10 دقائق.
   2. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 80% لمدة 1 دقيقة.
   3. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 70% لمدة 1 دقيقة.
   4. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين الزجاج العقيمة مع الإيثانول 60% لمدة 1 دقيقة.

2-المعالجة المسبقة للشرائح لإعداد التهجين مسبار الحمض النووي الريبي

1. أداء يغسل التالية في درجة حرارة الغرفة، ما لم يحدد خلاف ذلك. تنفيذ يغسل درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري بسرعة بطيئة. استخدام الشريحة العقيمة بريدية مع الغرفة لمدة تصل إلى خمس شرائح لغسل الشرائح.
2. نقل الشرائح إلى الإرسال شريحة عقيمة مع 18 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. من أجل إيقاف برنامج تلفزيوني 1 x، وعلاج الأنسجة مباشرة على الشرائح مع بروتيناز ك لتمكين المسبار اختراق الأنسجة. إضافة حوالي 18 مل من محلول بروتيناز ك للإرسال الشريحة (انظر الجدول 1 للعمل تركيز الحل). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لا يهز.
   1. بينما هي تفرخ الشرائح، إعداد المخزن المؤقت بريهيبريديزيشن (بريهيبي المخزن المؤقت). وضع المخزن المؤقت بريهيبي في حمام مائي يغلي لمدة 10 دقائق، ثم تبرد في حمام الثلج لمدة 5 دقائق. لوصفه من المخزن المؤقت بريهيبي، انظر الجدول 1.
   2. وقف الهضم من رد فعل بروتيناز ك بصب حل بروتيناز ك، وفورا إضافة 18 مل من محلول جليكاين-برنامج تلفزيوني 0.2% للإرسال الشريحة. واسمحوا الإرسال الشريحة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. من أجل حل جليكاين-برنامج تلفزيوني 0.2% وإضافة مل 18 من محلول سترات الصوديوم المالحة (SSC) x 2 لكل مرسل بريد الشريحة. يغسل الشرائح في 2 x SSC لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع الهز 100-150 لفة في الدقيقة.

3-بريهيبريديزيشن شرائح استعدادا التهجين مسبار الحمض النووي الريبي

1. في حين يجري غسلها الشرائح مع 2 x SSC، الحصول الإرسال عقيمة شريحة جديدة ووضع حوالي 18 مل بريهيبي المخزن المؤقت للإرسال الشريحة. مكان الإرسال الشريحة في الفرن التهجين في درجة حرارة التهجين.
   ملاحظة: درجة حرارة التهجين سوف تعتمد على التحقيق يجري استخدامها ولكن عادة ما يتراوح بين 50-60 درجة مئوية.
2. وبمجرد الانتهاء من الغسيل x SSC 2، صب 2 × التعاون بين بلدان الجنوب، ووضع الشرائح داخل الإرسال الشريحة في المخزن المؤقت بريهيبي في الفرن التهجين ح 1.

4-التهجين لمسبار الحمض النووي الريبي

1. بينما هي تفرخ الشرائح مع المخزن المؤقت بريهيبي في الفرن التهجين، إعداد الحل التهجين-التحقيق.
   1. تمييع التحقيق كل في التهجين المخزن المؤقت (0.5 ميليلتر للتحقيق مع 24.5 ميليلتر من التهجين المخزن المؤقت).
      ملاحظة: يتم العثور على وصفه التهجين المخزن المؤقت في الجدول 1. يمكن العثور على مثال لإعداد التحقيق وتركيزات في نولز ترايلور et al. ¹¹.
   2. وضع المسبار المخفف على كتلة حرارة 86-90 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة، ثم يبرد لمدة 1 دقيقة على الجليد.
2. قم بإزالة الإرسال الشرائح من الفرن التهجين وفردياً الشرائح من الإرسال الشريحة باستخدام ملاقط معقمة. وضع الشرائح منبسطة على منشفة ورقية، وتمحو بعناية زائدة بريهيبي العازلة حول عينات الأنسجة. يجب الحرص على عدم لمس العينات، والعمل بسرعة لمنع تجفيف عينات الأنسجة.
3. تطويق الأنسجة بقلم PAP. تطبيق 25 ميليلتر الحل مسبار المخفف مع ماصة وتغطي العينة مع ساترة بلاستيك.
   1. وضع العينات في الدائرة الرطوبة الشريحة مع 4 × SSC + 50% ميثلامين الحل في الجزء السفلي من الدائرة.
   2. حالما تتم إضافة مجسات لكافة الشرائح، ضع دائرة الرطوبة الشريحة في الفرن التهجين لمالا يقل عن 24 ساعة عند درجة حرارة تهجين من 50-60 درجة مئوية. فترة حضانة المرض يمكن أن تختلف تبعاً لتركيز التحقيق ولكن يجب أن يكون لمدة 24 ساعة على الأقل.
4. بعد الحصول على الحضانة بين عشية وضحاها مع تحقيقات المخفف، إزالة الدائرة رطوبة الشرائح من الفرن التهجين.
   1. إزالة كوفيرسليبس من كل الشرائح، مع الحرص على عدم تشريد الأنسجة. في ماصة 1000 ميليلتر، إضافة 1000 ميليلتر من 2 x SSC الحل ولطف يغسل الشريحة.
   2. ضع الشريحة في الإرسال شريحة عقيمة مع 18 من مل من محلول x SSC 2 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. من أجل الخروج الحل واستبدالها ب 18 مل 2 جديدة x SSC. كرر في الحضانة مرة أخرى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
   3. من أجل حل x SSC 2. إضافة مل 18 1 حل x SSC والمياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. من أجل حل x SSC 1 واستبدله 18 مل 1 جديدة x SSC. كرر في الحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
   4. صب 1 x SSC. إضافة 18 مل 0.5 × التعاون بين بلدان الجنوب، والمياه والصرف الصحي لمدة 10 دقائق في 42 درجة مئوية دون المصافحة. صب 0.5 x SSC واستبدال فإنه مع 18 مل 0.5 الطازجة x SSC. أغسل مرة أخرى لمدة 10 دقائق في 42 درجة مئوية دون المصافحة.

5-التصور من مسبار الحمض النووي الريبي

ملاحظة: لتصور التحقيق، سيتم استخدام الأرجواني BM خلال عملية التنمية. ومع ذلك، قبل هذه الخطوة، يغسل عدة مطلوبة لإعداد العينات لتلطيخ.

1. يغسل الشرائح مع 18 مل من المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوي (AP-المخزن المؤقت) دون مجكل₂ ل 1 دقيقة صب AP-المخزن المؤقت دون مجكل₂، وإضافة 18 مل من س 1 بورينجر مانهايم حظر المخزن المخفف مع المخزن المؤقت لحمض الماليك. احتضانها لعلى الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الإرسال شريحة مع الهز لطيف.
   ملاحظة: premade بورينجر مانهايم حظر المخزن المؤقت وحمض الماليك المخزن المؤقت المستخدم والتي تم شراؤها في حفر المياه والصرف الصحي وتعيين المخزن المؤقت كتلة (متاح تجارياً).
   1. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يؤديها الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. سوف يقلل من فترة أطول حظر ظهور الربط غير محددة.
2. إعداد 20 مل المخفف حفر المضادة-ديجوكسيجينين-AP القوات المسلحة البوروندية الشظايا (الأجسام المضادة حفر = 2 ميليلتر من الأجسام المضادة حفر + 20 مل 1 × بورينجر مانهايم حظر المخزن المؤقت). وهذا ما يكفي لاستخدامها في 1 الشريحة البلاستيكية الإرسال. يجب أن يكون مستعدا أكثر من هذا الحل إذا كان يمكن استخدام الإرسال شريحة واحدة أو أكثر.
3. إضافة الأجسام المضادة حفر الإرسال عقيمة شريحة جديدة، ونقل الشرائح إلى الإرسال الشريحة مع الحل حفر المضادة الأجسام المضادة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 3 مع الهز لطيف.
4. وبعد الحضانة، صب الأجسام المضادة حفر ويغسل الشرائح في الإرسال الشريحة مع 18 مل من AP-المخزن المؤقت دون مجكل₂ لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
5. صب AP-المخزن المؤقت دون مجكل_2، وإضافة 18 مل من AP-المخزن المؤقت. المياه والصرف الصحي لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف. بعد الاحتضان 5 دقيقة، من أجل إيقاف AP-المخزن المؤقت واستبدله مع 18 مل الطازجة AP-المخزن المؤقت ويغسل لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
6. في الظلام، وصب AP-المخزن المؤقت وإضافة 18 مل BM الأرجواني للإرسال الشريحة. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام، والتحقق من وضع اللون الأرجواني سوف تختلف كل مرة رد فعل ½ h. للتصور استناداً إلى التحقيق الذي يجري.
   ملاحظة: بدلاً من التصور BM الأرجواني، وتطوير الحل يمكن باستخدام 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (بسب) وتيترازوليوم نيترو الأزرق (NBT). انظر الجدول 1 للحصول على إرشادات.
7. وقف التنمية اللون بنقل الشرائح إلى الإرسال عقيمة شريحة جديدة مع 18 مل من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
8. من أجل إيقاف المخزن المؤقت الشركة المصرية للاتصالات وإضافة 18 مل مياه خالية من رناسي للإرسال الشريحة والغسيل لمدة 1 دقيقة، في الظلام.
9. إزالة الشرائح من الماء، وتجف لهم حول حواف الأنسجة. إضافة والغليسيرول تصاعد المتوسطة ووضع في كوفيرسليبس. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية حتى الصور على استعداد لاتخاذها.

النتائج

بعد الانتهاء من هذا البروتوكول، وسيتم تحقيق تحديد الخلايا والأنسجة التي تعرب عن مسبار الحمض النووي الريبي للفائدة. نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول لوكالة اسوشييتد برس-1 وفوسب و TNFR41. هذه النتائج، التي نشرتها سابقا نولز ترايلور et al. ¹¹، يسبر إظهار التعبير ال...

Discussion

لقد تم تعديل الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول من الأعمال السابقة في البحوث الطبية والتطوري التنموي^8،9،10،،من¹²¹⁷. هذا البروتوكول يركز على الفروق الدقيقة في التهجين في الموقع مع تحقيق معنى المضا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Denhardt's solution	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
Slide mailers	Fisher	12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon tubes	Fisher	14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Invitrogen	AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
Slide white apex superior adhesive	Leica Biosystems	3800080
PBS solution, pH 7.4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use	VWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE buffer	VWR	PAV6232
hybridization oven	VWR	97005-252, 97005-254
Orbital shaker	VWR	89032-088