عزل ميتوريبوسومي من الخلايا HEK السريع

Shintaro Aibara; Juni Andréll; Vivek Singh; Alexey Amunts

doi:10.3791/57877

Summary

الميتوكوندريا المتخصصة ريبوسوم التي تختلف عن نظيراتها البكتيرية وحشوية. هنا نعرض كيف يمكن الحصول على ميتوريبوسوميس من تلك المقصورة الأصلية في الخلايا HEK. الأسلوب الذي ينطوي على عزل الميتوكوندريا من تعليق الخلايا وما يترتب عليها من تنقية ميتوريبوسوميس.

Abstract

الميتوكوندريا البشرية تمتلك مجموعة مخصصة من ريبوسوم (ميتوريبوسوميس) أن ترجمة مكونات البروتين الضروري 13 من المجمعات الفسفرة المشفرة بواسطة الجينوم المتقدرية. منذ جميع البروتينات تصنيعه من قبل ميتوريبوسوميس البشرية بروتينات الغشاء لا يتجزأ، المربوطة ميتوريبوسوميس البشرية للغشاء الداخلي المتقدرية أثناء الترجمة. بالمقارنة مع الريبوسوم سيتوسوليك ميتوريبوسومي لديه معامل ترسب 55S ونصف محتوى الرنا الريباسي، لا الرنا الريباسي 5S والبروتينات الإضافية 36. ولذلك، أعلى نسبة البروتين للجيش الملكي النيبالي وبنية شاذة تجعل ميتوريبوسومي البشرية متميزة إلى حد كبير من نظيرتها في سيتوسوليك.

وعلى الرغم من الأهمية المركزية ميتوريبوسومي للحياة، لا يوجد أية بروتوكولات متاحة لتنقية المجمع سليمة من خطوط الخلايا البشرية. تقليديا، كانت ميتوريبوسوميس المعزولة من الأنسجة الحيوانية الغنية الميتوكوندريا التي تتطلب كيلوغراما من ابتداء من المواد. نحن مسبب أن الميتوكوندريا في تقسيم الخلايا البشرية المستمدة من HEK293 التي نمت في المتوسط التعبير الغنية بالمغذيات سيكون بترجمة المتقدرية نشطة، ولذلك يمكن أن يكون مصدر مناسب من المواد لدراسات هيكلية والبيوكيميائية ميتوريبوسومي. للتحقيق في هيكلها، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية ميتوريبوسوميس سليمة من خلايا HEK على نطاق واسع. وهنا، نقدم أسلوب التجويف النيتروجين كأسرع وأقل البديلة ذات العمالة الكثيفة وأكثر كفاءة بالطرق الميكانيكية التقليدية المستندة إلى القص لتحلل الخلية. وادي هذا إلى الأعمال التحضيرية ميتوريبوسومي التي سمحت لتصميمها الهيكلي بدقة عالية، والكشف عن تكوين ميتوريبوسومي الإنسان سليمة والوسيطة في الجمعية. هنا، علينا متابعة هذا العمل ويقدم محسنة وأكثر طريقة فعالة من حيث التكلفة التي تتطلب فقط 10 ~¹⁰ استزراع الخلايا HEK. الطريقة التي يمكن أن تستخدم لتنقية ميتوريبوسومال البشرية ترجمة المجمعات وطفرات وجمعيات مراقبة الجودة ووسيطة مفارز ميتوريبوسومال. التنقية يمكن أن يكون خطيا الارتقاء بعشرة إضعاف إذا لزم الأمر، وتنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا.

Introduction

تستند عملية تخليق البروتين المتقدرية 13 طن متري-مرناس الأساسية التي يتم ترجمتها بواسطة ميتوريبوسومي المرفقة بغشاء متخصصة تشكل جوهر السلسلة التنفسية الحفاز. الجينوم المتقدرية غيرت والحاجة للبروتينات لإدراج كوترانسلاتيونالي في الغشاء شكلت إلى حد كبير هيكل ريبوسوم المتقدرية¹. أظهرت مؤخرا هياكل ميتوريبوسومي الثدييات ذات الدقة العالية مظهر العام مختلفة لافت للنظر إلى نظيره البكتيرية²^،³. خاصة، إضافة على الأقل 36 الخاصة الميتوكوندريا البروتينات، المساهمة ~ 1 جمعية نجمة داود الحمراء الكتلة الجزيئية إضافية، في حين خفضت من شقين الرنا الريباسي طن متري واختلفت بدرجة عالية. تغيير ترتيبات هيكلية جديدة تقريبا كافة الميزات الفنية الحاسمة سابقا المقبولة عموما أن يكون عالمياً حفظت⁴.

