就地石蜡镶嵌成人珊瑚样品的杂交技术

摘要

本议定书的目的是对已嵌入石蜡切片的成人珊瑚样品进行原位杂交, 并将其切片到玻璃滑梯上。这是一种定性的方法, 用于可视化的 RNA 反感探针在石蜡嵌入组织的空间表达。

摘要

珊瑚是重要的海洋无脊椎动物, 对整个海洋健康和人类健康至关重要。然而, 由于海洋温度上升和海洋酸化等人类影响, 珊瑚越来越受到威胁。为了应对这些挑战, 细胞和分子生物学的进步已经证明对诊断珊瑚的健康至关重要。修改人类医学常用的一些技术可以大大提高研究人员治疗和拯救珊瑚的能力。为了解决这一问题, 现已将一种主要用于人类医学和进化发育生物学的原位杂交协议用于在压力下的成年珊瑚中使用。

该方法的目的是可视化的 RNA 探针在成人珊瑚组织, 已嵌入石蜡和切片到玻璃幻灯片的空间表达。该方法的重点是去除样品的石蜡和补液, 对样品进行预处理, 以保证样品的渗透性, 预杂交孵化, rna 探针的杂交, rna 探针的可视化。这是一个强有力的方法, 当使用非模型有机体发现特定基因的表达, 并且协议可以很容易地适应其他非模型有机体。然而, 该方法是有限的, 因为它主要是定性的, 因为表达强度可能会因在可视化步骤中使用的时间量和探针的浓度而异。此外, 需要有耐心, 因为这个协议可能需要5天 (而且在许多情况下, 更长的时间) 取决于所使用的探头。最后, 非特异背景染色是常见的, 但这一限制可以克服。

引言

珊瑚是重要的生态系统建设者和重要的生物多样性的海洋和人类健康^1,2,3。由于气候变化和其他人为的压力, 它们受到威胁, 许多珊瑚物种被认为是严重濒危的。因此, 需要细胞和分子工具来诊断珊瑚在压力下。此外, 对于在成人珊瑚组织中表达基因的地方, 几乎没有什么了解, 因此对这些基因的功能了解甚少。为了解决这个问题, 我们已经修改了原位杂交协议, 通常用于人类医学和进化发育生物学, 用于在成人珊瑚的石蜡嵌入组织样本。这项技术是最强大的, 当用于成年珊瑚已经经历了紧张的事件, 如接触热应力。然而, 这种技术可用于珊瑚的广泛的组织和生命阶段, 并不仅限于热应激珊瑚^4,6,7。此外, 这种技术可以用于任何后生的组织或细胞只要有 cDNA 序列信息可用。

这种方法的目的是在成年珊瑚组织中可视化 RNA 探针, 这些细胞已经保存并嵌入石蜡切片并切片到幻灯片上。这种方法是一个强大的诊断工具, 允许在成人珊瑚组织中的核酸可视化。最初这种方法是为医疗诊断而开发的, 此后它已成为发展生物学和进化发育生物学^8,9,10等领域的流行工具。当基因组和 transcriptomic 序列数据可用, 但空间基因表达模式未知时, 它也是一种关键方法, 特别是在非模型系统中。对于非模型系统的诊断工作, 这种技术是强大的, 因为它可以表明哪些细胞和组织表达感兴趣的基因, 并可以导致更有针对性的治疗方法^{8,9,10, 11,12}。最后, 该技术在与定量基因表达数据配对时, 质量和功能更强¹¹。

本文概述的方法将感兴趣的研究人员已经设计了辛 (挖) 标记的 RNA 探针 (这两种感觉和反义探针), 现在准备进行原位杂交探针到一个样本。为了执行这种方法, 每一个正在测试的探针都需要两个连续切片的石蜡珊瑚组织。一节将用于感官探针, 另一个用于反义探针。感官探测器将是指示非特定绑定的控件。如果在感官探针中观察到染色, 则反义探针并不特定于感兴趣的 RNA。探针可以为任何表达的基因设计。在本议定书中, 以前发现在珊瑚热应激期间表达的几个例子: FBJ 小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源 b (Fos b), 激活蛋白 (AP1), 肿瘤坏死因子受体 41 (TNFR 41)¹¹。使用挖掘标记的 RNA 探针比使用放射性探针更可取, 因为它们的处理更安全¹⁰。此外, 这项技术是高度敏感的, 可以执行广泛的组织和胚胎以外的热应力成人珊瑚^13,14,15,16。

研究方案

1. 石蜡的去除

注意: 在通风罩下执行以下步骤。

1. 脱蜡100% 二甲苯下的薄切片石蜡嵌入的幻灯片在玻璃 Coplin 罐子里10分钟。不要使用塑料 Coplin 罐子, 因为二甲苯熔化塑料。使用前, 在高压釜中消毒 Coplin 罐。
2. 准备四无菌玻璃 Coplin 罐与以下: 100% 乙醇, 80% 乙醇, 70% 乙醇和60% 乙醇。用无 RNase 的水稀释乙醇。
   1. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 用100% 乙醇浸泡10分钟。10分钟后, 清空玻璃 Coplin 罐, 替换为新的100% 乙醇。再次浸泡10分钟的幻灯片。
   2. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 80% 乙醇为1分钟。
   3. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 70% 乙醇为1分钟。
   4. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 60% 乙醇为1分钟。

2. 制备 RNA 探针杂交的幻灯片前处理

1. 在室温下进行以下洗涤, 除非另有规定。以低速速度在轨道振动筛上进行室温清洗。使用无菌幻灯片邮寄与房间多达五张幻灯片洗涤幻灯片。
2. 将幻灯片转移到无菌幻灯片邮件, 18 毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。室温下洗5分钟。
3. 倒入 1x PBS, 并立即用蛋白酶 K 处理幻灯片上的组织, 以使探针穿透组织。添加大约18毫升蛋白酶 K 溶液的幻灯片邮件 (见表 1的工作溶液浓度)。孵育37°c 15 分钟。不要动摇。
   1. 当幻灯片正在孵化时, 准备 prehybridization 缓冲区 (Prehybe 缓冲区)。将 Prehybe 缓冲液放在沸水浴中10分钟, 然后在冰浴上冷却5分钟。有关 Prehybe 缓冲区的食谱, 请参见表 1。
   2. 通过浇注蛋白酶 k 溶液停止消化蛋白酶 k 反应, 并立即将18毫升0.2% 甘氨酸 PBS 溶液添加到滑动邮件中。让幻灯片邮件在室温下坐5分钟。
   3. 倒出0.2% 甘氨酸 PBS 解决方案, 并添加18毫升的2x 盐水柠檬酸钠 (SSC) 解决方案, 每个幻灯片邮件。在室温下将 2x SSC 中的幻灯片洗净10分钟, 以100-150 转每分钟的抖动为中心。

3. Prehybridization 在 RNA 探针杂交制备中的研究进展

1. 当幻灯片使用 2x SSC 进行清洗时, 获取新的无菌幻灯片邮件, 并将大约18毫升的 Prehybe 缓冲区放入幻灯片邮件中。在杂交温度下将滑动邮件放入杂交烤箱。
   注: 杂交温度将取决于所使用的探针, 但通常范围从50-60 °c。
2. 一旦 2x ssc 清洗完成, 倒出 2x SSC, 并把幻灯片在 Prehybe 缓冲区中的幻灯片邮件在杂交烤箱1小时。

4. RNA 探针的杂交

1. 在杂交烤箱中用 Prehybe 缓冲器孵化时, 准备杂交探针溶液。
   1. 稀释每个探针在杂交缓冲 (0.5 µL 探针与24.5 µL 的杂交缓冲)。
      注: 杂交缓冲配方在表 1中找到。在特雷勒中可以找到探针的制备和浓度的例子. ¹¹。
   2. 将稀释探针放在86-90 摄氏度的散热块上12分钟, 然后在冰上冷却1分钟。
2. 从杂交烤箱中取出幻灯片邮件, 然后使用无菌镊子从幻灯片邮件中单独删除幻灯片。将幻灯片平放在纸巾上, 仔细擦拭组织样本周围多余的 Prehybe 缓冲。小心不要接触样品, 并迅速工作, 以防止干燥的组织样本。
3. 用 PAP 笔包围组织。应用25µL 稀释探针溶液与吸管和覆盖样品与塑料盖玻片。
   1. 将样品放在滑水室中, 用 4x SSC + 50% 甲酰胺溶液在会议厅底部放置。
   2. 一旦探头被添加到所有的幻灯片, 将滑动水分室放入杂交烤箱至少24小时在杂交温度为50-60 摄氏度。潜伏期可以根据探针的浓度而变化, 但至少要24小时。
4. 在用稀释后的探针过夜孵化后, 从杂交烤箱中取出滑水室。
   1. 从每张幻灯片中取出盖玻片, 小心不要取代组织。在1000µL 吸管, 添加1000µL 的 2x SSC 解决方案, 并轻轻地清洗滑动。
   2. 将幻灯片放在无菌幻灯片邮件中, 18 毫升 2x SSC 解决方案, 室温5分钟。倒出解决方案, 并用18毫升新鲜的 2x SSC 取代它。在室温下再重复孵化5分钟, 轻轻摇动。
   3. 倒出 2x SSC 解决方案。添加18毫升的 1x SSC 溶液, 并在室温下清洗5分钟。倒出 1x ssc 解决方案, 并用18毫升的新鲜 1x ssc 替换它。在室温下, 重复5分钟的孵化, 轻轻摇动。
   4. 倒出 1x SSC。添加18毫升的 0.5x SSC 和洗涤10分钟, 在42摄氏度不摇晃。倒入 0.5x ssc, 并用18毫升的新鲜 0.5x ssc 替换它。再洗10分钟, 在42摄氏度不摇晃。

5. RNA 探针的可视化

注: 对于可视化探头, BM 紫色将在开发过程中使用。然而, 在这一步之前, 需要几个洗涤来准备样品染色。

1. 用18毫升碱性磷酸酶缓冲液 (AP 缓冲器) 冲洗幻灯片, 不氯化镁₂ 1 分钟. 倒出 AP 缓冲器, 不氯化镁₂, 并添加18毫升1x 勃林格-曼海姆堵塞缓冲剂稀释与马来酸缓冲。在一张滑动的邮件中, 以柔和的震动, 在室温下孵化至少1小时。
   注: 勃林格-曼海姆阻塞缓冲液和马来酸缓冲器是预制和购买在挖洗和块缓冲集 (可利用商业)。
   1. 另外, 可以在4摄氏度的一夜之间进行孵化。较长的阻塞期将减少非特定绑定的外观。
2. 准备20毫升稀释挖抗辛-AP 的碎片 (抗挖抗体 = 2 µL 抗挖抗体 + 20 毫升1x 勃林格-曼海姆阻断缓冲)。这足够在1塑料幻灯片邮件中使用。如果要使用多个幻灯片邮件, 则必须准备更多此解决方案。
3. 将抗挖抗体添加到新的无菌幻灯片邮件, 并将幻灯片传送到带有反挖抗体解决方案的幻灯片邮件。在室温下孵育3小时, 轻轻摇动。
4. 孵化后, 倒出抗挖抗体, 用18毫升的 AP 缓冲器清洗幻灯片邮件中的幻灯片, 而不氯化镁₂ 5 分钟的柔和震动。
5. 在没有氯化镁2的情况下_,倒出 ap 缓冲器, 并添加18毫升的 ap 缓冲器。用柔和的震动洗5分钟。5分钟孵化后, 将 ap 缓冲液倒掉, 用18毫升新鲜的 ap 缓冲液代替, 用柔和的震动冲洗5分钟。
6. 在黑暗中, 倒出 AP 缓冲区, 并添加18毫升的 BM 紫色的幻灯片邮件。在室温下在黑暗中孵化幻灯片, 检查紫色的颜色发展每½ h. 可视化的反应时间将根据正在开发的探针而变化。
   注意: 用 5-溴-4-氯-3-哚磷酸 (BCIP) 和硝基蓝四氮唑 (NBT) 来代替 BM 紫可视化开发解决方案。有关说明, 请参见表 1 。
7. 通过将幻灯片转移到新的无菌滑动邮件收发器, 在室温下, 在黑暗中, 以18毫升的三 EDTA (TE) 缓冲器为5分钟, 停止颜色开发。
8. 倒出 TE 缓冲器, 并添加18毫升的 RNase 免费水的幻灯片邮件和洗涤1分钟, 在黑暗中。
9. 将幻灯片从水中取出, 在组织的边缘周围晾干。加入甘油安装培养基, 放置盖玻片。将幻灯片存储在4摄氏度, 直到图片准备就绪。

结果

完成该协议后, 将会对表达 RNA 探针的细胞和组织进行识别。该协议的代表性结果为 AP-1、FosB 和 TNFR41。这些结果, 以前发表的特雷勒-诺里斯等。¹¹、在暴露于热应激的成人珊瑚上显示 RNA 探针的空间表达。图 1给出了两种不同染色类型的例子。图 1A是一种弥漫性组织染色的例子。染色是在整个组织中发现?...

讨论

本协议中描述的方法已从以前在医学和进化发展研究^{8、9、10、12、17}中的工作中进行了修改。该协议的重点是在原位杂交的细微差别与挖掘标记 RNA 反意识探针的成年珊瑚, 已保存和嵌入石蜡。这种方法可以很容易地转移到生物样本以外的珊瑚, 也已石蜡嵌入。最后, 这?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Denhardt's solution	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
Slide mailers	Fisher	12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon tubes	Fisher	14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Invitrogen	AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
Slide white apex superior adhesive	Leica Biosystems	3800080
PBS solution, pH 7.4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use	VWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE buffer	VWR	PAV6232
hybridization oven	VWR	97005-252, 97005-254
Orbital shaker	VWR	89032-088