문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

요약

선물이 zebrafish 태아 transfection 라이브 셀 이미징 뿐만 아니라 성인 zebrafish 두뇌에서 1 차 셀을 준비 하는 프로토콜의 기본 셀 문화를 준비 하기 위한 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜.

초록

Zebrafish 태아 투명 하 고 그대로 고 발전 등뼈 동물에서 동적 생물 학적 과정의 우수한 vivo에서 이미징 되므로 어머니 밖에 서 급속 하 게 개발 합니다. 그러나, 명료한 세포 유형 및 subcellular 구조의 형태학의 상세한 영상 전체 마운트에 제한 됩니다. 따라서, 우리 zebrafish 태아와 성인 조직 문화 라이브 1 차 셀을 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 설립.

간단 하 게, 2 dpf zebrafish 태아는 dechorionated, deyolked, 살 균, 그리고 콜라와 함께 단일 셀에 해리. 여과 단계 후 1 차 셀 유리 하단 요리에 도금 하 고 몇 일 동안 경작. 신선한 문화로 긴 기간 differenciated, 높은 해상도 confocal 이미징 연구에 사용할 수 있습니다. 문화 전기 myocytes와 폴 리-L-리 신 코팅에 저명한 되 고 신경 다른 셀 형식을 포함 합니다. 특히 라벨 subcellular 구조에 형광 마커 단백질에 의해, 우리는 또한 electroporation 프로토콜 뉴런을 포함 하 여 다른 세포 유형으로 플라스 미드 DNA의 transfection 수 있는 설립. 따라서, 연산자의 정의 된 자극, 복잡 한 셀 동작, 그리고 기본 zebrafish 세포의 세포내 역학 수 부과 높은 공간과 시간 해상도. 또한, 성인 zebrafish 두뇌를 사용 하 여 기본 자란 조건 뿐 아니라 설명된 분리 기술, 또한 성인 zebrafish 조직에 대 한 작업 설명 합니다.

서문

제 브라 (Danio rerio, D. rerio) 수많은 분야 기본 및 생물 의학 연구¹의 척 추가 있는 인기 모델 이다. Zebrafish 태아 utero 전빠르게 개발, 투명 한, 그리고 따라서 살아있는 유기 체에서 척추 개발을 공부 하 고 우수한 필수 구성 요소를 제공 하는 현미경 적합. Zebrafish²의 유전자 추적성 인해 많은 안정적인 유전자 변형 기자 라인 셀 형식 관련 표현의 다양 한 형광 마커 특정 세포 인구의 관찰에 대 한 수 있도록 설립 되었습니다. Zebrafish 커뮤니티 제공 합성 Kal4TA4 (또는 KalTA3에 해당 GalFF) 표현 transgene 수행 소위 Gal4 드라이버 라인의 광범위 한 다양 한 바이러스 transcriptional 활성화 융합 유전자 효 Gal4 DNA 바인딩 도메인 셀 형식 관련 증강의 통제 도메인. 이러한 드라이버 라인 수행 transgenes는 정의 된 상류 활성화 순서 (UAS) 리포터 유전자를 융합의 구성 된 이펙터 라인을 넘어 있다. Kal4TA4 단백질에 따라서 기자 유전자^3,4의 셀 형식 선택적 식 활성화 UAS 요소에 바인딩합니다. 이 방법은 거의 모든 사용 가능한 증강 및 기자 요소 이중 유전자 변형 동물의 매우 다양 한 조합 연구에 대 한 수 있습니다.

그러나 개별 셀 또는 그들의 subcellular 내용을 초점 깊이 있는 라이브 영상 전체 하 고 끊임없이 변화 배아에 제한 됩니다. 높은 해상도와 특정 세포 생물학 질문을 해결 하기 위해 세포 배양의 사용은 종종 바람직. Zebrafish의 일부 셀 라인, 하지만 그들은 무 겁 게으로 선택한^5,,67 여겨진다 하 그들의 전파는 종종 시간이 걸리는. 또한, 모든 사용 가능한 셀 라인은 구와 파생, 실험 세포 배양을 사용 하 여 셀의 한 종류에 제한. 따라서 우리 모두는 효율적이 고 사용 하기 쉬운 프로토콜 zebrafish 태아 및 접근 문화의 장 수를 증가 하 고 재배의 다양성을 확대 하기 위해 함께 성인 zebrafish 뇌에서 직접 1 차 셀을 준비 하는 설립 셀 유형입니다. 또한, 선물이 형광 세포 기관이 표식에 대 한 식 구문 가진 배아 1 차 셀 transfect에 절차. 따라서, 세포 형태학 및 subcellular 구조 공간 및 시간에서 고해상도 그들의 주요 기능을 유지 하는 다른 세포 유형으로 분석할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 작업은 법적 규정 (EU-지침 2010/63). 유지 보수 및 물고기의 처리 확정 된 지방 자치 단체 및 동물 복지의 브라운슈바이크 공대와 낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전 (LAVES, 올덴부르크, 독일; 아리조나 §4 (02.05) TSchB TU 학사).

1. 1 차 셀 Zebrafish 태아에서의 준비

1. 2 일의 준비 게시물 수정 (dpf) zebrafish 태아
   1. 주 1: 여러 교차점 zebrafish 스트레인 및 당신의 zebrafish 시설 관리자⁸의 사양에 따라 선택의의 설정 합니다.
   2. 제 2 일: 친구 물고기 및 10 cm 배양 접시 (플라스틱)에 산란 후 직접 계란⁸ 를 수집 합니다. 파스퇴르 피 펫 (플라스틱)와 함께 죽 었 거 나 오염 된 계란을 제거 합니다. 워시는 Danieau 30% (5.8 m m 염화 나트륨, 염화 칼륨 0.07 m m, 0.04 m m 마그네슘 황산 염, 0.06 m m 칼슘 질산염, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산, pH 7.2)⁸ 0.0001% (w/v) 메 틸 렌 블루 1 x 달걀. Danieau 매체 교환 없이 메 틸 렌 블루, 메 틸 렌 블루 수 있습니다 autofluorescence, 원인과 28 ° c.에 밤 알을 품 어 이후 30%
      참고: 셀의 충분 한 양을 얻기 위하여 물고기 라인 당 100 계란의 최소 시작. 한 페 트리 접시에 150 개 이상의 배아를 발생 하지 않습니다.
   3. 제 3 일: 죽 었 거 나 오염 된 배아를 제거 하 고 교환 매체 Danieau에 30%. 계산 하 여 배아의 수를 결정 합니다. 28 ° c.에 밤에 태아를 품 어
      참고: 표현 형광 성 취재 원 유전자 변형 라인을 사용 하 여, 심사 1 dpf 또는 2 dpf에 필요할 수 있습니다.
      참고: 많은 양의 태아, 그것 것이 좋습니다 각 페 트리 접시 (그림 1A)의 흑백 이미지 하 고 이미징 소프트웨어와 배아의 수를 정할 수 있습니다.
   4. 제 4 일: 태아는 이제 2 dpf. Chorions 제거, Danieau 30⁸ 의 10 mL을 1 mg/mL의 농도와 1 mL 나 추가 및 모든 chorions 때까지 실 온에서 통에 태아를 품 어 하 (주위 온도 따라 20-40 분)를 분리 합니다. Danieau와 세척 30% 나 및 chorions 제거 및 추가 사용 때까지 실 온에서 배아를 유지.
2. 재사용 가능한 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 하단 요리 준비
   참고: 상용 유리 하단 요리 단일 사용만을 위해 디자인 되 고 비싸다. 다음 절차에서는 표준 연구소 재료에서 재사용 성가 유리 하단 요리를 준비 하는 방법을 설명 합니다.
   1. 표준 셀 문화 요리 (직경 6 cm, 플라스틱) (그림 1B)의 하단에 직경 10 mm의 구멍을 드릴 합니다. 접시 바닥 드릴링 먼지를 제거 하 수돗물으로 깨끗이 씻는 다.
   2. 접시 바닥의 밑면에 있는 구멍의 주위에 실리콘 그리스를 확산 하 고 coverslip 접착제로는 그리스를 사용 하 여 연결 합니다. 그리스 요리 바닥과 coverslip 사이의 격차 물개 다는 것을 확인 하십시오.
      참고: 사용된 coverslips의 두께 나중 이미징 응용 프로그램에 대 한 적절 한 있는지 확인 합니다.
   3. 수돗물 찬물과 비누로 성가 유리 하단 요리 철저 하 게, 하지만 신중 하 게 씻어. 유리 하단 요리 세 번 비누를 제거 하는 이온된 수와 린스. 요리 뚜껑을 건조 하 고 바닥 접시 추가 사용까지 깨끗 한 상자에 보관.
   4. 문화 준비의 날에 (주 4 참조 1.1.4): 둘 다의 내부를 축 축 하 게 뚜껑을 접시와 70% (v/v) 에탄올과 바닥 접시. 요리 뚜껑을 배치 하 고 층 류와 자외선 살 균 작업 벤치에서 안쪽을 향하도록 바닥 접시. 에탄올, 증발 될 때까지 건조 다음 20 분 동안 자외선을 적용 합니다. 이 치료 후, 요리는 조립 하 고 살 균으로 간주 됩니다.
   5. 코팅, 폴 리-L-리 신 (0.1 mg/mL) 각 유리 하단 접시 중간의 200 µ L 플라스틱 및 피 펫 팁 표면 장력을 끊어서는 coverslip에 액체를 확산. 60 분 동안 건조 하자 다음 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 x. 액체를 제거 합니다. 추가 사용까지 벤치에서 요리를 계속.
      참고: 다른 코팅 실험의 목표에 따라 테스트 될 수 있습니다. 우리 폴 리-L-리 신 뉴런의 성장을 지원 하기 위해 충분 한 발견, 없이 플라스틱을 처리 하는 반면 어떤 추가 코팅 섬유 모양의 세포 (그림 1E, F)의 성장에 유리한 것으로 나타났다.
      참고: 성가 유리 하단 요리 여러 번 사용할 수 있습니다. coverslip 교환, 따뜻한 수돗물으로 씻어 신중 하 게는 coverslip 분리 하 고 70% (v/v) 에탄올과 비누와 나머지 그리스를 제거.
3. 준비 및 1 차 셀의 도금
   1. 문화 준비의 날에 (주 4 참조 1.1.4): 살 균 세포 배양 접시에 배아를 전송 (직경 6 cm) 신선한 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 모든 태아는 약 2 cm 이하의 직경을 가진 큰 드롭에서 수집 될 때까지 액체를 현명한 제거 합니다.
   2. 무 균 작업 벤치에 배아와 접시를 놓고 공동₂-독립 매체 (보충 10% (v/v) 만들어지고 소 혈 청 글루타민 및 1.2% (v/v) 10000 x 1 U 페니실린-스; 다음에는 모든 보충제와 매체 "세포 배양 매체"로 함) 요리 반 가득 될 때까지.
      참고: 대안 공동₂-독립 매체 예 neurobasal 매체, DMEM 매체 또는 Leibovitz의 L-15 매체 실험의 목표에 따라 테스트할 수 있습니다. CO₂-독립 매체 그리고 Leibovitz의 L-15 매체 CO₂ 배양 기를 요구 하지 않기의 이점이 있다.
   3. 노른자위를 제거 하려면 200 µ L-피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 배아 플라스틱. 성공적인 deyolking 매체의 흐려 의해 인식 될 수 있습니다.
   4. 70% (v/v) 에탄올과 셀 문화 요리와 신선한 세포 배양 매체와 다른 셀 문화 접시를 채우십시오. 컷오프 1000 µ L-피 펫 팁을 사용 하 여 핸들 (40 µ m; 멸 균 셀 여과기에 배아를 전송 그림 1C)입니다. 손잡이 스 트레이너 하 고 있도록 모든 배아 5 잠긴 에탄올과 접시에 찍어 s. 즉시 나중에, 신선한 세포 배양 매체와 함께 접시에 배아와 여과기를 잠수함.
      참고: 셀 멤브레인 수 재사용 여러 번. 수돗물, 70% 에탄올에 그들 및 건조 및 UV 치료 실행 부드러운 브러시로 깨끗 한 살 균 작업에서 그들 사용 하기 전에 직접 벤치 (1.2.4 참조).
   5. 살 균 1.5 mL 반응 튜브 (1 개의 관에 약 100 배아) 배아를 전송 합니다. 콜라 (2 형) 4 mg/mL 1 mL의 총 볼륨에서의 최종 농도에 세포 배양에 희석을 추가 합니다. 튜브 실 온에서 45 분 동안 분 당 30 혁명 수직 튜브 회전자에 태아를 품 어.
   6. 1000 µ L-피 펫 팁 배아 콜라 혼합물을 아래로 pipetting으로 나머지 세포 덩어리를 분리. 그런 다음 배기 슬롯 (40 µ m; 멸 균 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 그림 1D) 으로 50 mL 원뿔 튜브. 신선한 세포 배양 매체의 약 10 mL와 여과기를 헹 구 십시오.
   7. 180 x g에서 3 분 동안 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛. 펠 릿 거의 볼 수 있습니다. 조심 스럽게 제거는 상쾌한 고 30 원래 사용된 배아 당 200 µ L 신선한 세포 배양 매체에서 셀 resuspend.
      참고: 표시 펠 렛을 얻기 위해이 좋습니다 100 배아의 최소와 함께 시작 하.
   8. 플라스틱의 자 폴 리-L-리 신-코팅 유리 하단 접시 유리 영역에 직접 1.3.7 단계에서 얻은 세포 현 탁 액의 200 µ L (1.2 참조). 무 균 작업 벤치에서 실 온에서 60 분 동안 품 어. 6 mL 신선한 세포 배양 매체의 추가 28 ° c.에 1 차 셀을 품 어
   9. 28 ° c.에는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 원하는 이미징 응용 프로그램 수행 매일 세포 배양 매체를 교환 합니다. 문화는 이미징 (dap) 도금 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다.

그림 1: zebrafish 태아의 1 차 셀 문화. (A) 1의 흑백 이미지 튐 배아, 배아의 수를 분석 하는 소프트웨어 도구에 의해 처리 수 있습니다. (B) 세포 문화 요리 (직경 6 cm) 드릴 된 구멍 (직경 10 m m) 재사용 성가 유리 하단 요리를 준비 하는 데 사용 됩니다. (C) 간단한 핸들 셀 멤브레인 (40 µ m)로 사용 됩니다 "방문 그물" 에탄올으로 deyolked 배아를 찍어 신선한 세포 배양 매체를 신속 하 게 그들을 전송. (D) 셀 슬롯 배기와 멤브레인 (40 µ m)는 콜라 중재 분리 후 셀을 필터링 하는 데 사용 됩니다. (E) 5 튐 후, 1 차 셀 폴 리-L-리 신 주로 코팅 유리에 시드 발음 확장명이 뉴런을 형성. 눈금 막대 = 100 µ m. (F) 후 코팅, 섬유 아 세포와 같은 세포 자라 다 문화 없이 5 대우 플라스틱에 튐. 눈금 막대 = 100 µ m. (E)와 (F) epifluorescent 현미경에 의해 인수 했다. (G) 기본 셀 1에 야생 타입 제 브라에서 파생 된 빛 이미지 튐. 전기 myocytes 및 얇은 프로세스를 확장 하는 뉴런의 클러스터 쉽게 관찰 될 수 있다. 눈금 막대 = 50 µ m. (H) 배양된 세포의 유전자 변형 라인 안내 (ptf1a: eGFP) eGFP는 hindbrain에 주로 GABAergic 신경의 신경 창시자와 망막 세포 인구^29, 의 하위 집합을 표현 하는 jh1 ^{30 , 31}. 눈금 막대 = 50 µ m. (G)와 (H) confocal 레이저 스캐닝 현미경 (B)에서 볼 수 있듯이 만든 유리 하단 요리를 사용 하 여 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 기본 transfection 플라스 미드 DNA와 세포

1. Resuspend 만들어지고 그리고 수송과 세포에서 세포 배양 매체 대신 1 x PBS에서 1.3.7 단계. Trypan 파랑 세 실⁹셀 수를 결정 하는 세포 현 탁 액의 약 수를 얼룩.
2. 10 µ g 울트라 순수 플라스 미드 DNA 1.5 mL 반응 관에 0.5 백만 셀 혼합 하 고 총 볼륨 1 x PBS 가진 100 µ L 조정 합니다.
   참고: 우리의 실험에 대 한 우리 주로 사용 식 구문을 기반으로 플라스 미드 pCS2 +¹⁰. PCS2 +의 다중 복제 사이트에 복제 하는 열려있는 독서 프레임 표현의 인간의 세포 (CMV 발기인)의 유비 쿼터 스 발기인에 의해 구동 됩니다. 다른 식 구문 및 발기인 (또한 대표 결과 및 그림 2 및 그림 3참조) 테스트 될 수 있습니다.
3. 전송 셀 DNA 혼합 즉시 electroporation 베트 (0.4 c m), electroporation 장치 및 다음 설정으로 electroporate는 베트 배치: 1 회 펄스, 지 수 감퇴, 280 V, 950 µ F.
4. Electroporation, 후 직접 세포 DNA 혼합 신선한 세포 배양 매체의 300 µ L와 1.5 mL 반응 관에 전송 합니다.
5. 1.3.8에 설명 된 대로 세포 현 탁 액의 200 µ L 플레이트 및 진행 사용된 식 구문에 따라 1.3.9에 설명 된 대로 형광 단백질의 표현 수 있습니다 감지 몇 시간 후 또는 다음 날에.

3. 고정된 1 차 셀의 얼룩

참고: Subcellular 구조 또한 형광 성 융해 단백질 기자를 사용 하는 대신 고전적인 immunostaining에 의해 구상 될 수 있다. Zebrafish 1 차 셀에 대 한 우리 형광 마커 모범적인 얼룩 핵, F-말라와 acetylated tubulin에 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용합니다.

1. 폴 리-L-리 신 코팅된 커버 슬립에 판 전지 (참조 1.3.8) 위에서 설명한 대로 셀 문화 접시 또는 multiwell 격판덮개에 배치 합니다.
2. 고정, 매체를 제거 하 고 4% paraformaldehyde 1 x PBS에 있는 셀을 커버. 셀 통에 4 ° C에서 10 분 동안 품 어. 워시 5 분 각 실 온에서 1 x PBS 가진 3 배 세포. 1 x PBS 셀을 완전히 덮는 다는 것을 확인 하 고 통에 세척 단계를 수행 합니다.
3. 차단 하 고 5% 탈지 우유와 0.3%를 포함 하는 1 x PBS와 셀 커버 고정된 세포를 permeabilize 트라이 톤 X-100. 통에 실 온에서 10 분에 대 한 셀을 놓습니다. 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
4. Acetylated tubulin, axons¹¹, 마커를 포함 하는 1% 탈지 우유 1 x PBS에서 1 차적인 항 체 1:2,000 희석. 이 솔루션으로 세포를 커버 하 고 통에 4 ° C에서 밤에 그들을 품 어. 다음 날, 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
5. 1% 탈지 우유를 포함 하는 1 x PBS에 녹색 fluorochrom fluorescein isothiocyanate (FITC) 배율을 사용으로 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 어둠 속에서 실 온에서 1 h이 솔루션으로 셀을 품 어 (는 요리 예 상자 커버 또는 알루미늄 호 일) 통에. 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
6. 동시에 말라 골격 및 핵 얼룩, Phalloidin¹² 붉은 형광 색소 (1:50)와 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)¹³ (100 ng/mL) 룸에서 10 분 활용으로 보충 1 x PBS에 셀을 품 어 통에 어둠 속에서 온도입니다. 3.2에 설명 된 대로 세포를 씻어.
7. 준비 하려면 세포 이미징, 깨끗 한 표면에 유리 개체 캐리어 (현미경 슬라이드)를 넣어 하 고 그것에 설치 매체의 드롭에 놓습니다. 핀셋을 사용 하 여 접시에 꺼내 고정 및 스테인드 셀 커버 슬립 하 고 제자리에 드롭 개체 캐리어를 직면 하는 셀. 그 설치 매체 확산 커버 슬립의 전체 지역에 다는 것을 확인 하십시오. 어둠 속에서 건조 보자입니다.
8. 스토어 고정 하 고 원하는 이미징 응용 프로그램 수행 될 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 셀을 탑재.

그림 2: electroporation 여 Transfection 식의 구성. (A) 1 Pc eGFP와 페 Putative 신경 튐. (B) 전기 myocyte (2 튐) ss-RFP-KDEL 바인딩과 그물 타겟 단백질을 표현. 클러스터 내에 신경 2 Pc-MitoTag-YFP와 페 (C) 두 개의 뉴런 튐. (D) 셀 (2 튐) Pc와 트리플 페-DCX-tdTomato, Pc-MitoTag-YFP 및 Pc-H2B-mseCFP. (E) pSK-transgenes Tg를 들고 더블 유전자 변형 태아에서 파생 된 1 차 셀 (1 튐)에 UAS:mCherry electroporated (atoh1a: Gal4TA4) hzm2²² 및 안내 (4xUAS:KGFPGI) hzm3³² 에 GFP 식 결과 신경은 hindbrain의 창시자입니다. 스케일 바 = 10 µ m. (A-E) 의해 인수 됐다 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 사용 하 여 만든 그림 1B에서 볼 수 있듯이 유리 하단 요리. (F) 형광 얼룩 고정된 zebrafish 기본 신경의 5에 튐. 블루: DAPI (핵); 빨간색: Phalloidin (F-말라); 녹색: Acetylated tubulin (신경). 눈금 막대 = 10 µ m. (G) 같은 신경 세포 Pc mClover와 페. 2에서 dap, 확장자 표시 됩니다. 5에서 dap, neurite 같은 구조를 형성 했다. 눈금 막대 = 25 µ m. (H) (F), 셀과 같은 준비에서 신경 섬유 아 세포와 같은 세포에 의해 둘러싸여. 눈금 막대 = 10 µ m. (나) 신경 transgene Tg를 들고 유전자 변형 태아에서 파생 된 (XITubb: DsRed) Pc mClover와 zf148²⁸ 페. 12과 15 사이의 튐는 neurites 대규모 변성을 받 다. 눈금 막대 = 100 µ m. 셀 (F-나)에 표시 된 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 (F, H)에 시드 했다 또는 플라스틱 (G, I), 10% 존재 L-15 매체에서 만들어지고 둔감 한 혈 청 및 신경 보충 B-27 (희석된 1:50)와 epifluorescent 현미경으로 몇 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 1 차 셀 Zebrafish 뇌에서의 준비

1. 뇌 추출
   1. 90 일 이상 성인 물고기를 선택 합니다. 특정 셀 형식 사용 해야 하는 경우 유전자 변형 라인 있는 셀 전용 형광 기자 식 있게 시각화 원하는 셀을 선택 합니다.
   2. 30 %Danieau 가득한 마 취 Tricaine⁸ (0.2%)의 200 mL 비 커에 생선을 넣습니다. 물고기 이동 중지 될 때까지 기다립니다. 담가 15 분 그것을 안락사 200ml 얼음 물으로 채워진 비 커에서 마 취 물고기.
   3. 페 트리 접시를 채우기 (직경 6 cm) 70% (v/v) 에탄올과. 물고기 꼬리 핀셋의 쌍을 가진 고 에탄올으로 그것을 찍어. 물고기는 5에 대 한 에탄올에 완전히 빠져들 수 있도록 s.
   4. 굽타와 멀 린¹⁴ 다음 적응의 프로토콜에 따라 뇌를 추출: 압력가 마로 소독 또는 멸 균 포장 도구만을 사용 하 고 살 균 1 x PBS에 머리를 해 부.
   5. 직접 추출 후 배양 접시에서 두뇌를 배치 (직경 3 cm) 살 균 1 x PBS로 가득 하 고 세포 배양에 대 한 살 균 작업 벤치 아래 접시를 이동.
2. 뇌 분리 및 1 차 셀의 도금
   1. 장소 2 세트 핀셋 (압력가) 살 균, 멸 균 페 트리 접시 (직경 6 cm) 70% (v/v) 에탄올, 무 균 배양 접시 가득 (직경 10 cm) Leibovitz의 L-15 매체 10% 보충으로 가득 (v/v) 만들어지고 소 혈 청 B-27 (1:50), 1.2% (v / v) 10000 U 페니실린-스와 핸들 (40 µ m; 한 멸 균 셀 스 트레이너 그림 1 c) 아래 깨끗 한 벤치.
   2. 페 트리 접시에 셀 스 트레이너 에탄올으로 가득 장소와 액체 레벨은 적어도 5 mm는 여과기의 바닥 보다 높은 수 있도록.
   3. 족집게의 첫 번째 집합을 사용 하 여, 이미 에탄올에 배치 하는 여과기로 두뇌를 전송 하 고 그것은 완전히 액체에 의해 덮여 확인 합니다. 1 후 s, 전송 위의 Leibovitz의 L-15 매체를 포함 하는 배양 접시에 두뇌와 여과기 보충 설명.
   4. 족집게의 두 번째 세트를 사용 하 여 전송 위의 500 µ L Leibovitz L-15 매체 살 균 1.5 mL 반응 관에 뇌 가득 보충 설명. 4 mg/mL 1 mL의 총 볼륨에서의 최종 농도에 콜라 (유형 2)를 추가 합니다.
   5. 실 온에서 35 분 동안 분 당 30 혁명 수직 튜브 회전자에 튜브를 품 어. 기계적으로 분리 과정을 돕기 위해 1000 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 나머지 조직 덩어리를 분리.
   6. 보이는 파티클이 솔루션에 남아 때 분리를 중지 합니다. 배기 슬롯 (40 µ m; 멸 균 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 그림 1D) 으로 50 mL 원뿔 튜브. 신선한 세포 배양 매체의 약 10 mL와 여과기를 헹 구 십시오.
      참고: 단일 셀 서 스 펜 션, 달성 하는 경우 여과 단계는 배아 분리의 경우 필요에 따라 없습니다. 두뇌는 부드러운 조직 이며 같은 그것은 더 균질 단일 세포 현 탁 액에 해리 될 경향이.
   7. 180 x g 에 5 분 동안 원심 분리 하 여 세포를 작은 고 위의 설명된 보조 제와 함께 신선한 Leibovitz L-15 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
   8. 1 자 폴 리-L-리 신 코팅된 유리 하단 접시에 세포 현 탁 액 (50% 획득된)의 500 µ L 플라스틱 (1.2 참조) 또는 24-잘 접시의 우물에서. 작은 표면 (즉, 125 µ L 솔루션 96 잘 접시의 우물)의 경우 방향을. 무 균 작업 벤치에서 실 온에서 60 분 동안 품 어. 특정 컨테이너를 28 ° c.에 1 차 셀을 품 어 신선한 매체의 필요한 볼륨 추가
   9. 28 ° c.에는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 원하는 이미징 응용 프로그램 수행 문화는 이미징 도금 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. 매일 매체의 50%를 교체 합니다.

결과

그림 1G紋 myocytes 및 신경 같은 입자로 가장 풍부한의 클러스터 야생 타입 배아에서 파생 된 일반적인 문화의 전송된 빛 이미지를 보여줍니다. 더 쉽게 특정 세포 유형 식별, 유전자 변형 라인 형광 단백질의 세포 유형 특정 식이 될 수 있습니다 (그림 1 H)을 사용.

PCS2 +의 transfection-플?...

토론

여기, 우리의 현재 두 개의 서로 다른 프로토콜 문화 1 차 셀 2 dpf zebrafish 태아 또는 성인 zebrafish 두뇌에서.

1 차 셀 문화 2 dpf zebrafish에서 준비 기본 셀 문화 기술에 경험을 가진 사람에 대 한 수행 상대적으로 쉽습니다. 그러나, 좋은 하 고 재현 가능한 결과 얻으려면 시작 물자로 배아의 충분 한 수는 중요 한 (100은 최소). 배아의 발생 하는 동안 모든 가능한 소스 오염 세균과 기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish lines
AB (wild-type)			established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)
Tg(ptf1a:eGFP)jh1			stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)
Tg(XITubb:DsRed)zf148			stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed  (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
centrifuge	Eppendorf		model 5804 R
ChemiDoc MP imaging system	BioRad		model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos
confocal laser scanning microscope	Leica microsystems		model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective
epifluorescent microscope	Leica microsystems		model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective
Gene Pulser Xcell with capacitance extender	BioRad	1652661	electroporation device
Horizontal shaker	GFL		model 3011
incubator for cell culture (28 °C)	Memmert		model incubator I
incubator for embryos (28 °C)	Heraeus		type B6120
light microscope	Zeiss		model TELAVAL 31
micro pipettes	Gilson
sterile work bench	Bio Base		with laminar flow and UV light
tweezers	Dumont		Style 5, Inox
vertical tube rotator	Labinco B.V.		model LD-79
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image Lab Software	BioRad		for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad
ImageJ	National Institutes of Health		used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).
LAS X	Leica Microsystems		for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pCS-DCX-tdTomato	Köster Lab	# 1599	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-eGFP	Köster Lab	# 7	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-H2B-mseCFP	Köster Lab	# 2379	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-mClover	Köster Lab	# 3865	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-MitoTag-YFP	Köster Lab	# 2199	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-ss-RFP-KDEL	Köster Lab	# 4330	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-VAMP1-mCitrine	Köster Lab	# 2291	based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pSK-UAS:mCherry	Köster Lab	# 1062	based on the pBluescript-backbone of Stratagene
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic and glass ware
BD Falcon Cell Strainer (40 µm)	FALCON	REF 352340	distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium
1.5 mL reaction tubes	Sarstedt	72690550
24-well plate	Sarstedt	83.3922
50 mL falconic tube	Sarstedt	62.547.004
96-well plate	Sarstedt	83.3924.005
EasyStrainer (40 µm)	Greiner Bio-One	542 040	with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation
electroporation cuvette (0.4 cm)	Kisker	4905022
glass coverslips	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051201
Microscope slides	Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser)	631-0845
Neubauer chamber	Henneberg-Sander GmbH	9020-01
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL)	A. Hartenstein	PP05
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	821473	for zebrafish embryos
pipette tips	Sarstedt	Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm)	TPP Techno Plastic Products AG	93040
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm)	Sarstedt	72690550
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm)	Sarstedt	83.3902	for brain dissection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and Reagents
sodium chloride	Roth	0601.1
4 % paraformaldehyde in 1 x PBS	Sigma-Aldrich	16005
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	C1396
ethanol p.a. 100%	Sigma-Aldrich	46139
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated	Thermo Fisher Scientific	31547
HEPES	Roth	9105.4
high vacuum grease	DOW CORNING	3826-50	silicon grease used for self-made glass bottom dishes
magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886
methylene blue	Serva	29198.01
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody	Sigma-Aldrich	T6793
Aqua-Poly/Mount (mounting medium)	Polyscience	18606
poly-L-lysine	Biochrom	L 7240
potasssion chloride	Merck	104938
Skim milk	Roth	68514-61-4
Texas Red-X Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	T7471
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521	Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate
Triton X-100	BioRad	1610407
Trypan Blue	Gibco by Life Technologies	15250061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
collagenase (Type 2)	Thermo Fisher Scientific	17101015	dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C
pronase (from Streptomyces griseus)	Roche	11459643001	distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium and solutions for cell culture
1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	Gibco by Life Technologies	14190-169	distributed by Thermo Fisher Scientific
CO2-independent medium	Gibco by Life Technologies	18045054	distributed by Thermo Fisher Scientific
filtrated bovine serum (FBS)	PAN-Biotech		individual batch
glutamine 100 x	Gibco by Life Technologies	25030081	distributed by Thermo Fisher Scientific
Leibovitz's L-15 medium	Gibco by Life Technologies	11415049	distributed by Thermo Fisher Scientific
PenStrep (10,000 units/mL)	Gibco by Life Technologies	15140148	distributed by Thermo Fisher Scientific