العناصر الرئيسية الجديدة قد اكتسبت بكل واحد من الوحدات الفرعية ميتوريبوسومال، على سبيل المثال، أدمجت وحدة فرعية صغيرة mS29 بروتين GTPase جوهرية في منطقتها 'رأس'. لم يتم اكتشاف نشاط GTPase في أنظمة الترجمة الأخرى، والهيكل يشير إلى أن جتباسي قد يكون دور في فرعية للجمعية². مفقود في ميتوريبوسومي الثدييات الرنا الريباسي 5S الذي يعتقد أنه معلما من جميع مفارز كبيرة ريبوسومال المعروفة، تشكل جوهر الناشزة المركزية، وقد اعتمدت طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Val كلبنة لا يتجزأ بدلاً من². الحظر والزملاء وأظهرت أن ميتوريبوسومي الخنزير طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-الفنيل ألانين ولا – فال⁵. تشرزانووسكا-لايتووليرس، مينكزوك، والزملاء بمتابعة هذه البيانات ووجدت أن ميتوريبوسوميس من المرضى مع الشبهة طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Val الاستقرار يمكن أن تستوعب في المبدأ⁶طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Phe^،⁷. لماذا أدرجت ميتوريبوسوميس هذه العناصر المحددة والمسارات و عبر-عوامل مطلوبة من أجل هذه التجميعات فريدة لا تزال غير معروفة.

إجمالاً، يعني تعقيد عالية ميتوريبوسومي البشرية ومكونات البروتين جديدة، ورابطة فريدة من نوعها للحمض الريبي النووي النقال طن متري كعنصر هيكلي مشاركة الميتوكوندريا على حدة كحتى الآن-المجهول عبر-العوامل. ومع ذلك، نظراً لأن العديد من ميزات هذا النظام فريدة من نوعها إلى الميتوكوندريا، التي كانت تقليديا صعبة التحقيق⁸، يعرف الكثير عن الآلية الجزيئية ومراقبة الجودة. مع وضع تحليل الجسيمات مفردة ذات الدقة العالية بالإلكترون cryo-مجهرية (cryo-م)²⁰، تنشأ الفرص الآن لدراسة شاملة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الجمعية، والعمل ومراقبة الجودة للإنسان ميتوريبوسومي. يقدم تقريرنا لهيكل الجمعية العامة ميتوريبوسومي البشرية الوسيطة الأولى الاعتراف بأنه من الممكن تصور كيف يتم تشكيل ميتوريبوسومي البشرية ويظهر أن البرد-م دور أساسي في تحديد هوية جديدة عبر- العوامل الجمعية بالإنابة⁹.

لتوسيع نطاق هذا الجهد الأولى، يصف لنا بروتوكول سريع لتنقية ميتوريبوسومي البشرية بالتفصيل. ويرد في الجزء الأول من البروتوكول، عزلة على نطاق واسع من الميتوكوندريا سليمة نقية جداً من الخلايا تعليق. هذا الإجراء يتطلب ح 9 ويمكن تعديلها بسهولة وتكييفها لأنواع مختلفة من الخلايا والنطاقات. خطوة هامة في هذا البروتوكول هو استخدام النتروجين التجويف كسر فتح الخلايا. تم وضع الجزء الثاني من البروتوكول لتنقية ميتوريبوسوميس. هذا الإجراء يتطلب ح 7 وينتج كمية كافية من ميتوريبوسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية. استخدام الميتوكوندريا نقية كانطلاق مادة يقدم الاستعدادات النهائية عالية الجودة ويمكن استقراء للجزيئات الأخرى المتقدرية.

Protocol

يجب أن تتم جميع خلايا الثدييات ثقافة العمل داخل مجلس الوزراء سلامة بيولوجية. استخدام معدات معقمة إذا كان الاتصال مع الخلايا. ارتداء القفازات النتريل ومعطف معمل واتباع الممارسات الجيدة في مجال زراعة الأنسجة.

