In Situ Techniques d’hybridation pour échantillons de corail adultes paraffine

Résumé

L’objectif de ce protocole consiste à effectuer l’hybridation in situ sur des échantillons de corail adultes qui ont été incorporés à la paraffine et sectionnés sur lames de verre. Il s’agit d’une méthode qualitative permettant de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN anti-sens dans les tissus inclus en paraffine.

Résumé

Les coraux sont des invertébrés océan important qui sont essentiels pour la santé globale de l’océan, mais aussi la santé humaine. Toutefois, en raison des impacts anthropiques tels que la hausse des températures de l’océan et l’acidification des Océans, les coraux sont plus en plus sous la menace. Pour relever ces défis, les progrès en biologie cellulaire et moléculaire ont prouvé très importante pour le diagnostic de la santé des coraux. Modifiant certaines des techniques couramment utilisés en médecine humaine pourrait améliorer considérablement la capacité des chercheurs pour traiter et sauver les coraux. Pour y remédier, un protocole pour l’hybridation in situ , utilisé principalement pour la médecine humaine et biologie évolutive du développement a été adapté pour une utilisation chez les adultes coraux sous contrainte.

Le but de cette méthode est de visualiser l’expression spatiale d’une sonde d’ARN dans le tissu corail adulte qui a été incorporé à la paraffine et sectionné sur lames de verre. Cette méthode met l’accent sur l’élimination de la paraffine et la réhydratation de l’échantillon, le prétraitement de l’échantillon afin d’assurer la perméabilité de l’échantillon, hybridation pré incubation, hybridation de la sonde d’ARN et la visualisation de la sonde d’ARN. Il s’agit d’une méthode puissante lors de l’utilisation des organismes non-modèles à découvrir où certains gènes sont exprimés, et le protocole peut être facilement adapté pour d’autres organismes non-modèle. Toutefois, la méthode est limitée car il s’agit avant tout qualitative, parce que l’intensité de l’expression peut varier selon la quantité de temps utilisé lors de l’étape de visualisation et de la concentration de la sonde. En outre, la patience est nécessaire, comme ce protocole peut prendre jusqu'à 5 jours (et dans bien des cas, plus longtemps), selon la sonde utilisée. Enfin, la coloration de fond non spécifique est commune, mais cette limitation peut être surmontée.

Introduction

Les coraux sont des bâtisseurs de l’écosystème critique et important pour la biodiversité dans l’océan et la santé humaine^1,2,3. Ils sont menacés en raison des changements climatiques et autres facteurs de stress anthropiques, et nombreuses espèces de coraux sont considérés comme en danger critique d’extinction. Ainsi, il y a un besoin important pour des outils moléculaires et cellulaires diagnostiquer les coraux sous contrainte. En outre, il est peu compris sur où sont expriment des gènes dans le tissu corail adulte et donc peu de compréhension des fonctions de ces gènes. Pour résoudre ce problème, nous avons adapté le protocole de hybridation (ISH) in situ , couramment utilisé en médecine humaine et biologie évolutive du développement, pour une utilisation sur des échantillons de tissus inclus en paraffine de coraux adultes. Cette technique est plus performant lorsqu’il est utilisé sur des coraux adultes ayant subi un événement stressant, comme l’exposition au stress thermique. Cependant, cette technique peut être utilisée sur une large gamme de tissus et les étapes de la vie chez les coraux et n’est pas limitée à la seule chaleur coraux^4,6,7. En outre, cette technique peut servir sur des tissus ou des cellules de n’importe quel métazoaires tant que les informations de séquence d’ADNc est disponible.

Le but de cette méthode consiste à visualiser les sondes d’ARN au sein du tissu corail adulte qui a été préservé et incorporé à la paraffine et sectionné sur glissières. Cette méthode est un outil de diagnostic puissant qui permet la visualisation des acides nucléiques dans le tissu corail adult. Initialement, cette méthode a été développée pour le diagnostic médical, et c’est désormais un outil populaire dans des domaines comme la biologie du développement et de la biologie évolutive du développement^8,9,10. ISH est également une méthode critique, particulièrement dans les systèmes non-modèle, lorsque génomique et transcriptomique séquence des données sont disponibles, mais profils d’expression génique spatiale sont inconnus. Pour le travail de diagnostic dans les systèmes non-modèle, cette technique est puissante car il peut indiquer quelles cellules et des tissus exprimant un gène d’intérêt et peuvent conduire à plusieurs approches thérapeutiques ciblées^{8,9,10, 11,12}. Enfin, cette technique est qualitative et plus puissant lorsqu’il est associé avec quantitative gene expression données¹¹.

L’approche décrite dans cet article seront d’intérêt pour les chercheurs qui ont déjà conçu un digoxigénine (DIG)-étiqueté sonde d’ARN (les sens et antisens sondes) et sont maintenant prêts à effectuer l’hybridation in situ des sondes à un échantillon. Pour exécuter cette méthode, deux coupes sériées d’un tissu de paraffine corail seront nécessaire pour chaque sonde mis à l’essai. Une section servira pour la sonde de sens et l’autre pour la sonde antisense. La sonde de sens sera un contrôle pour indiquer les liaisons non spécifiques. Si la coloration est observée au niveau de la sonde de sens, puis la sonde antisense n’est pas spécifique à l’ARN d’intérêt. Sondes peuvent être conçus pour n’importe quel gène exprimé. Dans ce protocole, plusieurs exemples sont utilisés qui ont été précédemment trouvés à s’exprimer au cours d’un stress thermique chez les coraux : FBJ ostéosarcome murine homologue viral oncogene B (Fos-B), protéine activatrice (AP1) et le Tumor necrosis factor receptor 41 (41 TNFR)¹¹. ISH, à l’aide de sondes d’ARN creuser-étiquetée est préférable à l’aide de sondes radioactives, parce que leur manipulation est beaucoup plus sûr¹⁰. En outre, cette technique est très sensible et peut être réalisée sur une large gamme de tissus et d’embryons au-delà de chaleur des coraux adultes^13,14,15,16.

Protocole

1. enlèvement de paraffine

ATTENTION : Effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante.

1. Déparaffinage les coupes minces paraffine diapositives avec 100 % de xylène sous le capot en bocaux de verre Coplin pendant 10 min. Ne pas utiliser de pots Coplin, que xylène fond plastique. Stériliser les bocaux de Coplin dans un autoclave avant utilisation.
2. Préparer quatre pots de Coplin de verre stériles par ce qui suit : 100 % éthanol, éthanol à 80 %, éthanol à 70 % et 60 % d’éthanol. Diluer l’éthanol avec de l’eau exempte de RNase.
   1. Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec 100 % d’éthanol et trempez-les pendant 10 min. Après 10 min, vider la coloration du verre et remplacer par la nouvelle 100 % d’éthanol. Faire tremper les diapositives à nouveau pendant 10 min.
   2. Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec l’éthanol à 80 % pendant 1 min.
   3. Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec l’éthanol à 70 % pendant 1 min.
   4. Transférer les lames à la coloration de verre stériles avec l’éthanol à 60 % pendant 1 min.

2. un pré-traitement des diapositives pour la préparation de l’hybridation de la sonde d’ARN

1. Effectuer les lavages suivants à température ambiante, sauf indication contraire. Effectuer des lavages de la température ambiante dans un agitateur orbital à une vitesse lente. Utilisez les expéditeurs lame stérile avec la pièce pour jusqu'à cinq diapositives pour le lavage des diapositives.
2. Transférer les lames à un expéditeur de lame stérile avec 18 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laver pendant 5 min à température ambiante.
3. Décanter la solution de PBS 1 x et immédiatement traiter le tissu sur les diapositives avec la protéinase K pour permettre la pénétration de la sonde du tissu. Ajouter environ 18 mL de solution de protéinase K à l’expéditeur de diapositive (voir le tableau 1 pour travailler la concentration de la solution). Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Ne secouez pas.
   1. Pendant ce temps les diapositives sont en incubation, préparez le pré-hybridation buffer (tampon de Prehybe). Placer le tampon Prehybe dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min, puis laissez refroidir sur un bain de glace pendant 5 min. Pour une recette de Prehybe tampon, voir le tableau 1.
   2. Arrêter la digestion de la réaction de la protéinase K en versant la solution de protéinase K et ajouter immédiatement 18 mL de solution de glycine-PBS de 0,2 % à l’expéditeur de la diapositive. Laisser le mailer diapositive à température ambiante pendant 5 min.
   3. Versez la solution de glycine-PBS de 0,2 %, ajouter 18 mL de solution de citrate de sodium salin (SSC) x 2 à chaque expéditeur de diapositive. Laver les diapositives dans les 2 x SSC pendant 10 min à température ambiante, en agitant à 100-150 tr/min.

3. prehybridization de diapositives en préparation pour l’hybridation de la sonde d’ARN

1. Alors que les diapositives sont à laver avec 2 x SSC, obtenir un nouveau mailer Lame stérile et mettre environ 18 mL de tampon de Prehybe dans l’enveloppe de la diapositive. Placez l’enveloppe à glisser dans le four à hybridation à température d’hybridation.
   Remarque : La température d’hybridation dépendra de la sonde utilisée habituellement varie entre 50-60 ° C.
2. Une fois le lavage x SSC 2 est terminée, versez le 2 x SSC et place la glisse dans l’enveloppe à glissière dans le tampon de Prehybe dans le four à hybridation pendant 1 h.

4. l’hybridation de la sonde de l’ARN

1. Tandis que les lames sont en incubation avec le tampon de Prehybe dans le four de l’hybridation, préparer la solution d’hybridation-sonde.
   1. Diluer chaque sonde dans un tampon d’hybridation (0,5 µL de sonde avec 24,5 µL de tampon d’hybridation).
      NOTE : La recette du tampon d’hybridation se trouve dans le tableau 1. On trouvera un exemple de préparation de la sonde et des concentrations en Traylor-Knowles et coll. ¹¹.
   2. Placez la sonde diluée sur un bloc de chaleur 86-90 ° C pendant 12 min, puis laisser refroidir pendant 1 min sur la glace.
2. Retirer l’enveloppe à glissière du four hybridation et supprimer individuellement diapositives de la mailer de diapositive à l’aide de pinces stériles. Posez les lames plat sur une serviette en papier et essuyez soigneusement Prehybe excès de tampon dans les échantillons de tissus. Veillez à ne pas toucher les échantillons et le travail rapidement pour éviter le dessèchement des échantillons de tissus.
3. Encercler le tissu avec un stylo PAP. Appliquer 25 µL de solution diluée de sonde avec une pipette et couvrir l’échantillon avec une lamelle en plastique.
   1. Placer les échantillons dans la chambre de l’humidité de diapositive avec 4 x SSC + 50 % formamide solution dans le fond de la chambre.
   2. Une fois que les sondes ont été ajoutés à toutes les diapositives, placer la chambre de l’humidité de glisser dans le four à hybridation pendant au moins 24 h à une température d’hybridation de 50-60 ° C. Le temps d’incubation peut varier en fonction de la concentration de la sonde, mais doit être pendant au moins 24 heures.
4. Après une nuit d’incubation avec les sondes dilués, retirer la chambre de l’humidité de diapositive du four de l’hybridation.
   1. Supprimer des lamelles couvre-objet de chacune des diapositives, en veillant à ne pas déplacer le tissu. Dans une pipette de 1000 µL, ajouter 1000 µL de solution de 2 x SSC et laver doucement la lame.
   2. Placez la diapositive dans une enveloppe de lame stérile avec 18 mL de solution de x SSC 2 pendant 5 min à température ambiante. Versez la solution et le remplacer par 18 mL de fresh 2 x SSC. Répéter l’incubation pendant 5 min à température ambiante avec agitant doucement.
   3. Versez la solution de x SSC 2. Ajouter 18 mL de solution x SSC 1et lavage pendant 5 min à température ambiante. Versez la solution de x SSC 1 et remplacez-le par 18 mL de frais 1 x SSC. Répétez l’incubation pendant 5 min à température ambiante avec agitant doucement.
   4. Versez le 1 x SSC. Ajouter 18 mL de 0,5 x SSC et lavage pendant 10 min à 42 ° C sans agitation. Versez le 0.5 x SSC et remplacer avec 18 mL de frais 0,5 x SSC. Lavez à nouveau pendant 10 min à 42 ° C sans agitation.

5. visualisation de la sonde de l’ARN

Remarque : Pour la visualisation de la sonde, purple BM sera utilisé au cours du processus de développement. Cependant, avant cette étape, plusieurs lavages sont nécessaires pour préparer les échantillons pour la coloration.

1. Laver les lames avec 18 mL de tampon de la phosphatase alcaline (AP-tampon) sans MgCl₂ pendant 1 min. Versez le tampon sans MgCl₂AP et ajouter 18 mL de tampon de blocage 1 x Boehringer-Mannheim dilué avec de l’acide maléique tampon. Incuber pendant au moins 1 h à température ambiante dans une enveloppe de diapositive avec agitant doucement.
   NOTE : Le buffer blocage Boehringer-Mannheim et l’acide maléique utilisés ont été prédéfinis et achetés dans le lavage de la fouille et le bloc Buffer Set (disponible dans le commerce).
   1. Alternativement, l’incubation durant la nuit à 4 ° C peut être effectuée. Une période de plus de blocage permettent de réduire l’apparition de liaisons non spécifiques.
2. Préparer le 20 mL de fragments Fab d’anti-digoxigénine-AP DIG dilués (anticorps anti-DIG = 2 µL d’anticorps anti-DIG + 20 mL 1 x tampon de blocage de Boehringer-Mannheim). C’est assez pour une utilisation dans 1 mailer de lame en plastique. Plus de cette solution doivent être préparée si plus d’un expéditeur de diapositive doit être utilisé.
3. Ajouter l’anticorps anti-creuser à un nouvel expéditeur lame stérile et transférer les lames à l’expéditeur de la diapositive avec la solution d’anticorps anti-DIG. Incuber à température ambiante pendant 3 h avec agitant doucement.
4. Après incubation, versez l’anticorps anti-creuser, laver la glisse dans l’enveloppe à glissière avec 18 mL de tampon de AP sans MgCl₂ pendant 5 min avec agitant doucement.
5. Versez le tampon sans MgCl_2, AP, ajouter 18 mL de tampon de AP. Laver pendant 5 min avec agitant doucement. Après l’incubation de 5 min, videz la mémoire tampon d’AP, remplacez-le par 18 mL de tampon AP frais et laver pendant 5 min avec agitant doucement.
6. Dans l’obscurité, videz la mémoire tampon d’AP et ajouter 18 mL de BM pourpre à l’expéditeur de la diapositive. Incuber les lames dans l’obscurité à température ambiante, recherchant les développement de couleur pourpre que variera chaque ½ h. des temps de réaction pour la visualisation basées sur la sonde qui est en cours d’élaboration.
   NOTE : Au lieu de visualisation BM pourpre, solution de développement peut être faite à l’aide de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (CBPI) et nitrobleu de tétrazolium (NBT). Pour obtenir des instructions, voir le tableau 1 .
7. Arrêter le développement de la couleur en transférant les diapositives à un nouvel expéditeur lame stérile avec 18 mL de tampon Tris-EDTA (TE) pendant 5 min à température ambiante, dans l’obscurité.
8. Videz la mémoire tampon TE et ajouter 18 mL d’eau exempte de RNase au mailer diapositive et lavage pendant 1 min, dans l’obscurité.
9. Enlever les lames de l’eau et les faire sécher sur les bords du tissu. Ajouter glycérol Montage support et placez les lamelles. Entreposer les lames à 4 ° C jusqu'à ce que les photos sont prêts à prendre.

Résultats

À l’issue de ce protocole, l’identification des cellules et des tissus qui expriment la sonde de l’ARN d’intérêt se réalisera. Les résultats représentatifs de ce protocole sont pour AP-1, OSF et TNFR41. Ces résultats, publiés précédemment par Traylor-Knowles et coll. ¹¹, spectacle expression spatiale de l’ARN sondes sur des coraux adultes qui ont été exposés au stress thermique. Deux exemples de différents types de coloration sont p...

Discussion

La méthode décrite dans le présent protocole a été modifiée à partir de travaux antérieurs dans la recherche médicale et évolutive du développement^8,9,10,12,17. Ce protocole met l’accent sur les nuances d’une hybridation in situ avec une sonde d’anti-sens RNA creuser-étiquetés sur les coraux adultes, qui ont été préservés et int...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Denhardt's solution	Affymetrix	70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
Slide mailers	Fisher	12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer	Fisher	50-198-724
50 mL Falcon tubes	Fisher	14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Invitrogen	AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL	Invitrogen	10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution	Invitrogen	15632-011
Slide white apex superior adhesive	Leica Biosystems	3800080
PBS solution, pH 7.4	Life Technologies	10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL	New England Biolabs	P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker	Promega	22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments	Roche	11093274910
BM Purple, 100 mL	Roche	11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set	Roche	11585762001
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size	Sigma-Aldrich	252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration	Sigma-Aldrich	S6639-1L
Acetic Anhydride	Sigma-Aldrich	320102-100ML
Formamide	Sigma-Aldrich	47670-250ML-F
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use	VWR	MK866806
Ethanol	VWR	EM-EX0276-4S
TE buffer	VWR	PAV6232
hybridization oven	VWR	97005-252, 97005-254
Orbital shaker	VWR	89032-088