JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в выполнить в situ гибридизация на взрослых коралловые образцы, которые заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Это качественный метод, используемый для визуализации пространственное выражение смысл борьбы с зонд РНК в парафин врезанных тканей.

Аннотация

Кораллы являются важные Морские беспозвоночные, которые имеют решающее значение для общего здоровья океана, а также здоровья человека. Однако из-за воздействия человека, таких, как повышение температуры океана и окисление океана, кораллы все чаще оказываются под угрозой. Для решения этих проблем, прогресс в клеточной и молекулярной биологии доказали исключительно важное значение для диагностики здоровья кораллов. Изменив некоторые из методов, обычно используемых в человеческой медицине может значительно улучшить исследователей возможности лечения и сохранения кораллов. Для решения этой проблемы, протокол в situ гибридизация используется главным образом в человеческой медицине и эволюционной биологии развития был адаптирован для использования в взрослых кораллы стрессу.

Этот метод предназначен для визуализации пространственное выражение РНК зонда в взрослых коралловые ткани, заливали в парафин и секционного на стеклянных вставках. Этот метод фокусируется на удаление парафина и регидратации образца, подготовка образца для обеспечения проницаемость образца, предварительно гибридизации инкубации, гибридизация зонда РНК и визуализация РНК зонда. Это мощный метод при использовании не модельные организмы обнаружить конкретные гены выражены, где протокол может быть легко адаптирована для других организмов-модель. Однако метод является ограниченным в том, что это прежде всего качественные, потому что выражения интенсивности может варьироваться в зависимости от количества времени, во время этапа визуализации и концентрация зонда. Кроме того требуется терпение, как этот протокол может занять до 5 дней (и во многих случаях дольше) в зависимости от используемого зонда. Наконец фон неспецифичный пятнать является общим, но это ограничение можно преодолеть.

Введение

Кораллы являются строители критических экосистем и важное значение для биоразнообразия в океане и здоровья человека1,2,3. Они находятся под угрозой из-за изменения климата и других антропогенных факторов стресса, и многих видов кораллов, считаются в критическом состоянии. Таким образом существует значительная потребность в клеточном и молекулярном инструменты для диагностики кораллов в состоянии стресса. Кроме того существует мало понято о где гены выражены в взрослых коралловые ткани и поэтому мало понимания функции этих генов. Для решения этой проблемы, мы адаптировали в situ гибридизация (ISH) протокол, широко используется в медицине и эволюционной биологии развития, для использования на образцах парафин врезанных тканей взрослого кораллов. Этот метод является наиболее мощным средством, когда используются на взрослых кораллов, которые пережили стрессовые события, например воздействия теплового стресса. Однако этот метод может быть использован на широкий спектр тканей и этапов жизни в кораллов и не ограничивается только тепло подчеркнул кораллы4,6,7. Кроме того этот метод может использоваться на ткани или клетки любого многоклеточные, пока существует cDNA последовательности информации.

Этот метод предназначен для визуализации РНК зондов в взрослых коралловые ткани, которая была сохранена и заливали в парафин и секционного на слайды. Этот метод является мощный диагностический инструмент, который позволяет для визуализации нуклеиновых кислот в взрослых коралловые ткани. Первоначально этот метод был разработан для медицинской диагностики, и с тех пор она стала популярным инструментом в таких областях, как биология развития и эволюционной биологии развития8,9,10. ISH также критического метода, особенно в системах-модель, когда геномных и транскриптомики последовательность данных доступны но картин выражения гена пространственных неизвестны. Для диагностики работы в системах-модели этот метод является мощным, поскольку он может указать, какие клетки и ткани Экспресс ген интереса и может привести к более целенаправленной терапевтические подходы8,9,10, 11,12. Наконец этот метод качественных и более мощным, когда в паре с количественный ген выражение данных11.

Подход, изложенный в настоящем документе будет представлять интерес для исследователей, которые уже разработали digoxigenin (DIG)-помечены РНК зонд (смысл и antisense зонды) и являются теперь готовы выполнить в situ Гибридизация зондов для образца. Для выполнения этого метода, два последовательных секций коралловые парафин ткани будет необходимо для каждого зонда тестируется. Одна секция будет использоваться для чувство зонд и другой для антисмысловых зонд. Зонд смысле будет элемент управления для указания привязки неспецифические. Если окрашивание наблюдается в смысле зонд, антисмысловых зонд не специфичные для РНК интерес. Датчики могут быть разработаны для любого гена выразил. В настоящем Протоколе, которые были ранее признаны будут выражены в ходе тепловой стресс в кораллы используются несколько примеров: FBJ мышиных остеосаркома вирусного онкогена гомолога (Fos-Б), протеин активатор (ДП-1) и фактор некроза опухоли рецепторов 41 (TNFR 41)11. ИШ, с использованием зондов DIG-меченых РНК является предпочтительным по сравнению с использованием радиоактивных зонды, потому что их обработка гораздо безопаснее10. Кроме того этот метод очень чувствительна и может быть выполнена на широкий спектр тканей и эмбрионов за тепло подчеркнул взрослых кораллы13,14,,1516.

протокол

1. Удаление парафина

Предупреждение: Выполните следующие действия под вытяжного шкафа.

  1. DEWAX слайды тонкий секционного парафин врезанных с 100% ксилола под капот в стеклянных банках Coplin за 10 мин. Не используйте пластиковые баночки Coplin, как Ксилол расплавов пластика. Стерилизуйте банки Coplin в автоклаве перед использованием.
  2. Подготовка четырех стерильные стеклянные банки Coplin следующим: 100% этанола, 80% этанола, этанол 70% и 60% этанола. Разбавьте этанола с РНКазы свободной воды.
    1. Перенести слайды в стерильную стеклянную банку Coplin с 100% этанола и замочить их на 10 мин. После 10 минут пустые опарник Coplin стекла и заменить на новые 100% этанола. Замочите слайды снова за 10 мин.
    2. Перенести слайды опарник Coplin стерильных стеклянных с 80% этанола за 1 мин.
    3. Перенести слайды в стерильную колбу Coplin с 70% этанола за 1 мин.
    4. Перенести слайды опарник Coplin стерильных стеклянных с 60% этанола за 1 мин.

2. Подготовка слайдов для подготовки РНК зонд гибридизации

  1. Выполните следующие смывки при комнатной температуре, если не указано иное. Выполните комнатной температуре моет на орбитальный шейкер на медленной скорости. Используйте стерильные слайд конверты с комнатой для до пяти слайды для мытья слайды.
  2. Передавать слайды стерильных слайд Мейлер с 18 мл 1 x-фосфатный буфер (PBS). Мыть в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Слить ПБС и немедленно лечить ткани на слайдах с протеиназы K чтобы зонд проникновения ткани. Добавить примерно 18 мл раствора протеиназы K слайд Мейлер (см. таблицу 1 для работы концентрация раствора). Инкубируйте при 37 ° C 15 мин. Не трясите.
    1. В то время как инкубировать слайды, подготовьте prehybridization буферу (Prehybe). Место Prehybe буфер в кипящей водяной бане 10 минут, а затем охладить на ледяной бане на 5 мин. Рецепт Prehybe буфера см. таблицу 1.
    2. Остановить пищеварение протеиназы K реакции, наливая раствор протеиназы K и сразу же добавить 18 мл 0,2% раствора глицина PBS в почтовой программе слайд. Пусть слайд Мейлер постоять 5 мин при комнатной температуре.
    3. Вылейте 0,2% раствор глицина PBS и добавьте 18 мл раствора соли натрия цитрат (SSC) 2 x каждый слайд mailer. Вымойте слайды в 2 x SSC 10 мин при комнатной температуре, с встряхивания на 100-150 об/мин.

3. prehybridization слайдов в рамках подготовки к РНК зонд гибридизации

  1. В то время как слайды промывают 2 x SSC, получить новую стерильную слайд почтовой и положить примерно 18 мл Prehybe буфера в почтовой программе слайд. Поместите слайд Мейлер в печь гибридизации Гибридизация температуре.
    Примечание: Гибридизации температура будет зависеть от зонда используется но обычно колеблется от 50-60 ° C.
  2. После завершения 2 x SSC вымыть, залить 2 x SSC и место слайды в рамках почтовой слайда в буфер Prehybe в печь гибридизации за 1 ч.

4. гибридизация зонда РНК

  1. В то время как слайды инкубации с Prehybe буфер в печь гибридизации, приготовляют раствор гибридизация зонда.
    1. Разбавьте каждый зонд гибридизации буфера (0.5 мкл с 24,5 мкл буфера гибридизации зонда).
      Примечание: Рецепт для гибридизации буфера содержится в таблице 1. Пример подготовка зонда и концентрации можно найти в Traylor-Ноулз и др. 11.
    2. Место разреженных зонд на блок тепла 86-90 ° C для 12 мин, а затем охладить в течение 1 мин на льду.
  2. Удалить слайд mailer из духовки гибридизации и индивидуально удалять слайды от mailer слайд, с использованием стерильных пинцетов. Положите слайды плашмя на бумажное полотенце и тщательно вытрите избыток Prehybe буфера вокруг образцы тканей. Будьте осторожны, чтобы не коснуться образцы и работать быстро, чтобы предотвратить высыхание образцов ткани.
  3. Окружить ткани с ручкой PAP. Применить 25 мкл разбавленного зонд раствора с пипеткой и охватывают образца с пластиковой coverslip.
    1. Поместите образцы в зале влаги слайд с 4 x SSC + 50% формамида раствора в нижней части камеры.
    2. После того, как датчики были добавлены ко всем слайдам, место в камеру влаги слайд в печь гибридизации для по крайней мере 24 часа при температуре гибридизации 50-60 ° C. Время инкубации может варьироваться в зависимости от концентрации зонда, но должен быть минимум 24 часа.
  4. После ночи инкубации с разбавленным зонды снимите камеру влаги слайд из духовки гибридизации.
    1. Удалите coverslips из каждого из слайдов, соблюдая осторожность, чтобы не вытеснять в ткани. В 1000 мкл пипетки 1000 мкл раствора 2 x SSC и аккуратно смойте слайд.
    2. Место слайда в стерильных слайд почтовой с 18 мл раствора 2 x SSC 5 минут при комнатной температуре. Вылейте раствор и заменить его с 18 мл свежего 2 x SSC. Повторите инкубации за 5 мин при комнатной температуре с нежным встряхивания.
    3. Слить 2 раствор x SSC. Добавьте 18 мл 1 x SSC раствора и мыть за 5 мин при комнатной температуре. Слить раствор 1 x SSC и заменить ее с 18 мл свежего 1 x SSC. Повторите инкубации за 5 мин при комнатной температуре с нежным встряхивания.
    4. Вылейте 1 x SSC. Добавьте 18 мл 0,5 x SSC и мыть за 10 мин при 42 ° C без встряхивания. Залить 0,5 x SSC и заменить его с 18 мл свежего 0,5 x SSC. Снова вымыть за 10 мин при 42 ° C без встряхивания.

5. Визуализация РНК зонд

Примечание: Для визуализации зонд, BM фиолетовый будет использоваться в процессе разработки. Однако прежде чем этот шаг, несколько моек обязаны подготовить образцы для окрашивания.