1-خلية ثقافة

الحفاظ على HEK293S تعليق الخلايا في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين خالية من التتراسيكلين (FBS)، 5 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين و 200 ميكروغرام/مل الأزيتروميسين، في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
مقياس يصل إلى 9 x T175 قوارير. في كونفلوينسي 90%، حصاد الخلايا وتدور لهم إلى أسفل في ز 500 x لأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في فريستيل تكملة مع 5% FBS خالية من التتراسيكلين. حساب عدد الخلايا باستخدام خلية الآلي مكافحة وضبط تركيز الخلية إلى 1.5 x 10⁶ خلايا/مل في قارورة تهتز تنفيس.
ملاحظة: هذا سوف عادة تتوافق مع وحدة تخزين بدءاً من 300 مل في قارورة تنفيس مل 1,000.
احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO₂ 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).
وبعد يومين عد الخلايا والشروع في تقسيم الخلايا إذا كانت كثافة الخلية أعلاه 3.0 x 10⁶ خلايا/مل. تقسيم الخلايا بالغزل أسفل ثقافة الخلية 2 × 150 مل في زجاجات مخروطية 2 × 250 مل على 500 غرام للحد الأدنى 5 خلايا ريسوسبيند في وسائط جديدة 2 × 10 مل ونقل إلى 2 × 1، 000 مل تنفيس قوارير تحتوي على وحدة التخزين المناسبة لكثافة خلية النهائية 1.5 × 10⁶ خلية/مل، مثل 2 × 300 مل من كثافة خلية بداية 3.0 x 10⁶ خلايا/مل.
احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO₂ 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).
وبعد يومين عد الخلايا والشروع في تقسيم الخلايا إذا كانت كثافة الخلية أعلاه 3.0 x 10⁶ خلايا/مل. انقسام الخلايا بالغزل أسفل 4 × 150 مل خلية ثقافة في زجاجات مخروطية الشكل 4 × 250 مل على 500 غرام للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في وسائط جديدة 2 × 10 مل ونقل إلى قارورة تنفيس مل 2 x 2,000 الذي يحتوي على وحدة التخزين المناسبة لكثافة خلية الأخيرة 1.5 x 10⁶ خلية/مل، مثلاً 2 x 700 مل من كثافة خلية بداية 3.0 x 10⁶ خلايا/مل.
احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO₂ 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).
وبعد يومين عد الخلايا والشروع في تقسيم الخلايا إذا كانت كثافة الخلية أعلاه 3.0 x 10⁶ خلايا/مل. تقسيم الخلايا بصب مل 2 x 700 تنفيس ثقافة الخلية إلى 2 × مل 2800 قوارير وتتصدر مع 2 × 300 مل وسائط جديدة للوصول إلى وحدة تخزين من 2 × 1 ل.
احتضان خلايا في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية و 5% CO₂ 120 لفة في الدقيقة (قطر الهز 50 ملم).
بعد 24 ساعة عد الخلايا وحصاد الخلايا إذا كانت كثافة الخلية بين 3.0-4.0 × 10⁶ خلايا/مل.

2-الميتوكوندريا العزلة

المخازن المؤقتة المطلوبة
ملاحظة: الكميات التي تعطي لإعداد من الخلايا ل 2. إعداد الحلول الأسهم التالية قبل الموعد المحدد لعزل المتقدرية المخزن المؤقت (MIB)، السكروز/المانيتول المخزن المؤقت (SM4)، المخزن المؤقت التجريبي (ميبسم)، لاستثارة المخزن المؤقت (SEM).
1. جعل 0.5 لتر MIB المخزن المؤقت: 50 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل₂، 1 مم يدتا، 1 مم اجتا، 1 مم DTT، مثبطات البروتياز.
2. جعل المخزن المؤقت 100 مل SM4: السكروز 280 ملم، المانيتول 840 ملم، 50 ملم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل₂، 1 مم يدتا، 1 مم عطا، 1 م م DTT، ومثبطات البروتياز.
3. جعل 160 مل ميبسم المخزن المؤقت: 120 مل MIB المخزن المؤقت + 40 مل SM4 المخزن المؤقت.
4. تخزين 200 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
5. جعل المخزن المؤقت 5 مل SEM: السكروز 250 ملم، 20 ملم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، يدتا 1 مم.
6. تجعل حلول 4 × 10 مل الأسهم للتدرج السكروز التدرجي الذي يحتوي على 20 مم حبيس-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 1 مم يدتا و 60%/السكروز 32% 23 في المائة و 15 في المائة، على التوالي.
عزل الميتوكوندريا
ملاحظة: من المهم أن تعمل بسرعة، وإبقاء كل شيء على الجليد طوال فترة الإجراءات.
بريكول التجويف النيتروجين الدائرة المسبقة لاستخدام.
1. حصاد الخلايا ل 2 × 1 (3-4 × 10⁹ خلايا كل أنبوبة الطرد المركزي) بالطرد المركزي في غ س 1,000 لمدة دقيقة 7، 4 درجة مئوية.
2. صب المادة طافية بعناية وريسوسبيند الخلايا الأعلاف بسرعة في 2 × 100 مل برنامج تلفزيوني. تجمع الخلايا.
3. الطرد المركزي الخلايا ريسوسبينديد في س 1,200 ز ل 10 دقيقة، 4 درجة مئوية.
4. صب المادة طافية بعناية وتزن بيليه (~ 20 g).
5. ريسوسبيند بيليه في 120 مل MIB المخزن المؤقت.
6. السماح للخلايا تضخم بالتحريك بلطف في غرفة باردة لمدة 10 دقائق.
7. ضع الدائرة التجويف النيتروجين على الجليد ونقل الخلايا سوليد لقاعة التجويف النيتروجين. إضافة 45 مل SM4 المخزن المؤقت (1/3 الحجم النهائي لحراكه الخلايا، حوالي 140 مل، مما أسفر عن تركيز نهائي من المانيتول السكروز و 210 ملم 70 مم).
8. ربط الدائرة التجويف النيتروجين والتعبئة مع النيتروجين حتى يصل الضغط إلى 500 رطل/بوصة مربعة. إغلاق الصنابير وتبقى معزولة في الثلج لمدة 20 دقيقة.
9. ببطء الإفراج عن الضغط في الدائرة التجويف النيتروجين وجمع (حوالي 185 مل).
10. الطرد المركزي المواد ليسيد لإزالة الحطام خلية ونواة في 800 x ز لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.
11. جمع المادة طافية التي تتدفق من خلال القماش القطني كوب أبقى على الجليد. عدم تجاهل بيليه.
12. ريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت ميبسم 90 مل (1/2 وحدة التخزين السابقة). مجانسة استخدام الخالطون دونس تفلون/الزجاج وتكرار استخدام الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.
13. جمع المادة طافية التي تتدفق من خلال القماش القطني كوب أبقى على الجليد. الجمع بين هذه المادة طافية مع المادة طافية من الخطوة 2.2.11.
14. الطرد المركزي supernatants مجتمعة في غ س 1,000 لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.
15. جمع المادة طافية التي تتدفق من خلال القماش القطني كوب أبقى على الجليد.
16. تجاهل بيليه والطرد المركزي المادة طافية المحتوية على النفط الخام الميتوكوندريا في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.
  ملاحظة: عادة ما بيليه سوف تتألف من جزأين: فضفاض وضيق.
17. عناية تغسل بيليه فضفاضة دون إزعاج جزء ضيق. ريسوسبيند بيليه ضيق في 10 مل ميبسم المخزن المؤقت.
18. إجراء مقايسة تركيز بروتين استخدام "طقم مقايسة البروتين" تجارية أو طريقة مشابهة. يتم تركيز نموذجي الغلة من 2 لتر ابتداء من الثقافة ~ 2 ملغ/مل.
19. إضافة 200 "وحدات رناسي" الدناز الحرة وترك لتناوب اسطوانة في غرفة باردة لمدة 20 دقيقة لخلط الدناز لإزالة الحمض النووي الجينوم بالتساوي.
20. الطرد المركزي في 10,000 ز س لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية، وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت 2 مل وزارة شؤون المرأة. مجانسة برفق باستخدام صغير الخالطون دونس تفلون/زجاج إلى ريسوسبيند أي المجاميع المتبقية. أداء لا يزيد على خمسة مسارات صعودا ونزولاً لتجنب الكسر. الحفاظ على الجليد.
21. إعداد التدرج السكروز في 14 مل SW40 الأنابيب بعناية بيبيتينج 1.5 مل من 60% السكروز المخزون الاحتياطي في الجزء السفلي من الأنبوب. عناية إضافة 4.5 مل 32% السكروز المخزن المؤقت الأسهم على رأس الفرقة 60% دون الإخلال بذلك. كرر مع 1.5 مل من السكروز 23% الأسهم المخزن المؤقت، ومرة أخرى مع 1.5 مل من السكروز 15% الأسهم المخزن المؤقت.
22. تحميل تعليق المتقدرية كامل (حوالي 3 مل) على رأس التدرج السكروز.
23. الطرد المركزي في دوار SW40 139, 065 س ز لمدة 60 دقيقة.
24. جمع الفرقة براون يهاجرون إلى الواجهة من 32 في المائة و 60 في المائة من السكروز استخدام ماصة نقل، وعادة من 2-3 مل بعناية.
25. الأداة الإضافية-تجميد الميتوكوندريا المنقاة في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية.

3. إعداد ميتوريبوسومي

المخازن المؤقتة المطلوبة
ملاحظة: إعداد الحلول الأسهم التالية قبل الموعد المحدد لتحلل المخزن المؤقت، السكروز وسادة/التدرج، واستثارة المخزن المؤقت.
1. جعل المخزن المؤقت لتحلل مل 10: 25 مم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 150 مم بوكل، 50 مم مجواك، 2% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، 2 مم DTT، مثبطات البروتياز.
2. جعل 10 مل السكروز وسادة المخزن المؤقت: السكروز 1 م (34% w/v)، 20 مم هيبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 100 ملم بوكل، 20 مم مجواك، 1% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، 2 مم DTT.
3. جعل المخزن المؤقت لاستثارة مل 5: 20 مم حبيس-كوه، درجة الحموضة 7.5، 100 ملم بوكل، 20 مم مجواك، 2 مم DTT
4. جعل التدرجات الخطية السكروز مع المخزن المؤقت لاستثارة 15% إلى 30% في أنابيب البولي TLS-55.
تنقية ميتوريبوسومي
1. تذويب الميتوكوندريا مجمدة في الجليد.
2. إضافة 2 حجم المخزن المؤقت تحلل،مثلاً إضافة المخزن المؤقت لتحلل 6 مل إلى 3 مل الميتوكوندريا. مزيج فورا بعكس الأنبوبة عدة مرات.
3. تجانسه مع الخالطون دونس تفلون/زجاج صغيرة لمساعدة تحلل واحتضان لمدة 5-10 دقيقة على الجليد لإكمال تحلل.
4. الطرد المركزي بالمواد ليسيد (حوالي 9 مل) في 30,000 ز x لمدة 20 دقيقة، 4 درجة مئوية إزالة المواد غير قابلة للذوبان. صب المادة طافية بعناية من بيليه وتجاهل بيليه.
5. تكرار استخدام الطرد المركزي في 30,000 س ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية لضمان توضيح المادة طافية. صب المادة طافية بعناية من بيليه وتجاهل بيليه.
6. إعداد وسادة السكروز في أنابيب TLA 120.2 (واضحة جداً): 0.4 مل السكروز وسادة كل أنبوب. إعداد أنبوب واحد كل مل تفكيك المواد.
7. طبقة تفكيك الميتوكوندريا على وسائد السكروز: حوالي 1 مل في أنبوب، ونتج عنه: نسبة وسادة من 2.5:1.
8. الطرد المركزي في عينة في 231، س 550 ز لمدة 45 دقيقة في دوار TLA120.2 في 4 درجات مئوية.
9. تجاهل المادة طافية وشطف أنابيب تسلسلياً مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت استثارة لإزالة بقايا السكروز.
10. ريسوسبيند الكريات في المجموع 100 ميليلتر استثارة المخزن المؤقت.
11. دوامة على سرعة بطيئة لمدة 30 ق حل المجاميع المتبقية والطرد المركزي في 17,949 س ز لمدة 10 دقائق في أجهزة الطرد المركزي microtube في 4 درجات مئوية.
12. جمع المادة طافية وكرر الطرد المركزي بعناية.
13. قياس امتصاص ميتوريبوسومي في ألف₂₆₀.
  ملاحظة: هو عائد نموذجي 7 A₂₆₀، مع A₂₆₀:₂₈₀ نسبة 1.3.
14. تحميل العينة كاملة على أنبوب تدرج سكروز خطية واحدة. الطرد المركزي في دوار TLS-55 في 213، ز 626 x لمدة 120 دقيقة في 4 درجات مئوية.
15. يجزئ التدرج وتحديد كثافة بصرية في A₂₆₀ وتجمع الكسر المقابلة إلى ذروة الحمض النووي معا.
  ملاحظة: Aنموذجية₂₆₀: نسبة₂₈₀ الذروة > 1.6.
16. تبادل المخزن المؤقت إذا لزم الأمر، باستخدام أسلوب الاختيار. حساب تركيز النهائي باستخدام التحويل 1 A₂₆₀ = 0.1 مغ/مل.
17. الأداة الإضافية تجميد العينة ميتوريبوسومي المنقي في المخزن المؤقت لاستثارة ومخزن في-80 درجة مئوية.

النتائج

خلايا الفاصل وناجعة جداً نقطة انطلاق أساسية لتنقية ميتوريبوسوميس النشطة. ينطبق هذا البروتوكول على أي خلايا تعليق HEK293. ونحن نستخدم خط الخلية الداخلية T501، التي تعرب عن ستابلي الناقل تحت سيطرة التتراسيكلين إيندوسيبلي. خط الخلية الأبوية هو HEK293S-GnTI^– الخلايا (جدول المواد)¹⁰. خلال نمو الخلايا، والتوسع في "الأجلين المتوسط والتعبير 293 حرة" يجب أن يبقى الحد الأدنى كثافة على 1.5 × 10⁶ خلية/مل، بغية ضمان مضاعفة معدل كل يومين، بينما الخلية الأعلى كثافة لا ينبغي أن تتجاوز ~ 5 × 10⁶ خلية/ مل عند بلوغ كثافة خلية أعلاه 3 × 10⁶ خلية/مل القريبون الخلايا وحراكه في وسائل الإعلام الطازجة، مسخن في وحدة تخزين موسعة لتحقيق كثافة الخلية الحد الأدنى من 1.5 × 10⁶ خلية/مل. تقسيم هذا يتم تنفيذ مرارا وتكرارا كل 2-3 أيام حتى يتم تحقيق كتلة خلايا المطلوب لهذا الإجراء. يمكن أن تختلف كثافة الخلية الأخيرة في النطاق من 3-4.5 × 10⁶ خلية/مل، وعلى الأقل 2 لتر مطلوب كنقطة انطلاق لعزل الميتوكوندريا. ينبغي الحفاظ على بقاء الخلية عموما > 90%، وللثقافة النهائية التي يتم حصادها > 95%. لا ينصح بعلاج ثقافة الخلية على نطاق واسع مع المضادات الحيوية.

بعد سلسلة سينتريفوجيشنز التفاضلية، حجم تعليق المتقدرية بعد الخطوة 2.2.20 عادة في المدى من 3-5 مل. ثم يتم فصل الميتوكوندريا على التدرج السكروز (الشكل 1) من العضيات الأخرى. التدرج السكروز التدرجي على استعداد أن حجم التدرج وحجم تعليق المتقدرية معا ملء الأنبوب الطرد المركزي إلى حجمه الأقصى. هنا هو الرعاية الخاصة اللازمة لجمع الفرقة براون الترحيل إلى 60 ٪/واجهة 32% مع الحد الأدنى من التلوث من المخزن المؤقت المحيطة بها. هذا أمر مهم للحفاظ على نسبة ثابتة من البروتين: المنظفات في الخطوة التالية من solubilization الميتوكوندريا. ينصح بتقييم تركيز البروتين المتقدرية في هذه المرحلة، ويتوقع عائد نموذجية من مجموع البروتين المتقدرية 15-20 ملغ من ~ 10¹⁰ مثقف HEK الخلايا.

عند عزل الميتوكوندريا ناجحة، يتم تفكيك بإضافة البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل خماسي البروم ثنائي الفينيل، ويتم فصل ميتوريبوسوميس عن طريق وسادة سكروز (الشكل 2). لفصل ميتوريبوسوميس عن مضمون الغشائي مسعور، هي حراكه الكريات في المخزن المؤقت الذي لا يحتوي على مواد التنظيف، وهم القريبون مجمعات مسعور بالطرد المركزي. يتم تكرار هذا الإجراء، وهو كمياً درجة تنقية ميتوريبوسوميس قبل A₂₆₀/نسبة₂₈₀ ألف، والذي من المتوقع أن يكون ~ 1.3. عائد نموذجي هو 7 A₂₆₀من ل 2 ابتداء من الثقافة. كما يتضمن هذا الكسر ميتوريبوسومال إضافية مجمعات المتقدرية القابلة للذوبان الكبيرة، مثل نازعة بيروفات ونازعه غلوتامات. لفصل ميتوريبوسوميس من مجمعات المتقدرية القابلة للذوبان، يتم تطبيق المادة طافية على تدرج كثافة سكروز. الكسور التي تحتوي على ميتوريبوسومي تقع عادة في الجزء السفلي الثالث من الأنبوب. ثم يمكن أن يتم تجزئة التدرج السكروز مع مكبس الآلي أو يدوياً بعناية مع أخذ 50 ميليلتر الكسور مع ماصة أو باللكم أسفل الأنبوبة بإبرة ز 21 وجمع القطرات.

اثنين من السكان ميتوريبوسومال الرئيسية المحددة في التدرج: مونوسومي 55S ووحدة فرعية كبيرة 39S، كما هو مبين في الشكل 3 و 4 الشكل. وتقترح وجود الكسر وحدة فرعية كبيرة أن يتم حصاد الخلايا في حالة تقسيم نشطة للغاية¹¹. قد تتغير النسبة بين مونوسومي وقمم فرعية كبيرة. قد تظهر ذروة إضافية الموجودة أقرب إلى الأسفل في الأعمال التحضيرية بتلويث هيولى ريبوسوم 80S. يرجى ملاحظة أن التدرج السكروز الصغيرة استخدام يتأرجح دلو الدوار TLS-55 يسمح لتنقية السريع ~ 1 مل من ميتوريبوسوميس في بكثافة بصرية من 0.4-1 ₂₆₀. فصل مونوسومي وقمم فرعية كبيرة قد تختلف بشكل طفيف اعتماداً على تجزئة، ولكن عادة ما يكون هناك بعض التداخل بين قمم اثنين. ومن ثم، الكسور التي جمع، وتجمع ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار من أجل ضمان أعلى نسبة من مونوسومي، أو وحدة فرعية كبيرة بدلاً من ذلك، في العينة. لدراسات م البرد عالية الدقة، والفصل بين الشعبين ميتوريبوسومال غير مطلوب على الإطلاق (بسبب عمليات إضافية في السيليكون ). ومع ذلك، إذا كان من الضروري فصل أفضل، يوصي باستخدام أنابيب أكبر وما يقابلها من تشغيل مرات.

figure-results-4225
الشكل 1 : تنقية الميتوكوندريا على تدرج سكروز. كان مجزأ العضيات سوبسيلولار من ل 2 ابتداء من الثقافة من خلال سلسلة من سينتريفوجيشنز التفاضلية كما هو موضح في البروتوكول، وتم فصل الميتوكوندريا على تدرج سكروز متقطع. وتوجد الميتوكوندريا المنقاة في الشريط السفلي في الواجهة 32/60%.

figure-results-4692
الشكل 2 : تنقية ميتوريبوسوميس على وسادة سكروز. ميتوريبوسوميس النفط الخام من ثقافة انطلاق ل 2 رسابة من خلال وسادة السكروز 1 متر. الكريات هي حراكه في منطقة عازلة خالية من المنظفات، ويتم توضيح ميتوريبوسوميس من سينتريفوجيشنز اثنين كما هو مبين في البروتوكول. يتم تسجيلها امتصاص لتقييم الجودة وإعداد ونموذجي أ₂₆₀/نسبة₂₈₀ ~1.3 (اللوحة اليمنى) يشهد كسر غنية ميتوريبوسومي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5409
الشكل 3 : تنقية ميتوريبوسوميس على تدرج سكروز بشكل جيد- تتبع امتصاص من ل 2 ابتداء من الثقافة. يتم ترقيم الكسور من الأعلى إلى أسفل التدرج. يتم التعرف على اثنين ميتوريبوسومال الرئيسية السكان: فرعية كبيرة (الذروة 1) ومونوسومي 55S (الذروة 2). قد تتغير النسبة بين السكان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5988
الشكل 4 : صورة مجهرية إلكترون وفئات 2D و 3D التعمير- اللوحة اليسرى: صورة مجهرية مع العينة من ذروة مونوسومي 2 في تكبير معايرة من 1.23 A/بكسل. الفريق الأوسط: بيانات بعد معالجة ممثل (2D) فصول تكشف مونوسوميس سليمة. اللوحة اليمنى: 3D التعمير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وفيما يتعلق بمصدر ابتداء من المواد، على الرغم من توافر سهلة نسبيا من الأنسجة الحيوانية التي هي معروفة لتكون مصدرا غنيا من الميتوكوندريا، يجعلها خياراً شعبيا ل^{، ميتوريبوسوميس^،من³⁵^،¹²} ¹³، لا يمكن تعديلها والمستنسخة في المختبر بسهولة وراثيا. ومن ثم، هناك حاجة عملية واضحة لتطوير البروتوكولات التي تشمل خطوط الخلايا البشرية البلوتينيوم المستزرعة. والفرق الرئيسي بين البروتوكولات هو التعامل مع الأنسجة والخلايا المستزرعة طريقة تحلل والتجانس. للخلايا المستزرعة نمت كأحادي الطبقة، هو أسلوب نموذجي تفلون/الزجاج دونس التجانس¹⁴. تم وضع البروتوكولات الإعداد الأصلي بينما تتسم بالكفاءة لجداول صغيرة¹⁵. المباشر الارتقاء بتوظيف الخالطون بسعة 500 مل ممكن¹¹، بيد أنه يتطلب ح ~ 2 من العمل اليدوي لتحقيق تحلل 80%. هذا وعرض القضايا على الأقل ثلاثة: تجميع العضيات بسبب أوقات الانتظار الطويلة، وتحلل غير متجانسة بسبب المواد الثقيلة غرق إلى الجزء السفلي من سفينة كبيرة، تدفئة العينة نظراً لضرورة ضربات متعددة. ولذلك، يستخدم أسلوب أفضل لتحلل التجويف النيتروجين، الذي يستند إلى الضغط من^،من¹⁶سفينة مضغوط¹⁷. في هذا الأسلوب، يتم أولاً تضخم الخلايا في الغرفة الباردة من أجل تليين الخلايا وتجعلها أكثر عرضه لتحلل. كما أنها توضع في الجهاز التجويف النيتروجين يتم إضافة المخزن مؤقت الذي يحتوي على السكروز والمانيتول حفاظا ضغط الاسموزي التي سوف تساعد في الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا. ثم يتم الضغط الجهاز التجويف النيتروجين مع كمية كبيرة من النيتروجين خالية من الأكسجين، الذي يذوب في الخلايا. ما الضغط فقاعات النيتروجين المفرج عنهم من الحل أسفر عن تمزيق أغشية الخلايا. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا الميكانيكية أساليب التماثل التي تنطوي على تشدد على القص والاحتكاك على النحو التالي: 1) هو تجنب أي الإجهاد البدني الخارجي على الخلايا؛ 2) توسع كظومه أن يبرد العينة، يضمن أي أضرار الحرارة العضيات؛ 3) المكونات خلية محمية من الأكسدة بغاز النيتروجين خامل؛ 4) تغيير درجة الحموضة أي تعليق المتوسطة؛ 5) عملية موحدة واستنساخه لأنه يتم تطبيق نفس القوى التخريبية داخل كل خلية وفي جميع أنحاء العينة؛ 6) هذه العملية بسرعة ويمكن أن تنجز في غضون 20-30 دقيقة.

وصف عزلة الميتوكوندريا من استزراع الخلايا والأنسجة في الأدب على نطاق واسع، وهو يستند إلى اضطراب خلية لطيف متبوعاً بسلسلة من سينتريفوجيشنز التفاضلية. معظم البروتوكولات المستخدمة حاليا اتبع الإجراءات الأصلية التي وضعت في منتصف القرن السابق¹⁸. في حين أن النهج البيوكيميائية الأساسية الصحيحة، وهناك العديد من المفاهيم الخاطئة التي سلط عليها الضوء في الأدب، وظلت غير مكتشفة. لتحسين بروتوكول ميتوريبوسوميس، نحن التحقيق في المبادئ العامة التي تم الإبلاغ عنها بشكل منتظم ونستنتج أن: 1) إدراج Mg^{2 +} وك⁺ في المخزن المؤقت غير حاسمة. وقد قيل أن يساعد بوكل للحيلولة دون تشكيل جل¹⁹، غير أن البروتينات هيولى المقدمة إضعاف كافية على النحو المبين في البروتوكول، ولدينا لا تحدث هذه الظاهرة. وعلاوة على ذلك، استبعاد Mg^{2 +} مفيدة لتقليل التلوث من ريبوسوم هيولى²⁰؛ 2) ليس هناك حاجة إبقاء نسبة أقصى حجم ممكن من الخلايا إلى المتوسط لحماية العضيات المفرج عنهم من بيئة هيبو ناضح. بما فيه الكفاية وتقدم الدعم ناضح لدينا بروتوكول المخازن المؤقتة التي تحتوي على السكروز، وتمييع الخلايا مع المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا (الخطوة 2.II.5) أمر حاسم لفصل العضيات في تحضير على نطاق واسع كفاءة.

الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا قريبة من القيم الفسيولوجية، أي 7.5، وهو أيضا الرقم الهيدروجيني الأمثل لإعداد ميتوريبوسومي التالية. عوامل الربط يدتا وعطا تضاف إلى وسائل الإعلام العزلة يخلب أيونات تلويث، وأنهم يخلب الحرة المغنيسيوم والكالسيوم، على التوالي. قد سبق أن إدراج يدتا يمكن أن يؤدي إلى أضرار غشاء الميتوكوندريا الداخلية¹⁴، ولذلك يقتصر التركيز على 1 مم كإجراء وقائي. وقد لاحظنا لا أي فرق عند استخدام 5 مم يدتا في الخطوة النهائية تنقية من السكروز الكثافة المتدرجة.

هنا يستخدم بروتوكول وصف الخلايا البشرية المستمدة من HEK293S لتنقية ميتوريبوسومي. يسمح نوعية الإعداد العينة التي تم الحصول عليها التحقيق المتحلل وهيكليا للقرار الذري. هذا يسمح لأحد بتطبيق الأسلوب على ميتوريبوسومال البشرية ترجمة المجمعات ومجالس مراقبة الجودة، ووسيطة مفارز ميتوريبوسومال. وعلاوة على ذلك، حيث قد تتضخم الخلايا السرطانية قدرة أوكسفوس وترجمة البروتين المتقدرية مرتفعة بالمقارنة مع النسيج المجاور stromal²¹، ميتوريبوسوميس أهداف المخدرات المنشأة للسرطان²². ولذلك، سوف يكون استخدام هذا البروتوكول لتنقية محددة من ميتوريبوسوميس في وجود مثبطات التطبيقات الطبية. أيضا، قد ربطت الطفرات ميتوريبوسومال بأمراض وراثية المتقدرية²³. نظراً لهذه الطفرات لها آثار مباشرة على الهيكل، النهج الذي قدم هنا ستكون مفيدة لتكييفها الهيكلي. يمكن توسيع نطاق البروتوكول تجريبيا وتطبيقها على مجموعة متنوعة من المسائل العلمية معالجة فهم أساسي للترجمة في الميتوكوندريا البشرية وأهميتها الطبية.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgements

هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة السويدية" للبحوث الاستراتيجية (FFL15:0325 منحة قادة المستقبل)، ومؤسسة سودربيرغ راغنار (زمالة في الطب M44/16)، ومجلس البحوث السويدية (× NT "المنحة ابتداء من" عام 2015-04107)، الزمالة الطويلة الأجل فيبس (SA) ، H2020-مسكاً-أي تي-2016 مشروع 721757 (ص).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate	Thermo Scientific	31966-021
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific	16000-044
Blasticidin S HCl	Thermo Scientific	R210-01
Zeocin selection reagent	Thermo Scientific	R25001	100 mg/ml
Freestyle 293 Expression medium	Thermo Scientific	12338026
T175 tissue culture flask with vented cap	Sarstedt	83.3912.002
Shaker flasks with vented cap	Thermo Scientific	4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800
250 ml conical bottle tubes, sterile	Corning	430776
Eve automated cell counter	NanoEnTek	E1000
Nitrogen cavitation cell disruption vessel	Parr Instruments	4635, 4639	safety volume: 40ml, 600ml respectively
Dnase (RNA-free)	HT Biotechnology	N401a
Teflon/glass dounce homogenizers	Cambridge Glassblowing Limited		Size designed upon request
SW40 tubes for mitochondria gradient	Beckman	344060	Polypropylene, thin wall
Transfer pipettes	Sarstedt	86.1171
TLA 120.2 tubes for cushion	Beckman	343778	Polycarbonate, thick wall
TLS-55 tubes for gradient	Beckman	347356	Ultra-clear
Gradient Station IP	BioComp	153-002

References

Ott, M., Amunts, A., Brown, A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).
Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. The structure of the human mitochondrial ribosome. Science. 348 (6230), 95-98 (2015).
Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome. Science. 348 (6232), 303-308 (2015).
Greber, B. J., Ban, N. Structure and function of the mitochondrial ribosome. Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).
Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).
Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338 (2016).
Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why?. RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).
Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics. , (2017).
Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866 (2017).
Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).
Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria. Science. 346 (6210), 718-722 (2014).
O'Brien, T. W., Kalf, G. F. Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies. Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).
Spremulli, L. L. Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues. Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).
Rice, J. E., Lindsay, J. G., Grahamand, J. M., Rickwood, D. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. , 107-142 (1997).
Attardi, G., Ching, E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).
Gottlieb, R. A., Adachi, S. Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells. Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).
Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).
Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).
Graham, J. M. Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).
Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).
Boczonadi, V., Horvath, R. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 cryo

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: