In Situ Técnicas de hibridación para muestras de corales adultos parafinadas

Resumen

El objetivo de este protocolo es realizar la hibridación en situ en adultos muestras de corales que han sido incrustadas en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Se trata de un método cualitativo utilizado para visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA anti sentida en tejidos embebidos en parafina.

Resumen

Los corales son invertebrados océano importantes que son críticos para la salud general de los océanos y salud humana. Sin embargo, debido a los impactos humanos tales como el aumento de las temperaturas de océano y la acidificación del océano, los corales son cada vez más bajo amenaza. Para abordar estos desafíos, los avances en biología celular y molecular han demostrado para ser crucial para diagnosticar la salud de los corales. Modificar algunas de las técnicas utilizadas en medicina humana podría mejorar grandemente capacidad de los investigadores para tratar y salvar a los corales. Para hacer frente a esto, un protocolo para en situ hibridación utilizado principalmente en medicina humana y Biología del desarrollo evolutiva ha sido adaptado para su uso en adultos corales bajo estrés.

El propósito de este método es visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA en tejido coral adulto que ha sido incluida en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Este método se centra en la eliminación de la parafina y rehidratación de la muestra, tratamiento previo de la muestra para asegurar la permeabilidad de la muestra, pre-hibridación incubación, hibridación de la sonda de RNA y la visualización de la sonda de RNA. Este es un método eficaz al utilizar organismos no-modelo para descubrir donde se expresan genes específicos, y el protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros organismos no-modelo. Sin embargo, el método es limitado en tanto que es principalmente cualitativo, porque la intensidad de la expresión puede variar dependiendo de la cantidad de tiempo utilizado durante la etapa de visualización y la concentración de la sonda. Además, la paciencia es necesaria, ya que este protocolo puede tomar hasta 5 días (y en muchos casos, más) dependiendo de la sonda se utiliza. Finalmente, la tinción de fondo inespecífica es común, pero esta limitación puede ser superada.

Introducción

Los corales son ecosistemas críticos e importantes para la biodiversidad en el océano y salud humana^1,2,3. Están bajo amenaza debido al cambio climático y otros estresores antropogénicos, y muchas especies de coral se consideran en peligro crítico. Así, hay una necesidad importante de herramientas celulares y moleculares para diagnosticar los corales bajo estrés. Además, allí es poco entendido sobre que genes se expresan en el tejido adulto de coral y por lo tanto poca comprensión de las funciones de estos genes. Para solucionar este problema, nos hemos adaptado en situ hibridación (ISH) protocolo, comúnmente utilizado en medicina humana y Biología del desarrollo evolutiva, para uso en muestras de tejido parafina-encajado de corales adultos. Esta técnica es más poderosa cuando se utiliza en los corales de adultos que han sufrido un evento estresante como la exposición a estrés por calor. Sin embargo, esta técnica puede utilizarse en una amplia gama de tejidos y etapas de la vida en los corales y no se limita a sólo corales subrayó calor^4,6,7. Además, esta técnica puede utilizarse en tejidos o células de cualquier metazoarios, siempre y cuando se dispone de información de la secuencia de cDNA.

El propósito de este método es visualizar sondas de RNA en tejido coral adulto que ha sido preservado y embebido en parafina y seccionadas en diapositivas. Este método es una poderosa herramienta de diagnóstico que permite la visualización de los ácidos nucleicos dentro de tejido adulto de coral. Este método fue desarrollado inicialmente para diagnóstico médico, y desde entonces se ha convertido en una herramienta popular en campos como la biología del desarrollo y biología de desarrollo evolutiva^8,9,10. ISH es también un método crítico, particularmente en los sistemas de modelo no, cuando genómicos y transcriptómicos secuencia datos están disponibles pero patrones de expresión génica espacial son desconocidos. Para el trabajo de diagnóstico en sistemas no modelo, esta técnica es poderosa porque puede indicar que las células y los tejidos expresan un gen de interés y pueden conducir a enfoques terapéuticos dirigidos más de^{8,9,10, 11,12}. Por último, esta técnica es cualitativa y más potente cuando se combina con la expresión de genes cuantitativos datos¹¹.

El enfoque esbozado en este trabajo será de interés para los investigadores que ya han diseñado un digoxigenina (DIG)-etiquetados RNA sonda (puntas de prueba el sentido y antisentido) y está ahora listo para realizar en situ el hibridación de las puntas de prueba a una muestra. Para realizar este método, se necesitarán dos secciones seriadas del tejido parafina coral para cada sonda ensayada. Se utilizará una sección de la sonda de sentido y el otro para la sonda antisentida. La sonda sentido será un control para indicar la fijación no específica. Si la coloración se observa en la punta de prueba de sentido, la punta de prueba antisentido no es específico del ARN de interés. Las sondas se pueden diseñar para cualquier gen expresado. En este protocolo, se utilizan varios ejemplos que previamente fueron encontrados para ser expresado durante el estrés por calor en los corales: FBJ osteosarcoma murino homólogo del oncogene virales B (Fos-B), proteína activadora (AP1) y Tumor necrosis factor receptor 41 (TNFR 41)¹¹. ISH con sondas de RNA marcados con DIG es preferible usar sondas radioactivas porque su manejo es mucho más seguro¹⁰. Además, esta técnica es altamente sensible y puede realizarse en una amplia gama de tejidos y embriones más allá de corales adultos destacó por el calor^13,14,15,16.

Protocolo

1. eliminación de la parafina

PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos bajo una campana de humos.

1. Dewax seccionado fino parafina-encajado diapositivas con xileno 100% bajo el capó en frascos Coplin durante 10 minutos. No use plástico Coplin, como xileno derrite el plástico. Esterilizar los frascos Coplin en autoclave antes de su uso.
2. Preparar cuatro frascos de Coplin de vidrio estéril con lo siguiente: 100% etanol, etanol al 80%, etanol al 70% y etanol al 60%. Diluir el etanol con agua libre de ARNasa.
   1. Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con 100% de etanol y remojar durante 10 minutos. Después de 10 minutos, vacíe la jarra de Coplin de vidrio y sustituir con etanol 100% nuevo. Poner en remojo las diapositivas nuevamente por 10 minutos.
   2. Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con etanol al 80% durante 1 minuto.
   3. Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con etanol al 70% durante 1 minuto.
   4. Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con etanol al 60% durante 1 minuto.

2. tratamiento previo de diapositivas para la preparación de la hibridación de la sonda de RNA

1. Realizar los lavados siguientes a temperatura ambiente, a menos que se especifique lo contrario. Realizar lavados de la temperatura ambiente en un agitador orbital a una velocidad lenta. Utilice sobres estériles diapositiva con espacio para hasta cinco diapositivas para el lavado de los portaobjetos.
2. Transfiera los portaobjetos a un envío de diapositivas estéril con 18 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Lavar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Retirar el PBS 1 x y tratar inmediatamente el tejido en las diapositivas con proteinasa K para permitir la penetración de la sonda del tejido. Añadir aproximadamente 18 mL de solución de proteinasa K para el envío de diapositivas (ver tabla 1 para la concentración de la solución de trabajo). Incubar a 37 ° C durante 15 minutos. No se mueva.
   1. Mientras que las diapositivas están incubando, preparar el buffer prehybridization (tampón de Prehybe). Coloque el Prehybe Buffer en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, luego enfríe en un baño de hielo durante 5 minutos. Para una receta de Prehybe Buffer, vea la tabla 1.
   2. Detener la digestión de la reacción de proteinasa K por verter la solución de proteinasa K y añadir 18 mL de solución de PBS glicina 0.2% para el envío de diapositivas. Que el envío de diapositivas reposar 5 min a temperatura ambiente.
   3. Vierta la solución de glicina-PBS de 0.2% y añadir 18 mL de solución de citrato de sodio solución salina (SSC) de x 2 para cada envío de diapositivas. Lavar los portaobjetos en los 2 x SSC por 10 min a temperatura ambiente, con agitación a 100-150 rpm.

3. prehybridization de diapositivas en preparación para la hibridación de la sonda de RNA

1. Mientras que las diapositivas se está lavando con 2 x SSC, obtener un nuevo envío de portaobjetos estériles y aproximadamente 18 mL de tampón de Prehybe en el envío de diapositivas. Coloque el correo de la diapositiva en el horno de hibridación a la temperatura de hibridación.
   Nota: Dependerá de la temperatura de hibridación de la sonda está usada, pero generalmente oscila entre 50-60 ° C.
2. Una vez terminado el lavado x SSC 2, verter 2 x SSC y lugar de las diapositivas en el correo de diapositiva en el Prehybe Buffer en el horno de hibridación durante 1 hora.

4. hibridación de la sonda de RNA

1. Mientras que las diapositivas se incuban con el tampón de Prehybe en el horno de hibridación, preparar la solución de hibridación-sonda.
   1. Diluir cada sonda en tampón de hibridación (0,5 μl de sonda con 24.5 μl de tampón de hibridación).
      Nota: La receta del tampón de hibridación se encuentra en la tabla 1. Un ejemplo de preparación de la sonda y concentraciones puede encontrarse en Traylor-Knowles et al. ¹¹.
   2. Coloque la sonda diluida en un bloque de calor de 86-90 ° C durante 12 minutos, luego enfríe durante 1 min en hielo.
2. Saque del horno de hibridación el envío de diapositivas y bien quitar diapositivas del envío de diapositivas utilizando pinzas estériles. Poner los portaobjetos sobre una toalla de papel y limpie cuidadosamente el exceso de Prehybe de tampón alrededor de las muestras de tejido. Tenga cuidado de no tocar las muestras y trabajar rápidamente para prevenir la desecación de las muestras de tejido.
3. Rodean el tejido con una pluma PAP. Aplique 25 μl de solución diluida de la sonda con una pipeta y cubrir la muestra con un cubreobjetos de plástico.
   1. Coloque las muestras en la cámara de humedad diapositiva 4 x SSC + 50% formamida solución en la parte inferior de la cámara.
   2. Una vez que las sondas se han añadido a todas las diapositivas, coloque la cámara de humedad de la diapositiva en el horno de hibridación durante al menos 24 h a una temperatura de hibridación de 50-60 ° C. El tiempo de incubación puede variar dependiendo de la concentración de la sonda pero debe ser por un mínimo de 24 horas.
4. Después de la incubación durante la noche con las sondas diluidas, saque la cámara de humedad deslizante del horno de hibridación.
   1. Quite el cubreobjetos de cada una de las diapositivas, teniendo cuidado de no desplazar los tejidos. En una pipeta de 1000 μl, añadir 1000 μl de solución de x SSC 2 y lavar suavemente el portaobjetos.
   2. Colocar el portaobjetos en un correo de portaobjetos estériles con 18 mL de solución de x SSC 2 por 5 min a temperatura ambiente. Vierta la solución y reemplazarla con 18 mL de dulce 2 x SSC. Repetir la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
   3. Vierta la solución de x SSC 2. Agregar 18 mL de 1 x SSC solución y lavar por 5 min a temperatura ambiente. Vierta la solución de x SSC 1 y reemplazarlo con 18 mL de fresco 1 x SSC. Repita la incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
   4. Verter el 1 x SSC. Agregar 18 mL de 0,5 x SSC y lavado durante 10 min a 42 ° C sin agitación. Derramar el 0,5 x SSC y reemplazar él con 18 mL de 0.5 fresco x SSC. Lave nuevamente durante 10 minutos a 42 ° C sin agitación.

5. visualización de la sonda de RNA

Nota: Para la visualización de la sonda, púrpura de BM se utilizará durante el proceso de desarrollo. Sin embargo, antes de este paso, muchos lavados se necesitan para preparar las muestras para tinción.

1. Lave los portaobjetos con 18 mL de fosfatasa alcalina tampón (tampón de AP) sin vaciar el búfer de AP sin MgCl₂MgCl₂ durante 1 minuto y añadir 18 mL de amortiguador de bloqueo del Boehringer-Mannheim de 1 x diluido con ácido maleic amortiguamiento. Incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente en un correo la diapositiva con agitación suave.
   Nota: El amortiguador de bloqueo de Boehringer-Mannheim ácido maleic amortiguamiento utilizado premade y fueron adquiridos en el lavado de Cave y bloque conjunto de búfer (disponibles comercialmente).
   1. Alternativamente, se puede realizar incubación durante la noche a 4 ° C. Un período ya bloqueo disminuirá la aparición de fijación no específica.
2. Preparar 20 mL de fragmentos Fab de diluido DIG anti-digoxigenina-AP (anticuerpos anti-DIG = 2 μl de anticuerpo anti-DIG + 20 mL 1 x amortiguador de bloqueo de Boehringer-Mannheim). Esto es suficiente para el uso en correo diapositiva plástica 1. Más de esta solución deben ser preparada si más de un anuncio publicitario de la diapositiva debe ser utilizado.
3. Añadir el anticuerpo anti-DIG a un nuevo envío de portaobjetos estériles y transfiera los portaobjetos para el envío de diapositivas con la solución de anticuerpo anti-DIG. Incubar a temperatura ambiente durante 3 h con agitación suave.
4. Después de la incubación, derramar el anticuerpo anti-DIG y lave el portaobjetos en el correo de diapositiva con 18 mL de tampón de AP sin MgCl₂ por 5 min con agitación suave.
5. Vaciar el búfer de AP sin MgCl₂ y añadir 18 mL de tampón de AP. Lavar durante 5 minutos con agitación suave. Después de la incubación de 5 minutos, retirar el búfer de AP, reemplazarlo con 18 mL de tampón de AP fresca y lavar por 5 min con agitación suave.
6. En la oscuridad, vaciar el búfer de AP y añadir 18 mL de BM púrpura para el envío de diapositivas. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad, para desarrollo de color púrpura que cada ½ h. reacción de visualización variarán basado en la punta de prueba que se está desarrollando.
   Nota: En lugar de visualización BM púrpura, solución de desarrollo puede realizarse utilizando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT). Vea la tabla 1 para obtener instrucciones.
7. Detener el desarrollo de color mediante la transferencia de las diapositivas a un nuevo envío de portaobjetos estériles con 18 mL de tampón Tris-EDTA (TE) durante 5 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
8. Quite el buffer TE y añadir 18 mL de agua libre de ARNasa al correo de diapositiva y lavar durante 1 min, en la oscuridad.
9. Quitar las diapositivas del agua y seca alrededor de los bordes del tejido. Añadir glicerol medio de montaje y coloque el cubreobjetos. Almacenar las diapositivas a 4 ° C hasta que están listas a tomarse fotos.

Resultados

Después de completar este protocolo, se logrará la identificación de células y tejidos que están expresando la sonda de RNA de interés. Resultados representativos de este protocolo están para AP-1, FosB y TNFR41. Estos resultados, publicados anteriormente por Traylor-Knowles et al. ¹¹, Mostrar expresión espacial del RNA puntas de prueba en corales adultos que fueron expuestos a estrés por calor. Dos ejemplos de diferentes tipos de tinción se pres...

Discusión

El método descrito en el presente Protocolo se ha modificado del anterior trabajo de investigación médica y evolutiva del desarrollo^8,9,10,12,17. Este protocolo se centra en los matices de un hibridación en situ con sonda marcada con DIG RNA anti-sentido en corales adultos, que han sido preservados y embebidos en parafina. Este método se puede tr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Denhardt's solution	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
Slide mailers	Fisher	12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon tubes	Fisher	14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Invitrogen	AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
Slide white apex superior adhesive	Leica Biosystems	3800080
PBS solution, pH 7.4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use	VWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE buffer	VWR	PAV6232
hybridization oven	VWR	97005-252, 97005-254
Orbital shaker	VWR	89032-088