  1. Вымойте слайды с 18 мл щелочной фосфатазы (AP-буферу) без MgCl2 за 1 мин излить AP-буфера без MgCl2и добавить 18 мл 1 x блокировки буфера Boehringer-Мангейм разбавляют буфером малеиновой кислоты. Инкубируйте по крайней мере 1 ч при комнатной температуре в почтовой слайд с нежным встряхивания.
    Примечание: Boehringer-Мангейм блокирующий буфер малеиновой кислоты буфер, используемый преждевременный и были приобретены в DIG мыть и набора блоков буфера (имеющиеся коммерчески).
    1. Кроме того инкубации на ночь при 4 ° C может быть выполнена. Больше блокирующий период будет уменьшить проявления неспецифической привязки.
  2. Подготовка 20 мл разбавленной DIG анти digoxigenin-AP Fab фрагментов (антитела анти КОПАТЬ = 2 мкл антител анти КОПАТЬ + 20 мл 1 x Boehringer-Мангейм блокирующий буфер). Это достаточно для использования в 1 почтовой пластиковых слайдов. Больше этого решения должны быть готовы, если более чем один слайд почтовая программа будет использоваться.
  3. Добавление новой почтовой стерильные слайд антитела анти КОПАТЬ и передавать слайды слайд Мейлер с раствор антител анти КОПАТЬ. Инкубации при комнатной температуре 3 h с нежным встряхивания.
  4. После инкубации слейте антитела анти КОПАТЬ и мыть слайды в почтовой слайд с 18 мл AP-буфера без MgCl2 для 5 мин с нежным встряхивания.
  5. Вылейте в AP-буфер без MgCl2 и добавить 18 мл AP-буфера. Мыть за 5 мин с нежным встряхивания. После 5 минут инкубации слить AP-буфер, заменить его с 18 мл свежего AP-буфера и мыть за 5 мин с нежным встряхивания.
  6. В темноте вылейте AP-буфера и добавьте 18 мл BM фиолетовый слайд mailer. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в темноте, проверка для развития фиолетовый цвет, который будет меняться каждые ½ ч. время реакции для визуализации на основе зонд, который в настоящее время разрабатывается.
    Примечание: Вместо визуализация BM фиолетовый, разработка решения можно с помощью 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (ПКВП) и нитро синий tetrazolium (НБТ). Инструкции смотрите в таблице 1 .
  7. Остановите развитие цвета путем передачи слайдов на новой почтовой стерильные слайд с 18 мл буфера Tris-ЭДТА (TE) за 5 мин при комнатной температуре, в темноте.
  8. Слейте буфер TE и добавьте 18 мл РНКазы свободной воды слайд почтовой и мыть за 1 мин., в темноте.
  9. Удалите слайды из воды и высушите их вокруг краев ткани. Добавьте глицерин монтажа средних и место coverslips. Храните слайды при температуре 4 ° C, пока не готовы принимать фотографии.

Результаты

После завершения этого протокола, будет достигаться идентификации клеток и тканей, которые выражают РНК зонд интерес. Представитель результаты для этого протокола являются для AP-1, FosB и TNFR41. Эти результаты, ранее опубликованные Traylor-Ноулз и др. 11, показ...

Обсуждение

Метод, описанный в настоящем протоколе был изменен с предыдущей работы в медицинских и эволюционного развития исследований8,9,10,12,17. Этот протокол посвящен нюансы в situ гибридизация с DIG-меченых ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансировалась премии нет. ВВЦ-1323652 через no.1012629 национальной науки фонд океана науки докторской стипендии и премии от Берроуз Уэллком фонда докторской программы обогащения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Denhardt's solutionAffymetrix70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase bufferFisher50-198-724
Slide mailersFisher12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase bufferFisher50-198-724
50 mL Falcon tubesFisher14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solutionInvitrogen15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4InvitrogenAM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solutionInvitrogen15632-011
Slide white apex superior adhesiveLeica Biosystems3800080
PBS solution, pH 7.4Life Technologies10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mLNew England BiolabsP8107S
Super Pap Pen Liquid BlockerPromega22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragmentsRoche11093274910
BM Purple, 100 mLRoche11442074001
DIG Wash and Block Buffer SetRoche11585762001
NBT/BCIPRoche11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL sizeSigma-Aldrich252549-500ML
SSC Buffer 20X concentrationSigma-AldrichS6639-1L
Acetic AnhydrideSigma-Aldrich320102-100ML
FormamideSigma-Aldrich47670-250ML-F
TriethanolamineSigma-Aldrich90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological UseVWRMK866806
EthanolVWREM-EX0276-4S
TE bufferVWRPAV6232
hybridization ovenVWR97005-252, 97005-254
Orbital shakerVWR89032-088

Ссылки

  1. Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
  2. Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
  3. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
  4. Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
  5. Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
  6. Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
  7. Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
  8. Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
  9. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
  10. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  11. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
  12. Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
  13. Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
  14. Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
  15. Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
  16. Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
  17. Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138situ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены