בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

Abstract

אלמוגים הם אוקיינוס חשוב חסרי חוליות קריטית לבריאות הכללית של האוקיינוס, כמו גם בריאות האדם. עם זאת, בשל בהשפעה האנושית כגון עליית הטמפרטורות התחמצות, אלמוגים הם יותר ויותר תחת איום. כדי להתמודד עם האתגרים הללו, ההתקדמות התא וביולוגיה מולקולרית הוכיחו להיות חיונית לאבחון הבריאות של אלמוגים. שינוי כמה מן הטכניקות הנפוצות ברפואה האנושית יכולה לשפר באופן ניכר של חוקרים היכולת לטפל ולשמור אלמוגים. כדי לטפל בבעיה זו, עבור בחיי עיר הכלאה בעיקר בשימוש ברפואה האנושית וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית פרוטוקול כבר מותאם לשימוש באלמוגים למבוגרים תחת לחץ.

מטרת שיטה זו היא להמחיש את הביטוי המרחבי של בדיקה RNA ברקמת האלמוג למבוגרים יש כבר מוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. שיטה זו מתמקדת הסרת פרפין, התייבשות של המדגם, רעלני לדוגמה כדי להבטיח חדירות של המדגם, הכלאה קדם דגירה, הכלאה של המכשיר RNA, הפריט החזותי של המכשיר RNA. זוהי שיטה חזקה בעת שימוש אורגניזמים שאינם-דגם לגלות שבו באים לידי ביטוי גנים ספציפיים, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות עבור אורגניזמים אחרים שאינם-מודל. עם זאת, השיטה זו מוגבלת כי זהו בעיקר איכותיים, כי עוצמת הביטוי יכול להשתנות בהתאם כמות הזמן בשימוש במהלך השלב חזותי וריכוז של המכשיר. יתר על כן, סבלנות נדרשת, כמו פרוטוקול זה יכול לקחת עד 5 ימים (וגם במקרים רבים, ארוכים יותר) בהתאם המכשיר בשימוש. לבסוף, צביעת הרקע שאינם ספציפיים שכיחה, אך ניתן להתגבר על מגבלה זו.

Introduction

האלמוגים הם בוני המערכת האקולוגית קריטי וחשוב עבור מגוון ביולוגי האוקיינוס ובריאות האדם-^1,-^2,-³. הם תחת איום בשל שינויי האקלים ואת שאר גורמי אנתרופוגניים, אלמוג מינים רבים נחשבים בסכנת הכחדה חמורה. לפיכך, יש צורך בכלים תאית ומולקולרית לאבחן אלמוגים תחת לחץ משמעותי. בנוסף, יש קצת מובנת על שבו גנים מבוטאים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים, ולכן מעט הבנה של הפונקציות של גנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו הסתגלו בחיי עיר הכלאה (איש) הפרוטוקול, נפוץ האנושי רפואה וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, לשימוש על דגימות רקמה פרפין-מוטבע של אלמוגים למבוגרים. טכניקה זו היא עוצמתי ביותר כאשר משתמשים באלמוגים מבוגרים שעברו אירוע מלחיץ כגון חשיפה עומס חום. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של רקמות, שלבי החיים באלמוגים, אינה מוגבלת רק אלמוגים הדגיש חום^4,6,7. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו על רקמות או תאים של כל metazoan כל עוד יש cDNA רצף מידע זמין.

מטרת שיטה זו היא להמחיש RNA הגששים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים יש כבר נשמר, המוטבעות פרפין, למחלקה על שקופיות. שיטה זו היא כלי אבחון רב עוצמה המאפשר הפריט החזותי של חומצות גרעין בתוך רקמת האלמוג למבוגרים. בתחילה שיטה זו פותחה עבור אבחון רפואי, זה ומאז הפך להיות כלי פופולרי בתחומים כגון ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה אבולוציונית התפתחותית^8,9,10. איש גם שיטה קריטי, במיוחד במערכות שאינן-דגם, כאשר גנומית, transcriptomic רצף נתונים זמינים אך דפוסי ביטוי מרחבי הגן אינם ידועים. לעבודה האבחון במערכות שאינן-דגם, טכניקה זו היא חזקה כי זה יכול לציין אילו תאים ורקמות אקספרס הגן עניין והוא יכול להוביל יותר ממוקד גישות טיפוליות^{8,9,10, 11,12}. לבסוף, טכניקה זו היא חזקה יותר כאשר יחד עם נתונים של ביטוי כמותי ג'ין¹¹וכמותיים.

הגישה המתוארים במאמר זה יהיה עניין החוקרים כבר עיצבו את digoxigenin (מחדירים)-הנקרא RNA בדיקה (הגיוני והן antisense הגששים) והם עכשיו מוכן לבצע בחיי עיר הכלאה של הגששים מדגם. כדי לבצע בשיטה זו, יהיה צורך שני מקטעי רקמה פרפין אלמוג טורי עבור כל בדיקה הנבדקת. מקטע אחד ישמש עבור המכשיר הגיוני והשני עבור המכשיר antisense. החללית הגיוני יהיה פקד כדי לציין מחייב שאינם ספציפיים. אם צביעת הוא ציין את הגשוש הגיוני, ואז המכשיר antisense אינה ספציפית הרנ א עניין. הגששים יכולים מיועד לכל הגן בא לידי ביטוי. פרוטוקול זה, מספר דוגמאות משמשים שנמצאו קודם לכן לבוא לידי ביטוי במהלך עומס חום באלמוגים: FBJ אוסטאוסרקומה מאתר אונקוגן ויראלי homolog B (פוס-B), מפעיל חלבון (AP1), גידול נקרוזה מקדם קולטן 41 (TNFR 41)¹¹. איש באמצעות התווית על-ידי החפירה RNA הגששים היא עדיפה על שימוש רדיואקטיבי הגששים כי הטיפול הוא הרבה יותר בטוח¹⁰. בנוסף, טכניקה זו היא רגישה מאוד, ניתן לבצע מגוון רחב של רקמות העוברים מעבר חום הדגיש אלמוגים למבוגרים^13,14,15,16.

Protocol

1. הסרת פרפין

שים לב: בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume.

1. Dewax דק-למחלקה פרפין-מוטבע השקופיות. עם 100% קסילן מתחת למכסה המנוע בצנצנות זכוכית Coplin למשך 10 דקות. אל תשתמש/י צנצנות פלסטיק Coplin, כפי קסילן נמס פלסטיק. לעקר את הצנצנות Coplin ב החיטוי לפני השימוש.
2. הכינו ארבע צנצנות זכוכית סטריליים Coplin את הפעולות הבאות: אתנול 100%, 80% אתנול, אתנול 70% ו-60% אתנול. לדלל האתנול עם RNase ללא מים.
   1. להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 100% אתנול, להשרות אותם למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לרוקן את צנצנת הזכוכית Coplin והחלף חדש 100% אתנול. משרים את השקופיות שוב למשך 10 דקות.
   2. להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 80% אתנול עבור 1 דקות.
   3. להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם אתנול 70% עבור 1 דקות.
   4. להעביר את השקופיות הצנצנת Coplin זכוכית סטריליים עם 60% אתנול עבור 1 דקות.

2. רעלני של שקופיות עבור הכנה של RNA בדיקה הכלאה

1. לבצע את מנקי הבאים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. מבצע בטמפרטורת החדר-מנקי תפקודי לב / נשימה במהירות איטית. להשתמש את פרסומי שקופית סטרילי עם חדר עבור שקופיות עד חמישה לשטיפת מכוניות של השקופיות.
2. להעביר את השקופיות למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). לרחוץ למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. יוצקים את מגניב 1 x, ולטפל באופן מיידי הרקמה בשקופיות עם proteinase K כדי לאפשר חדירה בדיקה של הרקמה. להוסיף כ 18 מ של proteinase K פתרון מיילר שקופית (ראה טבלה 1 לעבודה פתרון ריכוז). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. אל תלחץ.
   1. בזמן, השקופיות הן המקננת להכין מאגר prehybridization (מאגר Prehybe). למקם את המאגר Prehybe באמבט מים רותחים למשך 10 דקות ולאחר מכן מגניב על אמבטיית קרח למשך 5 דקות. לקבלת מתכון של מאגר Prehybe, ראה טבלה 1.
   2. העיכול של התגובה proteinase K שמוציא את הפתרון proteinase K, ולקבל מיד להוסיף 18 מ של 0.2% גליצין-PBS פתרון מיילר שקופיות. תן את מיילר שקופית לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   3. שופכים את הפתרון גליצין-PBS 0.2% ולהוסיף mL 18 בפתרון נתרן מלוחים ציטראט (האס) 2 x מיילר כל שקופית. לשטוף את השקופיות 2 x SSC 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם רועדת במהירות של 100-150 סל ד.

3. prehybridization של שקופיות לקראת בדיקה RNA הכלאה

1. בזמן שהשקופיות להיות נשטפים עם 2 x SSC, להשיג למבוטחים סטרילי שקופית חדשה ולשים כ 18 מ של מאגר Prehybe לתוך מיילר שקופיות. מקם את מיילר שקופיות לתוך התנור הכלאה בטמפרטורת הכלאה.
   הערה: הטמפרטורה הכלאה תלויות המכשיר בשימוש אבל בדרך כלל נע בין 50-60 מעלות צלזיוס.
2. עם סיום לשטוף את x SSC 2, שופכים את 2 x האס, והמקום השקופיות בתוך מיילר שקופית במאגר Prehybe בתנור הכלאה לשעה.

4. הכלאה של המכשיר RNA

1. בעוד השקופיות הן המקננת עם המאגר Prehybe בתנור הכלאה, להכין פתרון הכלאה-בדיקה.
   1. לדלל כל בדיקה במאגר הכלאה (0.5 µL של בדיקה עם µL 24.5 הכלאה מאגר).
      הערה: המתכון הכלאה המאגר נמצא בטבלה 1. דוגמה של ריכוז והכנה של המכשיר ניתן למצוא טריילור-נואלס. et al. ¹¹.
   2. למקם את המכשיר מדולל בבלוק חום 86-90 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות, ואז להתקרר למשך 1 דקות על קרח.
2. להסיר את מיילר שקופית מהתנור הכלאה ולהסיר באופן אינדיבידואלי שקופיות מיילר שקופיות באמצעות פינצטה סטרילי. להניח את השקופיות על מגבת נייר, בזהירות. תנגב את מאגר עודף Prehybe סביב דגימות רקמה. להיזהר לא לגעת הדגימות, ועבודה במהירות כדי למנוע התייבשות דגימות רקמה.
3. להקיף את הרקמה עם עט PAP. להחיל µL 25 בפתרון בדיקה מדולל עם פיפטה ולכסות את הדגימה עם coverslip פלסטיק.
   1. מקם את הדגימות בבית הבליעה לחות שקופיות עם 4 x האס + 50% פתרון formamide בחלק התחתון של החדר.
   2. ברגע הגששים נוספו כל השקופיות, מקום תא לחות שקופיות לתוך התנור הכלאה לפחות 24 שעות בטמפרטורה הכלאה של 50-60 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה יכולה להשתנות בהתאם הריכוז של המכשיר, אבל צריך להיות מינימום של 24 שעות.
4. לאחר דגירה לילה עם הגששים מדולל, להסיר תא לחות שקופית מהתנור הכלאה.
   1. הסר כל אחת מהשקופיות, נזהר לא לעקור את רקמת coverslips. פיפטה µL 1000, להוסיף 1000 µL של פתרון x SSC 2, בעדינות לשטוף את השקופית.
   2. מקם את השקופית למבוטחים שקופית סטרילי עם 18 מ של x SSC 2, לפתרון 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון ולהחליף אותו עם 18 מיליליטר 2 טריים x SSC. חזור על הדגירה שוב עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
   3. יוצקים את הפתרון x SSC 2. להוסיף 18 מ של 1 x SSC פתרון ושטוף במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שופכים את הפתרון x SSC 1 ולהחליף אותו עם 18 מ ל 1 טרי x SSC. חזור על הדגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
   4. שופכים את 1 x SSC. להוסיף מ 18 ל 0.5 x האס ושטוף במשך 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד. שופכים את 0.5 x האס והחלף אותו עם 18 מ של 0.5 טרי x SSC. לשטוף שוב 10 דקות ב 42 ° C ללא רועד.

5. ויזואליזציה של המכשיר RNA

הערה: המדגימה את החללית, מוניטור סגול ייעשה שימוש בתהליך הפיתוח. עם זאת, לפני שלב זה, מספר שוטף נדרשים להכין את הדגימות מכתים.

1. לשטוף את השקופיות 18 מ ל מאגר phosphatase אלקליין (AP-מאגר) ללא MgCl₂ ב 1 מינימלית שופכים AP-למאגר מבלי MgCl₂, ולהוסיף mL 18 1 x Boehringer-מנהיים חסימה מאגר מדולל עם חומצה maleic מאגר. תקופת דגירה של פחות שעה בטמפרטורת החדר למבוטחים שקופיות עם טלטול עדין.
   הערה: מאגר חסימה Boehringer-מנהיים ומאגר חומצה maleic השתמשו היו premade ורכש החפירה לשטוף, להגדיר מאגר בלוק (זמין מסחרית).
   1. לחלופין, ניתן לבצע הדגירה למשך הלילה ב 4 ° C. תקופה עוד חסימה יעמעם את המראה של איגוד שאינם ספציפיים.
2. להכין mL 20 של קטעים Fab anti-digoxigenin-AP החפירה מדולל (נוגדן אנטי החפירה = 2 µL של נוגדן אנטי החפירה + 20 מ ל 1 x מאגר חסימה Boehringer-מנהיים). זה מספיק לשימוש במיילר פלסטיק שקופית 1 יותר של פתרון זה חייב להיות מוכן אם אחד או יותר מיילר שקופית כדי לשמש.
3. מוסיפים נוגדן אנטי החפירה למבוטחים סטרילי שקופית חדשה, להעביר את השקופיות מיילר שקופיות עם הפתרון נוגדן אנטי החפירה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות עם טלטול עדין.
4. לאחר דגירה, שופכים הנוגדן אנטי החפירה ולשטוף את השקופיות ב מיילר שקופית 18 מ ל AP-מאגר ללא MgCl₂ עבור חמש דקות עם טלטול עדין.
5. שופכים את AP-המאגר ללא MgCl_2, ולהוסיף מ 18 ל AP-Buffer. רחץ במשך חמש דקות עם טלטול עדין. לאחר 5 דקות הדגירה, יוצקים את המאגר AP, להחליף אותו עם 18 מ ל AP טריים-מאגר, לשטוף במשך חמש דקות עם טלטול עדין.
6. בחושך, שופכים את AP-המאגר ולהוסיף 18 מ של מוניטור סגול מיילר שקופיות. דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר בחושך, בדיקת לפיתוח צבע סגול שכל זמני התגובה ה ½ להמחשת ישתנו בהתבסס על החללית זה מפותח.
   הערה: במקום מוניטור סגול ויזואליזציה, פיתוח פתרון יכול להתבצע באמצעות 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ו- tetrazolium ניטרו כחול (NBT). לקבלת הוראות, ראה טבלה 1 .
7. לעצור התפתחות צבע על ידי העברת השקופיות למבוטחים סטרילי שקופית חדשה עם mL 18 טריס-EDTA (TE) המאגר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
8. יוצקים את המאגר טה ולהוסיף 18 מיליליטר מים נטולי RNase מיילר שקופיות ו בשביל 1 דקות, בחושך.
9. הסר את השקופיות מן המים, לייבש אותם בקצוות של הרקמה. להוסיף גליצרול הרכבה בינונית ומניחים על coverslips. אחסן את השקופיות ב 4 ° C עד תמונות מוכן לקחת.

תוצאות

לאחר השלמת פרוטוקול זה, זיהוי של תאים ורקמות כי הם ביטוי החללית RNA עניין תושג. התוצאות נציג עבור פרוטוקול זה מיועדות AP-1, FosB ו- TNFR41. התוצאות, שפורסמו קודם לכן על ידי טריילור-נואלס. et al. ¹¹, הצג ביטוי מרחבי של RNA רגשים על אלמוגים למבוגרים זה נחשפו עומס חום. שתי דו...

Discussion

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה השתנה מהעבודה הקודמת מחקר התפתחותי רפואי ואבולוציוני^8,9,10,12,17. פרוטוקול זה מתמקד הניואנסים של הכלאה בחיי עיר גשש אנטי-תחושה RNA התווית על-ידי לחפור על מבוגרים אלמוגים, א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Denhardt's solution	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
Slide mailers	Fisher	12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon tubes	Fisher	14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Invitrogen	AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
Slide white apex superior adhesive	Leica Biosystems	3800080
PBS solution, pH 7.4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use	VWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE buffer	VWR	PAV6232
hybridization oven	VWR	97005-252, 97005-254
Orbital shaker	VWR	89032-088