JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.

Özet

Mercan genel okyanus sağlığı hem de insan sağlığı için önemlidir önemli okyanus omurgasızlar vardır. Ancak, yükselen okyanus sıcaklıklar ve okyanus asitleştirme gibi insan etkileri nedeniyle, mercan giderek tehdit altında vardır. Bu sorunları çözmek için hücre ve moleküler biyoloji gelişmeler mercan sağlık tanılamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. İnsan tıpta çok kullanılan tekniklerden bazıları değiştirme tedavi ve mercan kaydetmek için araştırmacıların yeteneği büyük ölçüde artırabilirsiniz. Bu sorunu çözmek için öncelikle insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi kullanılan in situ hibridizasyon için bir protokol yetişkin mercan stres altında kullanmak için adapte edilmiştir.

Bu yöntemin amacı bir RNA sondayı parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan doku içine kayma ifade görselleştirmek etmektir. Bu yöntem parafin ve rehydration örnek kaldırma, ön örnek, öncesi hibridizasyon kuluçka, RNA sonda hibridizasyon ve RNA sonda görselleştirme geçirgenliği sağlamak için örnek üzerinde odaklanır. Sigara model organizmalar nerede belirli genlerin ifade edilir ve protokol diğer sigara model organizmalar için kolayca adapte edilebilir keşfetmek için kullanırken bu güçlü bir yöntemdir. Öncelikle nitel, çünkü ifade yoğunluğu görselleştirme adım ve sonda konsantrasyonu sırasında harcanan zamanı miktarına bağlı olarak değişebilir ancak, yöntem sınırlı olmamasıdır. Bu iletişim kuralı-ebilmek almak ilâ 5 gün (ve birçok durumda daha uzun) kullanılan sonda bağlı olarak Ayrıca, sabır, gerekmemektedir. Son olarak, non-spesifik arka plan boyama yaygındır, ama bu sınırlamanın üstesinden gelebilir.

Giriş

Mercan çoğu kritik ekosistem inşaatçılar ve okyanus ve insan sağlığı1,2,3' te biyoçeşitlilik için önemli. İklim değişikliği ve diğer antropojenik stres nedeniyle tehdit altında olduklarını ve birçok mercan türünün kritik tehlike altında olarak kabul edilir. Böylece, mercan stres altında tanılamak hücresel ve moleküler araçları için önemli bir ihtiyaç vardır. Ayrıca, orada az nerede genler yetişkin mercan doku ve bu genlerin fonksiyonları bu nedenle küçük anlayışı içinde ifade edilir hakkında anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için sık kullanılan insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi, parafin gömülü doku örnekleri yetişkin mercanlar üzerinde kullanım için in situ hibridizasyon (ISH) protokolü adapte olması. Isı stres maruz gibi stresli bir olay geçiren yetişkin mercanlar üzerinde kullanıldığında en güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknik çok çeşitli doku ve mercan hayat aşamalarında kullanılan ve sadece ısı vurguladı mercan4,6,7için sınırlı değildir. Ayrıca, orada olduğu sürece cDNA sırası bilgi kullanılabilir Bu teknik dokular veya herhangi bir metazoan hücreleri üzerinde kullanılabilir.

Bu yöntemin amacı RNA probları yetişkin mercan doku korunmuş ve parafin içinde gömülü ve slaytlar kesitli içinde görselleştirmek etmektir. Bu yöntem, nükleik asitler yetişkin mercan doku içinde görselleştirme sağlar güçlü bir tanı aracıdır. Başlangıçta bu yöntem tıbbi teşhis için geliştirilmiş ve beri alanlarda gelişim biyolojisi ve evrimsel gelişim biyolojisi8,9,10gibi popüler bir araç haline gelmiştir. ISH da kritik, özellikle sigara modeli sistemlerinde, genomik zaman yöntemidir ve transcriptomic sıra veri mevcut ancak kayma gen ifade desenleri bilinmemektedir. Hangi hücre ve dokuların bir gen ilgi hızlı ve daha fazla hedefli tedavi yaklaşımları8,9,10' aaçabilir belirtebilirsiniz tanılama iş için model olmayan sistemlerde, bu teknik güçlü çünkü, 11,12. Son olarak, bu teknik nitel ve nicel gen ifadesi verileri11ile eşleştirilmiş durumdayken daha güçlü olur.

Bu makalede özetlenen yaklaşım zaten bir digoxigenin (kazmak) tasarladık araştırmacılar için ilgi olacaktır-RNA sonda (anlam ve antisens probları) ve are şimdi bir örnek probları in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için hazır etiketli. Bu yöntemi gerçekleştirmek için iki seri bölümler parafin mercan doku test edilen her sonda için gerekli olacaktır. Bir bölümü anlamda sonda diğeri antianlamlı sonda kullanılacaktır. Anlamda sonda non-spesifik bağlama belirtmek için bir kontrol olacak. Boyama anlamda soruşturma görülmektedir, faiz RNA için belirli antianlamlı sonda tek değil. Probları ifade herhangi bir gen için tasarlanabilir. Bu protokol için birkaç örnek daha önce mercan ısı stres sırasında ifade edilecek bulunan kullanılmıştır: FBJ fare osteosarkom viral onkogen homolog B (Fos-B), aktivatör protein (AP1) ve tümör nekroz faktör reseptör 41 (TNFR 41)11. KAZMAK etiketli RNA problar kullanarak ISH kullandıklarında daha fazla daha güvenli10olduğundan radyoaktif problar kullanarak üzerinden tercih edilir. Buna ek olarak, bu teknik son derece hassas ve çok çeşitli doku ve ısı vurguladı yetişkin mercan13,14,15,16ötesinde embriyo üzerinde gerçekleştirilebilir.

Protokol

1. parafin kaldırılması

Dikkat: bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. İnce kesitli parafin Katıştırılmış slaytlar ile % 100 ksilen Coplin kavanozların 10 dk içinde başlık altında dewax. Ksilen plastik erir olarak plastik Coplin kavanoz, kullanmayın. Bir otoklav kullanmadan önce Coplin kavanozlarda sterilize.
  2. Aşağıdaki dört steril cam Coplin kavanoz hazırlamak: % 100 etanol, % 80'i etanol, % 70 etanol ve % 60 etanol. Etanol RNase free suyla seyreltik.
    1. 10 dakikadır onları emmek ve steril cam Coplin % 100 etanol ile slaytlar transfer. 10 dk sonra cam Coplin boş ve yeni % 100 etanol ile değiştirin. Slaytları 10 min için tekrar ıslatın.
    2. Slaytları steril cam Coplin kavanoza 1 dk. için % 80 etanol ile aktarın.
    3. Slaytları steril cam Coplin % 70 etanol için 1 dk ile aktarın.
    4. Slaytları steril cam Coplin kavanoza 1 dk. için % 60 etanol ile aktarın.

2. RNA sonda hibridizasyon hazırlanması için slaytların Önarıtma

  1. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında, aşağıdaki yıkar gerçekleştirin. Oda sıcaklığında yıkar bir orbital çalkalayıcı yavaş hızda gerçekleştirin. Steril slayt postaları slaytları yıkama için en çok beş slaytlar için oda ile birlikte kullanın.
  2. Slaytlar ile 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 18 mL steril slayt mailler aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
  3. 1 x PBS dökün ve hemen sonda penetrasyon dokusunun etkinleştirmek için İndinavir K bulunan slaytlarda doku tedavi. Yaklaşık 18 mL İndinavir K çözeltisi slayt mailler eklemek (çözüm konsantrasyonu çalışmak için bkz. Tablo 1 ). 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Sallama.
    1. Slaytları kuluçka iken, prehybridization arabellek (Prehybe arabellek) hazırlayın. Prehybe arabellek 10 dakika kaynar su banyosu içinde yer, o zaman bir buz banyosu 5 min için serin. Prehybe arabellek tarifini bkz. Tablo 1.
    2. Sindirim İndinavir K tepki dışarı İndinavir K eriyik dökerek durdurmak ve hemen slayt mailler için 18 mL % 0,2 glisin-PBS çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için oturup slayt mailler izin.
    3. % 0,2 glisin-PBS solüsyonu dökün ve her slayt mailler için 18 mL 2 x Serum sodyum sitrat (SSC) çözeltisi ekleyin. Slaytları 2 yıkama x SSC 100-150 rpm'de sallayarak ile 10 dakika oda sıcaklığında.

3. prehybridization slayt RNA sonda hibridizasyon için hazırlık

  1. Slaytları 2 ile yıkanır iken x SSC, yeni bir steril slayt mailler alın ve yaklaşık 18 mL Prehybe arabelleği slayt mailler koymak. Slayt mailler hibridizasyon hibridizasyon sıcaklık fırında yerleştirin.
    Not: Hibridizasyon sıcaklık genellikle 50-60 ° c arasında değişmektedir ama kullanılan sonda göre değişir
  2. 2 x SSC yıkama tamamlandığında, 2 x SSC ve yere dökmek Slaytları Slayt mailler Prehybe arabellek için 1s hibridizasyon fırında içinde.

4. hibridizasyon RNA sonda

  1. Slaytları hibridizasyon fırın Prehybe arabelleği ile kuluçka iken, hibridizasyon-sonda çözüm hazırlamak.
    1. Her sonda hibridizasyon arabelleği (24.5 µL hibridizasyon arabelleği ile inceleyebilirsek 0.5 µL) oranında seyreltin.
      Not: Tarifi hibridizasyon arabellek için Tablo 1' de bulunur. Sonda hazırlık ve konsantrasyonları örneği-ebilmek bulunmak içinde Traylor Knowles vd. 11.
    2. 12 dk bir 86-90 ° C ısı blokta seyreltilmiş sonda yer, o zaman buz üzerinde 1 dk. için serin.
  2. Slayt mailler hibridizasyon Fırından çıkarın ve tek tek slaytlar steril Cımbız kullanarak slayt mailler kaldırın. Düz kağıt havlu üzerinde slaytlar yatıyordu ve dikkatle doku örnekleri geçici aşırı Prehybe arabellek yok etmek. Örnekleri, dokunmak dikkatli olun ve iş hızlı doku örnekleri kurutma önlemek için.
  3. Doku PAP kalemle çevreler. Bir pipet ile seyreltilmiş sonda çözümün 25 µL uygulamak ve bir plastik coverslip ile örnek kapak.
    1. Örnekleri slayt nem odası ile 4 x SSC + % 50 formamide çözüm içinde belgili tanımlık dip odasının yerleştirin.
    2. Probları tüm slaytlara eklendikten sonra slayt nem odası hibridizasyon hibridizasyon sıcaklık 50-60 ° c en az 24 saat fırında yerleştirin Kuluçka süresi sonda konsantrasyonu bağlı olarak değişebilir ama en az 24 saat olmalıdır.
  4. Seyreltilmiş probları ile gece kuluçka sonra slayt nem odası hibridizasyon Fırından çıkarın.
    1. Coverslips doku yerinden değil dikkatli olmak slaytların herbirinden kaldırın. 1000 µL pipet 1000 µL 2 x SSC çözüm ekleyin ve slayt nazikçe yıkayın.
    2. Slayt 18 mL oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC çözeltisi ile steril slayt mailler yerleştirin. Solüsyonu dökün ve eski yerine koymak o ile 18 mL taze 2 x SSC. Kuluçka nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 5 min için tekrar.
    3. 2 x SSC solüsyonu dökün. 1 x SSC çözüm ve 5 min için yıkama 18 mL oda sıcaklığında ekleyin. 1 x SSC solüsyonu dökün ve eski yerine koymak o ile 18 mL taze 1 x SSC. Kuluçka nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 5 min için yineleyin.
    4. 1 dökmek x SSC. 18 mL 0.5 x SSC ve 10 min için yıkama 42 ° C'de sallayarak olmadan ekleyin. SSC ve Değiştir x 0.5 dökmek 18 mL taze 0,5 ile x SSC. Tekrar sallayarak olmadan 42 ° C'de 10 dakika yıkayın.

5. RNA sonda görselleştirme

Not: sonda görüntülenmesi için BM mor geliştirme süreci sırasında kullanılır. Ancak, bu adımdan önce birkaç yıkama için boyama örnekleri hazırlamak için gereklidir.

  1. Olmadan MgCl2 1 dk. AP-tampon MgCl2olmadan dökmek ve 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim engelleme arabellek Maleik asit tampon ile seyreltilmiş ekleyin slaytlar alkalen fosfataz arabelleği (AP-tampon) 18 mL ile yıkayın. Nazik sallayarak ile bir slayt mailler içinde oda sıcaklığında en az 1 h için kuluçkaya.
    Not: Boehringer-Mannheim engelleme tampon ve kullanılan Maleik asit tampon erken ve kazmak yıkama ve blok arabellek ayarla satın (mevcut ticari olarak).
    1. Alternatif olarak, kuluçka gecede 4 ° C'de gerçekleştirilir. Artık bu engelleme bir süre belirsiz bağlama görünümünü azaltmak olacaktır.
  2. Seyreltilmiş kazmak anti-digoxigenin-AP Fab parçaları 20 mL hazırlamak (Anti-kazmak antikor Anti-kazmak antikor + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim engelleme arabellek 2 µL =). Bu 1 Plastik slayt mailler kullanımda yeterli olur. Birden fazla slayt mailler kullanılacak ise bu çözüm daha fazla hazırlanmalıdır.
  3. Anti-kazmak antikor yeni bir steril slayt mailler ekleyin ve Slaytları Slayt mailler Anti-kazmak antikor çözüm ile aktarın. Nazik sallayarak ile 3 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  4. Kuluçka sonra anti-kazmak antikor dökmek ve Slaytları Slayt mailler AP-tampon 18 mL MgCl2 nazik sallayarak ile 5 min için olmadan ile yıkayın.
  5. AP-tampon MgCl2, olmadan dökmek ve AP-tampon 18 mL ekleyin. Nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. 5 dk kuluçka sonra AP-tampon dökün, eski yerine koymak o ile 18 mL taze AP-arabelleği ve nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın.
  6. Karanlıkta, AP-tampon dökmek ve BM mor 18 mL slayt mailler için ekleyin. Slayt görüntüleme için her ½ h. tepki süreleri değişir mor renk geliştirme geliştirilmektedir prob dayanarak denetleniyor karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ve nitro mavi tetrazolium (NBT) kullanarak BM mor görselleştirme yerine geliştirme çözümü yapılabilir. Yönergeler için bkz: Tablo 1 .
  7. Renk geliştirme Tris-EDTA (TE) arabelleği karanlık oda sıcaklığında 5 min için 18 mL ile yeni bir steril slayt mailler için slaytları aktararak durdurmak.
  8. TE tampon dökün ve slayt mailler ve karanlıkta 1 dk. için yıkama 18 mL RNase free su ekleyin.
  9. Slaytları sudan çıkarın ve kuru onları dokuyu kenarlarda. Ve coverslips yer Orta montaj gliserol ekleyin. Resimler alınacak hazır olana slaytlar 4 ° C'de depolayın.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı tamamlandıktan sonra hücreleri ve RNA sonda ilgi ifade eden dokular elde edilecektir. Bu iletişim kuralı için temsilcisi fark AP-1, FosB ve TNFR41 için sonuçlarıdır. Bu sonuçlar, daha önce Traylor Knowles ve ark. tarafından yayınlandı 11, ısı stres maruz kaldılar yetişkin mercanlar üzerinde gösteri kayma ifade RNA'ın sondalar. İki farklı boyama türü örnekleri Şekil 1' de sunulmak...

Tartışmalar

Bu protokol için açıklanan yöntemi tıbbi ve evrimsel gelişim araştırma8,9,10,12,17önceki işten değiştirildi. Bu iletişim kuralı bir in situ hibridizasyon nüansları korunmuş ve parafin içinde gömülü yetişkin mercanlar üzerinde kazmak etiketli RNA Anti-anlamda sonda ile odaklanır. Bu yöntem ayrıca parafin gömülü olan mercan ...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ödülü tarafından finanse edildi yok. OCE-1323652 Ulusal Bilim Vakfı okyanus bilimi doktora sonrası Bursu ve Ödülü no.1012629 Burroughs Wellcome Fonu doktora sonrası zenginleştirme programı aracılığıyla.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Denhardt's solutionAffymetrix70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase bufferFisher50-198-724
Slide mailersFisher12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase bufferFisher50-198-724
50 mL Falcon tubesFisher14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solutionInvitrogen15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4InvitrogenAM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mLInvitrogen10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solutionInvitrogen15632-011
Slide white apex superior adhesiveLeica Biosystems3800080
PBS solution, pH 7.4Life Technologies10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mLNew England BiolabsP8107S
Super Pap Pen Liquid BlockerPromega22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragmentsRoche11093274910
BM Purple, 100 mLRoche11442074001
DIG Wash and Block Buffer SetRoche11585762001
NBT/BCIPRoche11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL sizeSigma-Aldrich252549-500ML
SSC Buffer 20X concentrationSigma-AldrichS6639-1L
Acetic AnhydrideSigma-Aldrich320102-100ML
FormamideSigma-Aldrich47670-250ML-F
TriethanolamineSigma-Aldrich90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological UseVWRMK866806
EthanolVWREM-EX0276-4S
TE bufferVWRPAV6232
hybridization ovenVWR97005-252, 97005-254
Orbital shakerVWR89032-088

Referanslar

  1. Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
  2. Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
  3. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
  4. Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
  5. Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
  6. Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
  7. Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
  8. Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
  9. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
  10. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  11. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
  12. Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
  13. Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
  14. Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
  15. Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
  16. Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
  17. Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 138i inde in situ hibridizasyonmercanmercan resifleriAnti anlamda sondaRNAs stres

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır