الثقافة وتعداء الخلايا الابتدائية الزرد

Summary

نقدم بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام لإعداد الثقافات الخلية الابتدائية الأجنة الزرد تعداء وتصوير الخلايا الحية، فضلا عن بروتوكول لإعداد الخلايا الأولية من الدماغ الزرد الكبار.

Abstract

وتتطور بسرعة خارج الأم، مما يسمح لتصوير ممتازة في فيفو للعمليات البيولوجية الحيوية في فقاريات سليمة والنامية الأجنة الزرد تتسم بالشفافية. ومع ذلك، تصوير مفصل مورفولوجيس من أنواع مختلفة من الخلايا والهياكل سوبسيلولار محدودة في يتصاعد كله. ولذلك، أنشأنا بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام للثقافة الحية الأولية الخلايا من الأجنة الزرد والأنسجة الكبار.

وباختصار، 2 أجنة الزرد إدارة الشرطة الاتحادية ديتشوريوناتيد، دييولكيد، تعقيم، وفصلها إلى الخلايا المفردة مع كولاجيناز. بعد خطوة ترشيح، هي الخلايا الأولية مطلي على الأطباق أسفل الزجاج والمزروعة لعدة أيام. يمكن استخدام الطازجة الثقافات، قدر طويل الأجل ديفيرينسياتيد منها، [كنفوكل] دراسات التصوير عالية الدقة. الثقافة تحتوي على أنواع الخلايا المختلفة، مع striated myocytes ويجري بارزة في طلاء بولي-L-يسين من الخلايا العصبية. على وجه التحديد تسمية الهياكل سوبسيلولار بالبروتينات علامة نيون، أنشأنا أيضا بروتوكولا انهانسر الذي يسمح تعداء بلازميد الحمض النووي إلى أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. وهكذا، حضور المشغل حوافز محددة وسلوك الخلية المعقدة، والديناميات داخل الخلية من الخلايا الأولية الزرد يمكن تقييم مع عالية الدقة المكانية والزمانية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام الدماغ الزرد الكبار، علينا أن نظهر أن الأسلوب وصف الانفصال، فضلا عن تثقيف الشروط الأساسية، تعمل أيضا للأنسجة الزرد الكبار.

Introduction

الزرد (دانيو rerio، ريريو دال) نموذج شعبية فقاريات للعديد من المجالات للبحوث الطبية الحيوية والأساسية¹. الزرد الأجنة تتطور بسرعة خارج الرحم، وتتسم بالشفافية، وتناسب تحت مجهر، وبالتالي توفير المتطلبات الأساسية ممتازة لدراسة تطوير الفقارية في حي. سبب الصوبة الوراثية لالزرد²، أنشئت خطوط مراسل المعدلة وراثيا مستقرة العديد من الخلية المحددة بنوع التعبير عن مختلف علامات مضيئة السماح لمراقبة السكان خلية معينة. المجتمع الزرد مجموعة متنوعة واسعة من ما يسمى خطوط Gal4--السائق الذي حمل التحوير الإعراب عن Kal4TA4 الاصطناعية (أو جالف ما يعادل KalTA3) الجينات مع المجال Gal4-الحمض النووي-ملزم للخميرة تنصهر فيها تفعيل الترانسكربتي الفيروسية المجالات الخاضعة للخلية المحددة بنوع معززات. وعبرت هذه الخطوط برنامج تشغيل لخطوط المستجيب التي تحمل المتسلسلات تتألف من معرفة المنبع تفعيل تسلسل (UAS) تنصهر فيها جين مراسل. بروتين Kal4TA4 يربط عنصر UAS، وبالتالي تنشيط الخلية التعبير نوع الجنين من^3،4الجينات مراسل. ويسمح هذا النهج للدراسات اندماجي شديدة التنوع من تقريبا جميع العناصر المتاحة محسن ومراسل في الحيوانات المحورة وراثيا مزدوجة.

ومع ذلك، محدودة تصوير حية متعمقة مع التركيز على خلايا فردية أو محتوياتها سوبسيلولار في جنينا كامل والمتغيرة باستمرار. ولمعالجة المسائل البيولوجية خلية محددة بدقة أعلى، غالباً ما الأفضل استخدام الثقافات الخلية. توجد بعض خطوط الخلايا من الزرد، ولكن تعتبر بشكل كبير المحدد^5،،من⁶⁷ وما نشر في كثير من الأحيان مضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، جميع خطوط الخلية المتوفرة هي تنتجها الخلايا الليفية المشتقة، يحد من تجارب باستخدام زراعة الخلايا إلى نوع واحد من الخلايا. لذلك، أنشأنا بروتوكولا فعالة وسهلة الاستخدام لإعداد الخلايا الابتدائية مباشرة من الدماغ الكبار الزرد، جنبا إلى جنب مع اتباع نهج لزيادة طول عمر الثقافة وتوسيع تنوع المزروعة والأجنة الزرد أنواع الخلايا. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم إجراء ترانسفيكت الخلايا الجنينية الأولية مع ثوابت التعبير عن علامات عضية الفلورسنت. وهكذا، يمكن تحليل مورفولوجيس الخلوية وهياكل سوبسيلولار مع عالية الدقة المكانية والزمانية في أنواع الخلايا المتميزة التي تحتفظ بملامحها الرئيسية.

Protocol

جميع أعمال الحيوان الموصوف هنا وفقا للوائح القانونية (الاتحاد الأوروبي-2010 التوجيه/63). صيانة ومناولة الأسماك قد تم وافقت عليها السلطات المحلية ورعاية الحيوان الممثل في "جامعة براونشفايغ للتكنولوجيا" و "انخفاض ساكسونيا الدولة مكتب لحماية المستهلك" و "سلامة الأغذية" (لافيس، أولدنبورغ، ألمانيا؛ بكالوريوس (02.05) تشب تو تصديرها من الألف إلى الياء.).

1-إعداد الخلايا الأولية من الأجنة الزرد

1. إعداد 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) الأجنة الزرد
   1. يوم 1: إعداد معابر عدة من سلالة الزرد الاختيار ووفقا للمواصفات الخاصة بك مدير مرفق الزرد⁸.
   2. يوم 2: رفيقه الأسماك وجمع البيض⁸ مباشرة بعد التفريخ في 10 سم طبق بتري (البلاستيك). إزالة البيض الميت أو الملوثة مع ماصة باستور (البلاستيك). أغسل البيض س 1 مع دانيو 30 في المائة (5.8 مم كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 0.07 مم، سلفات المغنزيوم 0.04 مم، نترات الكالسيوم 0.06 مم، حمض 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2)⁸ مع أزرق الميثيلين 0.0001% (w/v). تبادل على المديين المتوسط ودانو 30% دون الميثيلين الأزرق، منذ الميثيلين الأزرق قد يسبب أوتوفلوريسسينسي، واحتضان البيض طوال الليل في 28 درجة مئوية.
      ملاحظة: تبدأ بحد أدنى من 100 بيضة في خط الأسماك بغية الحصول على كمية كافية من الخلايا. ولم تثر الأجنة أكثر من 150 في طبق بتري واحد.
   3. يوم 3: إزالة أجنة ميتة أو ملوثة وتبادل على المديين المتوسط ودانو 30%. تحديد عدد الأجنة عن طريق العد. تبني الأجنة طوال الليل في 28 درجة مئوية.
      ملاحظة: عند استخدام خط المعدلة وراثيا معربا عن مراسل فلورسنت، قد يكون الفحص في إدارة الشرطة الاتحادية 1 أو 2 إدارة الشرطة الاتحادية اللازمة.
      ملاحظة: للحصول على كميات أكبر من الأجنة، من المستحسن أن تتخذ صورة أبيض وأسود لكل منهما طبق بتري (الشكل 1A) وتحديد عدد الأجنة مع برنامج تصوير.
   4. يوم 4: الأجنة هي الآن 2 إدارة الشرطة الاتحادية. لإزالة تشوريونس وإضافة برنس 1 مل بتركيز 1 ملغ/مل 10 مل من دانو 30%⁸ واحتضان الأجنة في شاكر في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تشوريونس كل فصل (20-40 دقيقة حسب درجة الحرارة المحيطة). أغسل مع دانو 30% إزالة كل من برنس وتشوريونس والحفاظ على الأجنة في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها مرة أخرى.
2. إعداد أطباق أسفل زجاج مصقول بولي-L-يسين القابل لإعادة الاستخدام
   ملاحظة: الزجاج المتاحة تجارياً أسفل الأطباق مصممة لاستخدام واحد فقط وهي مكلفة. يصف الإجراء التالي كيفية إعداد أطباق أسفل الزجاج عصامي القابل لإعادة الاستخدام من مواد المختبر القياسية.
   1. حفر حفرة قطرها 10 مم في الجزء السفلي من الخلية القياسية ثقافة الأطباق (قطر 6 سم، بلاستيكية) (الشكل 1B). أغسل القيعان الطبق جيدا بماء الصنبور لإزالة الغبار الحفر.
   2. انتشار الشحوم سيليكون حول الثقب في الجانب السفلي قيعان طبق وإرفاق ساترة استخدام الشحوم كالغراء. تأكد من أن الشحوم الأختام الفجوة بين أسفل الطبق وساترة.
      ملاحظة: تأكد من أن سمك كوفيرسليبس المستخدمة مناسبة للتطبيق في وقت لاحق من التصوير.
   3. غسل الأطباق أسفل الزجاج عصامي تماما، ولكن بعناية، مع الاستفادة من المياه الباردة والصابون. شطف الزجاج أسفل الأطباق ثلاث مرات مع المياه لإزالة الصابون. أيردري أغطية طبق وطبق القيعان وتخزينها في علبة نظيفة حتى استخدامها مرة أخرى.
   4. في اليوم لإعداد الثقافة (يوم 4، انظر 1.1.4): ترطيب داخل كل طبق الأغطية وطبق قيعان مع الإيثانول 70% (v/v). ضع الصحن الأغطية وطبق القيعان مواجهة الجانب الداخلي في هيئة عمل عقيمة مع الاندفاق الصفحي وضوء الأشعة فوق البنفسجية. أيردري حتى يتبخر في الإيثانول، ثم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 20 دقيقة. بعد هذا العلاج، تجميع الأطباق ويعتبر معقم.
   5. لطلاء، "الماصة؛" 200 ميليلتر من بولي-L-يسين (0.1 مغ/مل) في وسط كل طبق أسفل الزجاج وانتشار السائل على ساترة عن طريق كسر التوتر السطحي مع تلميح ماصة. واسمحوا جافة لمدة 60 دقيقة، ثم يغسل x 1 مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). إزالة السائل. تبقى الأطباق تحت مقاعد البدلاء حتى استخدامها مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن اختبار الدهانات الأخرى تبعاً للهدف من هذه التجربة. وجدنا بولي-L-يسين كافية لدعم نمو الخلايا العصبية، بينما تعامل البلاستيك دون أي طلاء إضافية ملائمة لنمو الخلايا مثل تنتجها الخلايا الليفية (الشكل 1E، و) على ما يبدو.
      ملاحظة: يمكن استخدام الزجاج عصامي أسفل الأطباق مرات عديدة. لتبادل ساترة، تغسل بماء الصنبور الحار وعناية فصل ساترة وإزالة الشحوم المتبقية مع الإيثانول 70% (v/v) والصابون.
3. إعداد وطلاء الخلايا الأولية
   1. في اليوم لإعداد الثقافة (يوم 4، انظر 1.1.4): نقل الأجنة إلى طبق ثقافة خلية عقيمة (قطرها 6 سم) باستخدام ماصة باستور جديدة بلاستيكية. إزالة السائل المجوعات حتى جمعت جميع الأجنة في قطره كبيرة قطرها حوالي 2 سم أو أقل.
   2. ضع الطبق مع الأجنة في مقاعد البدلاء عمل عقيم وإضافة CO₂-المتوسطة مستقلة (تستكمل مع 10% (v/v) filtrated المصل البقري، 1 x الجلوتامين و 1.2% (v/v) 10,000 يو البنسلين-ستربتوميسين؛ المتوسطة مع جميع الملاحق في ما يلي يشار إلى "خلية الثقافة المتوسطة") حتى يصبح الطبق مملوءة إلى النصف.
      ملاحظة: بدائل CO₂-يمكن اختبار المتوسطة مستقلة تبعاً للهدف من هذه التجربة، على سبيل المثال نيوروباسال المتوسطة أو المتوسطة دميم أو المتوسطة L-15 ليبوفيتش في. CO₂-المستقلة المتوسطة والمتوسطة L-15 ليبوفيتش الذي لديها ميزة لا تتطلب من حاضنة₂ CO.
   3. لإزالة صفار البيض، "الماصة؛" الأجنة صعودا وهبوطاً باستخدام تلميح 200 ميليلتر-ماصة. يمكن التعرف على دييولكينج الناجح قبل تلقي بظلالها على المتوسط.
   4. ملء طبق ثقافة خلية مع الإيثانول 70% (v/v) وآخر طبق ثقافة الخلية مع خلية جديدة الثقافة المتوسطة. استخدام تلميح ميليلتر ماصة وقف 1,000 لنقل الأجنة إلى مصفاة خلية عقيمة مع مؤشر (40 ميكرومتر؛ الشكل 1). تأخذ المصفاة بالمقبض وتراجع ذلك في الطبق مع الإيثانول حيث أن جميع الأجنة مغمورة ل 5 س فورا بعد ذلك، تغرق في المصفاة مع الأجنة في الطبق مع خلية جديدة الثقافة المتوسطة.
      ملاحظة: مصافي خلية يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. تنظيف بفرشاة ناعمة تحت تشغيل مياه الحنفية والمتجر بهم في الإيثانول 70%، والجافة والأشعة فوق البنفسجية-علاج لهم في إطار عمل عقيم مقاعد البدلاء مباشرة قبل الاستخدام (انظر أيضا 1.2.4).
   5. نقل الأجنة في معقم 1.5 مل رد فعل أنابيب (حوالي 100 الأجنة في أنبوبة واحدة). إضافة كولاجيناز (النوع 2) المخفف في خلية ثقافة المتوسطة إلى تركيز نهائي 4 مغ/مل في إجمالي حجم 1 مل. احتضان أنابيب مع الأجنة في دوار أنبوب عمودي مع 30 ثورات لكل دقيقة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   6. ننأى بكتل الخلايا المتبقية من بيبيتينج الخليط الجنين-كولاجيناز صعودا وهبوطاً مع تلميح 1,000 ميليلتر-ماصة. قم بتصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية عقيمة مع فتحه التنفيس (40 ميكرومتر؛ الشكل 1) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف في المصفاة مع حوالي 10 مل من خلية جديدة الثقافة المتوسطة.
   7. بيليه الخلايا بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 180 x ز. بيليه قد تكون غير مرئية تقريبا. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في خلية جديدة ميليلتر 200 الثقافة المتوسطة الواحدة والأجنة المستخدمة أصلاً 30.
      ملاحظة: للحصول على بيليه مرئية، ينصح أن تبدأ مع الحد ني أجنة 100.
   8. "الماصة؛" ميليلتر 200 تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.7 مباشرة في مجال الزجاج طبق أسفل الزجاج عصامي بولي-L-يسين-المغلفة (انظر 1-2). احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت مقاعد البدلاء العمل العقيمة. إضافة 6 مل مستنبت الخلية الطازجة واحتضان الخلايا الأولية عند 28 درجة مئوية.
   9. أداء التطبيق التصوير المطلوب باستخدام مجهر مقلوب عند 28 درجة مئوية. تبادل مستنبت الخلية يوميا. يمكن استخدام الثقافات للتصوير لعدة أيام بعد الطلاء (حزب العمل الديمقراطي).

رقم 1: زراعة الخلايا الابتدائية للأجنة الزرد. (أ) صورة أبيض وأسود 1 حزب العمل الديمقراطي للأجنة، التي يمكن معالجتها بواسطة أداة حاسوبية لتحليل عدد الأجنة. (ب) خلية ثقافة الأطباق (قطرها 6 سم) مع وجود ثقب حفر (قطرها 10 ملم) تستخدم لإعداد أطباق أسفل الزجاج عصامي القابل لإعادة الاستخدام. (ج) تستخدم مصافي الخلية (40 ميكرومتر) مع مؤشر بسيط كشبكات "الهبوط" تراجع دييولكيد الأجنة في الإيثانول ونقلها بسرعة إلى خلية جديدة الثقافة المتوسطة. (د) خلية تستخدم مصافي (40 ميكرومتر) مع فتحات تهوية لتصفية الخلايا بعد الانفصال كولاجيناز بوساطة. (ه) بعد 5 حزب العمل الديمقراطي، المصنف الخلايا الأولية على الزجاج مغلفة ببولي-L-يسين أساسا شكل الخلايا العصبية مع ملحقات وضوحاً. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (و) بعد 5 حزب العمل الديمقراطي على البلاستيك المعالجة دون خلايا الطلاء، تنتجها الخلايا الليفية مثل كسا الثقافة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) و (و) تم الحصول عليها من قبل مجهر ابيفلوريسسينت. (ز) صورة الخفيفة المنقولة من الخلايا الأولية المستمدة من الزرد نوع البرية في 1 حزب العمل الديمقراطي. يمكن بسهولة ملاحظة striated myocytes ومجموعات من الخلايا العصبية توسيع العمليات رقيقة. شريط المقياس = الخلايا المستزرعة 50 ميكرومتر. (ح) السطر المعدلة وراثيا تيراغرام (ptf1a: اجفب) jh1، التي تعرب عن اجفب في المتكفل العصبية معظمهم جابايرجيك الخلايا العصبية في هيندبرين ومجموعة فرعية من الخلية الشبكية السكان^{29، 30 , 31}-شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (ز) و (ح) تم الحصول عليها بليزر [كنفوكل] المسح مجهر استخدام الأطباق أسفل الزجاج كما هو موضح في (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2-تعداء الابتدائية الخلايا مع بلازميد الحمض النووي

1. فيلتراتيد ريسوسبيند والأعلاف الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.7 في برنامج تلفزيوني 1 x بدلاً من خلية الثقافة المتوسطة. وصمة عار قاسمة تعليق خلية مع تريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا في دائرة عد⁹.
2. مزيج الخلايا 0.5 مليون مع 10 ميكروغرام نقية فائقة بلازميد الحمض النووي في أنبوب رد فعل 1.5 مل وضبط الحجم الكلي إلى 100 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني 1 x.
   ملاحظة: لتجاربنا، استخدمنا أساسا بنيات التعبير استناداً إلى بلازميد pCS2 +¹⁰. تعبير عن القراءة فتح إطارات المستنسخة في موقع الاستنساخ متعددة من pCS2 + تحركها مروج الفيروس المضخم للخلايا البشرية (مروج CMV) في كل مكان. قد يكون اختبار أخرى التعبير بنيات والمروجين (انظر أيضا نتائج الممثل و الشكل 2 و الشكل 3).
3. ميكس نقل الخلية-الحمض النووي فورا إلى ومبومو انهانسر (0.4 سم)، مكان في ومبومو في الجهاز انهانسر واليكتروبوراتي مع الإعدادات التالية: نبض مرة واحدة، وتحلل أسي، 280 الخامس، 950 µF.
4. مباشرة بعد انهانسر، نقل مزيج الحمض النووي الخلية في أنبوب 1.5 مل رد فعل مع 300 ميليلتر من مستنبت خلايا جديدة.
5. لوحة 200 ميليلتر من تعليق خلية كما هو موضح في 1.3.8 والمضي قدما كما هو موضح في 1.3.9 اعتماداً على بنية التعبير المستخدمة، قد يكون تعبير بروتينات الفلورية يمكن اكتشافها بعد بضع ساعات أو في اليوم التالي.

3-تلطيخ الخلايا الأولية الثابتة

ملاحظة: هياكل سوبسيلولار يمكن أيضا تصور طريق immunostaining الكلاسيكية بدلاً من استخدام الصحفيين البروتين الانصهار الفلورسنت. للخلايا الابتدائية الزرد، نحن نستخدم بروتوكول القياسية التالية نواة وصمة عار المثالية، واكتين و tubulin أسيتيلاتيد مع علامات مضيئة.

1. وضع لوحة الخلايا في بولي-L-يسين المغلفة بغطاء كشوف في لوحة صحن أو مولتيويل ثقافة خلية كما هو موضح أعلاه (انظر 1.3.8).
2. لتحديد، إزالة المتوسطة وتغطي الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني x 1. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر. أغسل الخلايا x 3 ل 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن برنامج تلفزيوني 1 x يغطي الخلايا تماما ونفذ الخطوات الغسيل على شاكر.
3. لمنع وبيرميبيليزي الخلايا الثابتة، وتغطي الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x التي تحتوي على اللبن المقشود 5% و 0.3% X-100 تريتون. مكان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر. تغسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
4. لتسمية توبولين أسيتيلاتيد، تمييع علامة لمحاور عصبية¹¹، 1:2,000 جسم الأولية في 1 x PBS المحتوية على اللبن المقشود 1%. تغطية الخلايا مع هذا الحل واحتضانها لهم طوال الليل في 4 درجات مئوية على شاكر. وفي اليوم التالي، غسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
5. تضعف جسم الثانوي مترافق مع فلوروتشروم الأخضر fluorescein isothiocyanate (فيتك) 1: 100 في برنامج تلفزيوني 1 x التي تحتوي على اللبن المقشود 1% واحتضان الخلايا مع هذا الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام (تغطي طبق مثلاً مع مربع أو رقائق الألومنيوم) في شاكر. تغسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
6. لوصمة عار في نفس الوقت cytoskeleton أكتين ونوى، الخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x وتستكمل مع فالويدين¹² مترافق مع فلوروتشرومي أحمر (01:50) 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)¹³ (100 نانوغرام/مل) لمدة 10 دقائق في غرفة واحتضان درجة الحرارة في الظلام على شاكر. تغسل الخلايا كما هو موضح في 3.2.
7. لإعداد الخلايا للتصوير، وضع ناقل زجاج كائن (مجهر الشريحة) على سطح نظيف ومكان على قطره متوسطة المتصاعدة على ذلك. تأخذ بكشف الغطاء مع الخلايا الثابتة والملون من طبق استخدام الملقط ووضعه على القطرة مع الخلايا التي تواجه الناقل الكائن. تأكد من أن تلك الوسيلة تصاعد ينتشر في المنطقة كلها من كشف الغطاء. الجافة في الظلام.
8. مخزن ثابت وتركيبة الخلايا في الظلام في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ التطبيق التصوير المطلوب.

رقم 2: بنيات تعداء للتعبير انهانسر- (أ) العصبية Putative transfected مع أجهزة الكمبيوتر--اجفب في 1 حزب العمل الديمقراطي. (ب) Striated ميوسيتي (2 سماد) التعبير عن البروتين المستهدفة هيولى ss-RFP-KDEL. (ج) اثنين من الخلايا العصبية داخل كتلة الخلايا العصبية transfected مع أجهزة الكمبيوتر-ميتوتاج-يفب في 2 حزب العمل الديمقراطي. (د) خلية (حزب العمل الديمقراطي 2) ثلاثية transfected مع أجهزة الكمبيوتر-DCX-تدتوماتو، يفب-ميتوتاج--أجهزة الكمبيوتر وأجهزة الكمبيوتر-H2B-مسيكفب. (ﻫ) pSK-اليكتروبوراتيد UAS:mCherry في الخلايا الأولية (حزب العمل الديمقراطي 1) المستمدة من الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحمل المتسلسلات تيراغرام (atoh1a: Gal4TA4) hzm2²² وتيراغرام (4xUAS:KGFPGI) hzm3³² أسفر عن تعبير بروتينات فلورية خضراء في الخلايا العصبية موروث من هيندبرين. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. (ألف-هاء) اقتنيت بليزر [كنفوكل] الفحص المجهري باستخدام الأطباق أسفل الزجاج كما هو موضح في الشكل 1 باء. (و) الفلورسنت تلطيخ الخلايا العصبية الأولية الزرد الثابتة في 5 حزب العمل الديمقراطي. الأزرق: DAPI (نواة)؛ الأحمر: فالويدين (واكتين)؛ الأخضر: أسيتيلاتيد توبولين (الخلايا العصبية). شريط المقياس = 10 ميكرون. (ز) العصبية مثل الخلية transfected مع أجهزة الكمبيوتر--مكلوفير. 2 حزب العمل الديمقراطي، أي ملحق مرئياً. 5 حزب العمل الديمقراطي، وشكلت بنية تشبه نورت. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ح) العصبية من إعداد نفسها بوصفها الخلية (F)، محاطة بالخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية. شريط المقياس = 10 ميكرون. (أنا) العصبية المستمدة من جنينا المحورة وراثيا تحمل التحوير تيراغرام (إكسيتوب: دسريد) zf148²⁸ transfected مع أجهزة الكمبيوتر--مكلوفير. بين 12 و 15 مديرية إدارة السجون، والخضوع نيوريتيس تنكس ضخمة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الخلايا تظهر في (و--أنا) كانت تبذر في بولي-L-يسين المغلفة الزجاج (و، ح) أو البلاستيك (ز، أنا)، يزرع في المتوسط L-15 حضور 10% فيلتراتيد المصل البقري الملحق العصبية B-27 (المخفف 01:50) وتصويرها مجهر ابيفلوريسسينت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-إعداد الخلايا الأولية من الكبار الزرد الدماغ

1. استخراج الدماغ
   1. حدد أسماك الكبار لمدة 90 يوما على الأقل من العمر. إذا كان مطلوباً العمل مع نوع خلية محددة، اختر خط المعدلة وراثيا التي تسمح التعبير مراسل الفلورسنت الخاصة بخلية لتصور الخلايا المطلوب.
   2. ضع السمك في كوب مليئة 200 مل تريكايني مخدر⁸ (0.2 ٪) في دانيو 30%. انتظر حتى يتوقف الأسماك تتحرك. تزج السمك أنيسثيتيزيد في كوب مليء بالماء المثلج 200 مل لمدة 15 دقيقة euthanize أنها.
   3. ملء طبق بتري (قطرها 6 سم) مع الإيثانول 70% (v/v). عقد السمك من ذيله مع زوج من ملاقط وتراجع إلى الإيثانول. ضمان الأسماك هو مغمورة تماما في الإيثانول 5 s.
   4. استخراج المخ وفقا للبروتوكول غوبتا ومولينز¹⁴ مع أدابتيونس التالية: استخدام أدوات فقط يعقم أو معبأة العقيمة وتشريح الرأس في برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة.
   5. مباشرة بعد الاستخراج، ضع الدماغ في طبق بتري (قطرها 3 سم) مليئة ببرنامج تلفزيوني x 1 العقيمة وتحريك الطبق تحت منضدة عمل عقيمة لزراعة الخلايا.
2. الانفصال من الدماغ وطلاء الخلايا الأولية
   1. يحدد مكان اثنين من ملاقط معقمة (يعقم)، طبق بتري معقم (قطرها 6 سم) مليئة الإيثانول 70% (v/v)، طبق بتري معقم (قطرها 10 سم) مليئة المتوسطة L-15 ليبوفيتش لتستكمل مع 10% (v/v) filtrated المصل البقري، B-27 (01:50) و 1.2% (v/ v) 10,000 يو البنسلين-ستربتوميسين ومصفاة العقيمة خلية واحدة مع مؤشر (40 ميكرومتر؛ الشكل 1) تحت مقاعد البدلاء نظيفة.
   2. مكان مصفاة خلية في صحن بتري مليئة الإيثانول وضمان مستوى السائل أعلى من أسفل المصفاة 5 مم على الأقل.
   3. تستخدم المجموعة الأولى من ملاقط، نقل الدماغ في مصفاة وضعت بالفعل في الإيثانول وضمان أنه مغطى تماما بالسائل. بعد 1 ثانية، نقل المصفاة مع الدماغ في طبق بتري يحتوي على المتوسطة L-15 ليبوفيتش لما ورد أعلاه وصف المكملات الغذائية.
   4. استخدام المجموعة الثانية من ملاقط، نقل الدماغ في أنبوب رد فعل معقم 1.5 مل مليئة L-15 المتوسطة في 500 ميليلتر ليبوفيتش مع ما ورد أعلاه وصف المكملات الغذائية. إضافة كولاجيناز (نوع 2) بتركيز نهائي 4 مغ/مل في إجمالي حجم 1 مل.
   5. احتضان الأنبوب في دوار أنبوب عمودي مع 30 ثورات لكل دقيقة لمدة 35 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ميكانيكيا ننأى بكتل الأنسجة المتبقية من بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام تلميح ماصة ميليلتر 1,000 للمساعدة في عملية الانفصال.
   6. وقف الانفصال عندما تظل لا جزيئات مرئية في الحل. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية عقيمة مع فتحه التنفيس (40 ميكرومتر؛ الشكل 1) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. شطف في المصفاة مع حوالي 10 مل من خلية جديدة الثقافة المتوسطة.
      ملاحظة: عندما يتم تعليق خلية مفردة، خطوة الترشيح ليس عند الضرورة كما في حالة الانفصال من الأجنة. الدماغ أنسجة لينة، وعلى هذا النحو أكثر عرضه لأن تنفصل البلوتينيوم في تعليق خلية مفردة.
   7. بيليه الخلايا بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 180 x ز وريسوسبيند بيليه الخلية إلى 1 مل من L-15 المتوسطة الطازجة ليبوفيتش مع المكملات الموصوفة أعلاه.
   8. "الماصة؛" 500 ميليلتر من تعليق خلية (50% الخلايا التي تم الحصول عليها) على صحن واحد في أسفل عصامي بولي-L-يسين المغلفة الزجاج (انظر 1-2) أو في بئر صفيحة 24-جيدا. المتناقصة في حالة الأسطح أصغر (أي، 125 الحل ميليلتر لبئر صفيحة 96-جيدا). احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت مقاعد البدلاء العمل العقيمة. قم بإضافة وحدة التخزين اللازمة متوسطة جديدة تعبئة الحاوية المحددة واحتضان الخلايا الأولية عند 28 درجة مئوية.
   9. أداء التطبيق التصوير المطلوب باستخدام مجهر مقلوب عند 28 درجة مئوية. يمكن استخدام الثقافات للتصوير لعدة أيام بعد الطلاء. يستعاض عن 50 في المائة المتوسط على أساس يومي.

النتائج

ويبين الشكل 1 صورة خفيفة منقولة عن ثقافة نموذجية المستمدة من الأجنة نوع البرية مع striated myocytes ومجموعات من الخلايا العصبية مثل يجري الأكثر وفرة. للتعرف على بعض أنواع الخلايا بسهولة أكبر، يمكن أن يكون خط المحورة وراثيا مع الخلية المحددة بنوع التعبير بروتين ف?...

Discussion

هنا، نقدم اثنين من البروتوكولات المختلفة لثقافة الخلايا الأولية من إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد الأجنة أو الدماغ الزرد الكبار.

إعداد الثقافات الخلية الأولية من 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد من السهل نسبيا لإجراء لأي شخص لديه خبرة في مجال تقنيات ثقافة الخلية الأساسية. لل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish lines
AB (wild-type)			established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)
Tg(ptf1a:eGFP)jh1			stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)
Tg(XITubb:DsRed)zf148			stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed  (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
centrifuge	Eppendorf		model 5804 R
ChemiDoc MP imaging system	BioRad		model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos
confocal laser scanning microscope	Leica microsystems		model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective
epifluorescent microscope	Leica microsystems		model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective
Gene Pulser Xcell with capacitance extender	BioRad	1652661	electroporation device
Horizontal shaker	GFL		model 3011
incubator for cell culture (28 °C)	Memmert		model incubator I
incubator for embryos (28 °C)	Heraeus		type B6120
light microscope	Zeiss		model TELAVAL 31
micro pipettes	Gilson
sterile work bench	Bio Base		with laminar flow and UV light
tweezers	Dumont		Style 5, Inox
vertical tube rotator	Labinco B.V.		model LD-79
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image Lab Software	BioRad		for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad
ImageJ	National Institutes of Health		used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).
LAS X	Leica Microsystems		for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pCS-DCX-tdTomato	Köster Lab	# 1599	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-eGFP	Köster Lab	# 7	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-H2B-mseCFP	Köster Lab	# 2379	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-mClover	Köster Lab	# 3865	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-MitoTag-YFP	Köster Lab	# 2199	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-ss-RFP-KDEL	Köster Lab	# 4330	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-VAMP1-mCitrine	Köster Lab	# 2291	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pSK-UAS:mCherry	Köster Lab	# 1062	based on the pBluescript-backbone of Stratagene
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic and glass ware
BD Falcon Cell Strainer (40 µm)	FALCON	REF 352340	distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium
1.5 mL reaction tubes	Sarstedt	72690550
24-well plate	Sarstedt	83.3922
50 mL falconic tube	Sarstedt	62.547.004
96-well plate	Sarstedt	83.3924.005
EasyStrainer (40 µm)	Greiner Bio-One	542 040	with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation
electroporation cuvette (0.4 cm)	Kisker	4905022
glass coverslips	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051201
Microscope slides	Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser)	631-0845
Neubauer chamber	Henneberg-Sander GmbH	9020-01
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL)	A. Hartenstein	PP05
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	821473	for zebrafish embryos
pipette tips	Sarstedt	Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm)	TPP Techno Plastic Products AG	93040
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm)	Sarstedt	72690550
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	83.3902	for brain dissection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and Reagents
sodium chloride	Roth	0601.1
4 % paraformaldehyde in 1x PBS	Sigma-Aldrich	16005
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	C1396
ethanol p.a. 100%	Sigma-Aldrich	46139
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated	Thermo Fisher Scientific	31547
HEPES	Roth	9105.4
high vacuum grease	DOW CORNING	3826-50	silicon grease used for self-made glass bottom dishes
magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886
methylene blue	Serva	29198.01
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody	Sigma-Aldrich	T6793
Aqua-Poly/Mount (mounting medium)	Polyscience	18606
poly-L-lysine	Biochrom	L 7240
potasssion chloride	Merck	104938
Skim milk	Roth	68514-61-4
Texas Red-X Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	T7471
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate
Triton X-100	BioRad	1610407
Trypan Blue	Gibco by Life Technologies	15250061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
collagenase (Type 2)	Thermo Fisher Scientific	17101015	dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C
pronase (from Streptomyces griseus)	Roche	11459643001	distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium and solutions for cell culture
1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Gibco by Life Technologies	14190-169	distributed by Thermo Fisher Scientific
CO2-independent medium	Gibco by Life Technologies	18045054	distributed by Thermo Fisher Scientific
filtrated bovine serum (FBS)	PAN-Biotech		individual batch
glutamine 100x	Gibco by Life Technologies	25030081	distributed by Thermo Fisher Scientific
Leibovitz's L-15 medium	Gibco by Life Technologies	11415049	distributed by Thermo Fisher Scientific
PenStrep (10,000 U/mL)	Gibco by Life Technologies	15140148	distributed by Thermo Fisher Scientific