Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

Özet

Mitokondri bakteriyel ve sitoplazmik karşılıkları ayrılmaktadır ribozomlara uzmanlaşmış. İşte nasıl mitoribosomes HEK hücreleri yerli onların kompartımanda elde edilebilir göstermektedir. Mitokondri süspansiyon hücrelerden yalıtım ve bunun sonucunda mitoribosomes arınma için yöntem içerir.

Özet

İnsan mitokondri mitokondrial Genom tarafından kodlanan Oksidatif fosforilasyon kompleksleri 13 gerekli protein bileşenleri çevirmek ribozomlara (mitoribosomes) adanmış bir dizi sahip. Tüm proteinler tarafından insan mitoribosomes sentez integral membran proteinlerinin olduğundan, insan mitoribosomes çeviri sırasında mitokondrial iç membran için hayvan zinciri. Sitozolik ribozom karşılaştırıldığında mitoribosome 55S, yarım rRNA içerik, hiçbir 5S rRNA ve 36 ek protein sedimantasyon katsayısı vardır. Bu nedenle, daha yüksek bir protein RNA oranı ve atipik bir yapısı insan mitoribosome önemli ölçüde sitozolik karşılığından farklı olun.

Mitoribosome yaşam merkezi önemini rağmen iletişim kuralı yok olduğu gibi karmaşık insan hücre satırlarından arındırmak mevcut idi. Geleneksel olarak, mitoribosomes kilogram gerekli mitokondri bakımından zengin hayvan dokulardan izole edildi malzeme başlama. Biz insan hücreleri HEK293 kaynaklı besin açısından zengin ifade aracı olarak yetiştirilen bölme içinde mitokondri etkin bir mitokondri çeviri olurdu ve bu nedenle, yapısal ve biyokimyasal çalışmaların için malzeme uygun bir kaynak olabilir ki, gerekçeli mitoribosome. Yapısını araştırmak için büyük ölçekli HEK hücrelerden sağlam mitoribosomes arınma için bir protokol geliştirdi. Burada, azot kavitasyon yöntemi daha hızlı, daha az geleneksel mekanik kesme tabanlı yöntemleri hücre lizis için emek yoğun ve daha verimli alternatif olarak tanıtmak. Bu hazırlıkları olduğu gibi insan mitoribosome ve onun derleme ara ürün bileşimi ortaya yüksek çözünürlüklü yapısal onun belirlenmesi için izin mitoribosome sonuçlandı. Burada, biz bu çalışmaları takip etmek ve bir en iyi duruma getirilmiş şimdiki ve daha düşük maliyetli Yöntem sadece 10 ~¹⁰ gerektiren HEK hücreler kültürlü. Yöntem insan mitoribosomal kompleksleri, mutantlar, kalite kontrol derlemeler ve mitoribosomal alt birimleri ara ürün çeviri arındırmak için istihdam edilebilir. Arıtma doğrusal olarak on kat seçin ve aynı zamanda hücreleri, diğer türleri için uygulanan ölçeklenebilir.

Giriş

Mitokondrial protein sentezi işlemi 13 temel mt-katalitik solunum zinciri oluşturmak üzere bir özel membran bağlı mitoribosome tarafından çevrilen mRNA'ların temel alır. Değiştirilmiş mitokondrial genom ve co-translationally membran eklemek protein ihtiyacını önemli ölçüde mitokondrial ribozomlara¹mimarisini şekillendiren. Memeli mitoribosome son yüksek çözünürlüklü yapıları bakteriyel muadili^2,3çarpıcı farklı bir genel görünüme gösterdi. Özellikle, mt-rRNA tarafından iki kat azalır ve son derece diverged ~ 1 MDa ekstra molekül ağırlığı, katkıda bulunan en az 36 mitokondri-spesifik proteinler eklenir. Yapısal düzenlemeler daha önce genellikle evrensel olmak⁴korunmuş kabul hemen hemen tüm kritik fonksiyonel özellikleri değiştirin.

Yeni asıl unsurlar mitoribosomal alt birimleri her biri tarafından elde etmiş, örneğin, küçük alt birim bir içsel GTPazlar protein mS29 onun 'kafa' bölge dahil etti. GTPazlar aktivite diğer çeviri sistemleri bulunamadı ve yapısı GTPazlar alt birim derleme²' bir rol olabilir gösterir. Merkez tümsek özünü oluşturan tüm bilinen ribozomal büyük alt birimleri, bir dönüm noktası olduğuna inanılan 5S rRNA memeli mitoribosome eksik ve mt-tRNA-Val ayrılmaz bir yapı taşı olarak bunun yerine²kabul etmiştir. Ban ve meslektaşları gösterdi domuz mitoribosome mt-tRNA-Phe vardır ve değil-Val⁵. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk ve meslektaşları bu veriler üzerinde takip ve mitoribosomes hastaların güvenliği aşılan mt-tRNA-Val istikrar ile mt-tRNA-Phe^6,7prensip olarak hizmet verebilir bulundu. Neden mitoribosomes bu belirli öğeleri ve ne yollar ve transdahil olması-eşsiz bu derlemelerden bilinmeyen kalması için gerekli faktörlerdir.

Genel olarak, insan mitoribosome, yeni protein bileşenleri ve mt-tRNA benzersiz dernek yapısal bir öğesi olarak yüksek karmaşıklık olarak-henüz-bilinmeyen mitokondri özel trans -faktörler katılımı ima. Ancak, bu sistem özellikleri birçok geleneksel olarak⁸araştırmak zor olmuştur, mitokondri için benzersiz olduğundan az moleküler ve kalite kontrol mekanizması hakkında bilinir. Elektron cryo-mikroskobu (cryo-EM)²⁰göre yüksek çözünürlüklü tek parçacık analiz gelişmesiyle birlikte, kapsamlı bir şekilde montaj, eylem ve kalite kontrol insan temel moleküler mekanizmaları incelemek için fırsatları şimdi ortaya mitoribosome. İnsan mitoribosome derleme ara ilk yapısı raporumuzu bu insan mitoribosome nasıl oluştuğunu görselleştirmek mümkündür ve cryo-EM yeni transtanımlaması enstrümantal gösterir tanıma sağlar- oyunculuk derleme⁹faktörler.

Bu ilk çaba genişletmek için hızlı bir protokolü insan mitoribosome arıtma ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Protokolü'nün ilk bölümünde son derece saf sağlam mitokondri süspansiyon hücrelerden büyük ölçekli bir yalıtım açıklanmıştır. Bu yordamı 9 h gerektirir ve kolayca değiştirilebilir ve farklı hücre tipleri ve ölçekler için uyarlanmış. Bu iletişim kuralı yılında önemli bir adım hücreleri açık kırmak için azot kavitasyon kullanmaktır. Protokolü'nün ikinci bölümü mitoribosomes arındırmak için geliştirilmiştir. Bu yordam 7 h gerektirir ve mitoribosomes biyokimyasal ve yapısal çalışmaları için yeterli miktarda verir. Başlangıç materyali yüksek kaliteli son hazırlıklar teklifler ve mitokondrial oluştururlar için yaygınlaştırılması gibi saf mitokondri kullanın.

Protokol

Tüm memeli hücre kültür işleri bir biyolojik güvenlik kabin içinde gerçekleştirilmesi gerekir. Steril ekipmanları kişi içeren hücreler kullanın. Nitril eldiven ve önlük giymek ve iyi doku kültürü pratik izleyin.

1. hücre kültürü

1. HEK293S süspansiyon hücre içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 tetrasiklin-Alerjik fetal Sığır serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin ve 200 μg/mL Azitromisin, 37 ° C ve % 5 CO₂ile takıma DMEM) korumak.
2. 9 x T175 şişeler çap. Hücreleri % 90 confluency hasat ve onları vasıl 500 x g 5 dk. Resuspend Freestyl % 5 ile desteklenmiş pelleted hücrelerde spin aşağı FBS tetrasiklin ücretsiz. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu 1.5 x 10⁶ hücre/mL Bacalı sallayarak şişesi için ayarlayın.
   Not: Bu genellikle bir 1000 mL Bacalı şişesi 300 mL başlangıç bir birime karşılık gelir.
3. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya.
4. 2 gün sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3.0 x 10⁶ hücre/mL üzerinde ise hücreleri bölmek için devam edin. 2 x 10 mL taze medya hücrelerde Resuspend 2 x 150 mL hücre kültürü 5 dakika süreyle 500 g, 2 x 250 mL konik şişelerde aşağı iplik hücreleri bölme ve bir 2 x 1, 000 mL Bacalı şişeler son hücre yoğunluğu için uygun birimi içeren transfer 1.5 10⁶ hücre/mL, Örneğin bir başlangıç 2 x 300 mL x 3.0 x 10⁶ hücre/mL yoğunluğu hücre.
5. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya.
6. İki gün sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3.0 x 10⁶ hücre/mL üzerinde ise hücreleri bölmek için devam edin. Hücreler tarafından iplik 4 x 150 mL hücre kültüründe 5 dakika süreyle 500 g 4 x 250 mL konik şişe aşağı 2 x 10 mL taze medya hücrelerde Resuspend ve 2 x 2000 mL Bacalı şişesi 1.5 x son hücre yoğunluğu için uygun birimi içeren transfer Split 10⁶ hücre/mL, Örneğin 2 x 700 mL 3.0 x 10⁶ hücre/mL başlangıç hücre yoğunluğu düşük.
7. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya.
8. İki gün sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3.0 x 10⁶ hücre/mL üzerinde ise hücreleri bölmek için devam edin. 2 x 700 mL dökerek hücreleri bölme hücre kültürü içine 2 x 2800 mL şişe ve 2 x 1 L. hacmi ulaşmak için 2 x 300 mL taze medya ile kontör Bacalı
9. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ 120 rpm (50 mm sallayarak çapı) sallayarak bir kuluçka kuluçkaya.
10. 24 saat sonra hücreleri saymak ve hücre yoğunluğu 3,0-4,0 10⁶ hücre/mL x arasında ise hücre hasat.

2. mitokondri yalıtım

1. Gerekli arabellekleri
   Not: 2 L hücrelerden bir hazırlık için miktarları verilmiştir. Aşağıdaki hisse senedi çözümleri mitokondrial yalıtım arabellek (MIB), sukroz/mannitol arabellek (SM4), deneysel arabellek (MIBSM), resuspension arabellek (SEM) için önceden hazırlayın.
   1. Marka 0,5 L MIB arabellek: 50mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri.
   2. 100 mL SM4 arabellek olun: 280 mM sükroz, 840 mM mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteaz inhibitörleri.
   3. Yapmak 160 mL MIBSM arabellek: 120 mL MIB tampon + 40 mL SM4 arabellek.
   4. 200 mL PBS 4 ° C'de depolayın
   5. 5 mL SEM arabellek olun: 250 mM sukroz, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA.
   6. 4 x 10 mL stok çözümleri 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA ve % 60'ı içeren kademeli sükroz gradyan için yapmak / %32 /23% ve %15 sukroz, anılan sıraya göre.
2. Mitokondri yalıtım
   Not: Hızlı bir şekilde iş ve işlem boyunca buzda her şeyi tutmak önemlidir.
3. Kullanmadan azot kavitasyon odası önce precool.
   1. 2 x 1 L hücreleri (3-4 santrifüj tüpü başına 10⁹ hücre x) 1000 x g 7 dk, 4 ° c de Santrifüjü tarafından hasat
   2. Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak ve 2 x 100 mL PBS pelleted hücrelerde hızlı bir şekilde resuspend. Hücreleri havuz.
   3. 1200 x g 10 dk, 4 ° c de resuspended hücreleri santrifüj kapasitesi
   4. Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak ve Pelet (~ 20 g) ağırlığında.
   5. Pelet 120 mL MIB arabellekte resuspend.
   6. Hücreleri tarafından hafifçe karıştırarak 10 dakika için soğuk bir odada şişmeye izin.
   7. Azot kavitasyon odası buza koyun ve kirinden hücreleri azot kavitasyon odasına aktar. 45 mL SM4 arabellek ekleyin (1/3 resuspended hücre, yaklaşık 140 mL, 70 mM sukroz ve 210 mM mannitol son bir konsantrasyon verimli son hacim).
   8. 500 psi basınç ulaşıncaya kadar azot kavitasyon odası ve azot ile doldurun bağlayın. Musluklar ve 20 dakika buzda izole tutmak kapatın.
   9. Yavaş yavaş azot kavitasyon odasında basınç ve lysate toplamak (yaklaşık 185 mL).
   10. Hücre artıkları ve çekirdek 800 x g 15 dakika, 4 ° c de kaldırmak için lysed malzeme santrifüj kapasitesi
   11. Süpernatant ile tülbent içine bir ölçek üzerinde buz tuttu sağanak tarafından toplamak. Pelet atmayın.
   12. Pelet 90 mL MIBSM arabellekte resuspend (1/2 önceki ses). Teflon/cam Dounce homogenizer kullanarak homojenize ve 15 dk, 4 ° C. vasıl 800 x g aralıklarla tekrarlayın
   13. Süpernatant ile tülbent içine bir ölçek üzerinde buz tuttu sağanak tarafından toplamak. Bu süpernatant adım 2.2.11 süpernatant ile birleştirin.
   14. 1000 x g 15 dakika, 4 ° c de kombine supernatants santrifüj kapasitesi
   15. Süpernatant ile tülbent içine bir ölçek üzerinde buz tuttu sağanak tarafından toplamak.
   16. Pelet atmak ve 10.000 x g 15 dakika, 4 ° c'de ham mitokondri içeren süpernatant santrifüj kapasitesi
       Not: Pelet genellikle iki bölümden oluşur: gevşek ve sıkı.
   17. Dikkatlice gevşek Pelet sıkı bölümü bozmadan yıkayın. Sıkı Pelet 10 mL MIBSM arabellekte resuspend.
   18. Bir ticari Protein tahlil Kit veya benzer bir yöntemi kullanarak bir protein konsantrasyonu tahlil gerçekleştirin. Tipik konsantrasyon verimleri 2 kültür başlangıç l ~ 2 mg/mL ' dir.
   19. 200 adet RNase free DNaz eklenir ve eşit DNaz genomik DNA kaldırılması için karıştırmak 20 dakika soğuk odada bir rulo üzerinde döndürmek için bırakılır.
   20. 10.000 x g 15 dakika, 4 ° C de santrifüj kapasitesi ve 2 mL SEM arabellekte Pelet resuspend. Yavaşça kalan herhangi bir toplamları resuspend için küçük bir Teflon/cam Dounce homogenizer kullanarak lunaparkçı. Kırılma önlemek için değil daha--dan beş alçalarak geçer gerçekleştirmek. Buz üstünde tutun.
   21. 14 mL sukroz degradede dikkatle tüpün dibine % 60 sükroz stok arabelleği 1.5 mL pipetting tarafından SW40 tüpleri hazırlayın. Dikkatli bir şekilde rahatsız etmeden 4.5 mL % 32 sükroz stok arabelleği % 60 grubun üstüne ekleyin. 1.5 mL % 23 sükroz stok arabelleği ve tekrar 1,5 mL % 15 sükroz stok arabelleği ile yineleyin.
   22. Sükroz degrade üstüne tüm mitokondrial süspansiyon (yaklaşık 3 mL) yükleyin.
   23. Santrifüj kapasitesi SW40 rotor, 139, 065 x g 60 dk için.
   24. Dikkatli bir şekilde kullanarak transfer pipet, genellikle 2-3 mL % 32 ve % 60 sükroz arabirimine geçiş kahverengi grup toplamak.
   25. Ek-arıtılmış mitokondri donma sıvı azot ve-80 ° C'de store

3. Mitoribosome hazırlık

1. Gerekli arabellekleri
   Not: aşağıdaki hisse senedi çözümleri lizis arabellek, sukroz yastık/gradient ve resuspension arabellek için önceden hazırlayın.
   1. 10 mL lizis arabellek olun: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, % 2 Polietilen glikol octylphenyl eter, 2 mM DTT, proteaz inhibitörleri.
   2. 10 mL sukroz yastık arabellek olun: 1 M sukroz (%34 w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, % 1 Polietilen glikol octylphenyl eter, 2 mM DTT.
   3. 5 mL resuspension tampon yapmak: 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT
   4. % 15-%30 resuspension arabellek degradelerle doğrusal sükroz TLS-55 Polikarbonat tüplerde olun.
2. Mitoribosome arıtma
   1. Buzda donmuş mitokondri çözdürün.
   2. 2 cilt lizis arabelleği eklemek,Örneğin eklemek 6 mL lizis arabellek 3 mL mitokondri. Hemen tüp birkaç kez ters çevirme ile karıştırın.
   3. Ve 5-10 dk lizis tamamlamak için buz üzerinde kuluçkaya lizis yardımcı olmak üzere küçük bir Teflon/cam dounce homogenizer ile homojenize.
   4. Lysed malzeme (yaklaşık 9 mL) santrifüj kapasitesi 30.000 x g 20 dk, 4 ° C çözünmez malzeme çıkarmak için de. Süpernatant Pelet dikkatle üzerinden dikkatle boşaltmak ve Pelet atın.
   5. Santrifüjü 30.000 x g de 20 dk 4 ° C'de süpernatant açıklama sağlamak için yineleyin. Süpernatant Pelet dikkatle üzerinden dikkatle boşaltmak ve Pelet atın.
   6. TLA 120.2 tüpler (Ultra net) sükroz yastık hazırlamak: 0.4 mL sukroz yastık tüp başına. Lysed malzeme mL başına bir tüp hazırlayın.
   7. Lysed mitokondri sükroz minderlerin üzerinde katman: yaklaşık 1 mL Tüp, bir lysate kaynaklanan ücret: 2.5:1 yastık oranı.
   8. Örneği 231 ', 550 x g TLA120.2 Open End 4 ° C'de 45 dk santrifüj kapasitesi
   9. Süpernatant atın ve kalan sükroz kaldırmak için resuspension arabelleği 100 µl sırayla tüplerini durulayın.
   10. Granül toplam 100 µl resuspension arabellek resuspend.
   11. Girdap üstünde yavaş hız 30 s kalan toplamları dağıtılması ve 17,949 x g microtube santrifüj 4 ° C'de 10 min için de santrifüj kapasitesi
   12. Dikkatle süpernatant toplamak ve aralıklarla tekrarlayın.
   13. A₂₆₀mitoribosome emme ölçmek.
       Not: 7 A₂₆₀, ile A₂₆₀tipik verimidir: A₂₈₀ oranı 1,3.
   14. Tüm örnek bir tek doğrusal sükroz Degrade tüp üzerine yükleyin. TLS-55 rotor, 213, 626 x g 4 ° C'de 120 dk santrifüj kapasitesi
   15. Geçişin fractionate, A₂₆₀ optik yoğunluk belirlemek ve nükleik asit zirveye birlikte karşılık gelen kesir havuz.
       Not: Tipik A₂₆₀: tepe A₂₈₀ oranı > 1,6.
   16. Gerekirse, seçtiğiniz yöntemi kullanarak arabellek değişimi. Dönüşüm 1 A₂₆₀ kullanarak son konsantrasyonu hesaplama 0.1 mg/mL =.
   17. Ek arıtılmış mitoribosome örnek resuspension arabellek ve store-80 ° C'de dondurmak

Sonuçlar

Hücre bölünmesi ve son derece uygun active mitoribosomes arınma için önemli bir başlangıç noktasıdır. Bu iletişim kuralı HEK293 süspansiyon hücreler için geçerlidir. Kurum içi hücre kültürünü stabil bir ışınlama tetrasiklin-indüklenebilir kontrol altında ifade T501 kullanıyoruz. Ebeveyn hücre HEK293S-GnTI^- hücreleri (Tablo reçetesi)¹⁰' dur. Hücre büyüme ve genişleme FreeStyle 293 ifade en az yoğunluğu 1.5 x 10, tutulması orta sırasında maksimal hücre ise yoğunluğu her iki günde bir katlama oranı sağlamak için⁶ hücre/mL, 5 ~ 10⁶ hücreli x aşmaması gerekir / 3 x 10⁶ hücre/mL üzerindeki bir hücre yoğunluğu ulaşan mL. üzerine hücreleri pelleted ve 1.5 x 10⁶ hücre/mL en düşük hücre yoğunluğu elde etmek için genişletilmiş bir birimdeki taze, önceden ısıtılmış bir ortamda resuspended. Bu bölme her 2-3 gün bir istenen hücre toplu işlem için elde kadar art arda gerçekleştirilir. Son hücre yoğunluğu 3-4.5 x 10⁶ hücre/mL aralığında değişebilir ve en az 2 lt mitokondri yalıtım için bir başlangıç noktası olarak gereklidir. Hücre canlılığı genel olarak saklanması gereken > % 90'ı ve hasat edilir son kültür için > % 95. Büyük ölçekli hücre kültürü antibiyotiklerle tedavi önerilmez.

Fark centrifugations dizi sonra adım 2.2.20 sonra mitokondrial süspansiyon genellikle 3-5 mL aralığında birimdir. Mitokondri sonra diğer organelleri sükroz degrade (Şekil 1) ayrılır. Öyle ki maksimal hacmi Santrifüjü tüp geçişin hacmi ve mitokondrial süspansiyon birlikte hacmi doldurmak kademeli sükroz degrade hazır. Burada özel bakım % 60 geçirme kahverengi grup toplamak için gereken / % 32 arabirimi çevreleyen arabellek en az kirlenme ile. Bu mitokondri solubilization aşağıdaki adımda sürekli protein: deterjan oranı tutmak için önemlidir. Mitokondrial protein konsantrasyonu bu aşamada değerlendirmek için tavsiye edilir ve 15-20 mg toplam mitokondrial protein tipik bir verim ~ 10¹⁰ kültürlü HEK hücrelerden bekleniyor.

Başarılı mitokondri yalıtım, üzerine Polietilen glikol octylphenyl eter eklenmesi tarafından lysed ve mitoribosomes bir sükroz yastık (Şekil 2) ile ayrılır. Hidrofobik membranöz maddeden mitoribosomes ayırmak için granül deterjan içermeyen arabellekte resuspended, ve hidrofobik kompleksleri Santrifüjü tarafından pelleted. Bu yordamı yinelenir ve mitoribosomes arıtma derecesi A₂₆₀tarafından sayısal / ~ 1.3 olması bekleniyorA₂₈₀ oranı. 2 kültür başlangıç l 7 A₂₆₀ tipik verimidir. Bu mitoribosomal kesir pyruvate dehidrogenaz ve glutamat dehidrojenaz gibi ek büyük çözünür mitokondrial kompleksleri de içerir. Mitoribosomes çözünür mitokondrial kompleksleri ayırmak için süpernatant sükroz yoğunluğu degradeye uygulanır. Mitoribosome içeren kesirleri genellikle alt kısmında yer tüp üçüncü. Ayırma sükroz geçişin ardından otomatik bir piston ile veya el ile 50 µL kesirler bir pipet ile dikkatli bir şekilde alarak veya tüp alt 21 G iğneyle delme ve damla toplama tarafından yapılabilir.

İki büyük mitoribosomal nüfus gradyan içerisinde tanımlanır: monosome 55S ve büyük alt birim 39S, olarak gösterildiği Şekil 3 ve Şekil 4. Hücreleri bir son derece aktif bölme devlet¹¹' hasat büyük alt birim kesir varlığını göstermektedir. Monosome ve büyük alt birim tepeler arasındaki oranı değişebilir. Daha yakın altına bulunan ek bir tepe müstahzarları sitoplazmik ribozomlara 80S kirletici ile görüntülenebilir. Lütfen mitoribosomes 0.4-1 biroptik bir yoğunluğu, ~ 1 mL hızlı arıtma için sallanan kullanarak küçük sükroz degrade rotor TLS-55 kova Not sağlar₂₆₀. Monosome ve büyük alt birim doruklarına ayrılması birbirinden ayırma bağlı olarak farklı olabilir, ancak genellikle iki zirvesinin bazı örtüşme olduğunu. Bu nedenle, toplamak için hangi kesirler ve havuzu monosome veya alternatif olarak büyük alt birimi, örnekteki en yüksek oranda emin olmak için göz önüne alınmalıdır. Yüksek çözünürlüklü cryo-EM çalışmaları için iki mitoribosomal nüfus arasındaki mesafeyi (ek silico faaliyetlerden kaynaklanan) kesinlikle gerekli değildir. Ancak, daha iyi ayırma gerekli ise, daha büyük tüpler ve defa çalıştırılmasını karşılık gelen kullanmak için tavsiye edilir.

Resim 1 : Mitokondri sükroz degrade üzerinde arıtma. İletişim kuralında tanımlandığı gibi bir 2 l kültür başlayan hücre altı organelleri fark centrifugations bir dizi sayesinde şeker ve mitokondri kesintili sükroz degradeyi ayrı kaldık. Arıtılmış mitokondri 32 %60 arayüzüne daha düşük bant bulunur.

Resim 2 : Mitoribosomes bir sükroz yastık üzerinde arıtma. 2 L başlangıç kültüründen ham mitoribosomes 1 M Sükroz yastık posalı. Granül deterjan-Alerjik bir arabellek resuspended ve iki centrifugations tarafından iletişim kuralında tanımlandığı gibi mitoribosomes açıkladı. Absorbans hazırlık ve tipik A₂₆₀kalitesini değerlendirmek için kaydedilir / mitoribosome zengin KesirA₂₈₀ ~1.3 (doğru kapı aynası) oranını onaylar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Güzel mitoribosomes sükroz degrade üzerinde arıtma. 2 kültür başlangıç L absorbans izleme. Kesirler en baştan geçişin altına numaralandırılır. İki büyük mitoribosomal nüfus tanımlanır: büyük alt birim (tepe 1) ve monosome 55S (tepe 2). Nüfus arasındaki oranı değişebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Elektron test, 2D sınıfları ve 3D yeniden yapılanma. Sol kapı aynası: bir test ile monosome en yüksek 2 1,23 A bir kalibre edilmiş büyütmede örnekten / piksel. Orta paneli: Sağlam monosomes açığa bir temsilcisi son işlem veri (2D sınıfları). Doğru kapı aynası: 3D yeniden yapılanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Mitokondri, zengin bir kaynak olarak bilinen hayvan dokuları nispeten kolay durumu geçici olsa da bu mitoribosomes^{3,5,12için popüler bir seçim malzemesi, başlangıç kaynak ile ilgili olarak, 13}, onlar cant genetik olarak değiştirilebilir ve laboratuarda kolayca çoğaltılamaz. Bu nedenle, homojen kültürlü insan hücre satırlarını içeren protokoller geliştirmek için bir açık pratik gerek yoktur. En önemli fark arasında protokoller doku ve kültürlü hücreleri ile ilgili lizis ve homojenizasyon modudur. Bir monolayer yetiştirilen kültürlü hücreler için Teflon/cam dounce homojenizasyon¹⁴tipik bir yöntemdir. Özgün hazırlık protokolleri verimli iken küçük ölçekli¹⁵için geliştirilmiştir. Doğrudan bir homogenizer 500 mL kapasiteli istihdam yukarı ölçekleme mümkün¹¹, ancak, ~ 2 h % 80 lizis elde etmek için el ile emek gerektirir. Bu en az üç sayı tanıttı: toplama organelleri uzun bekleme süreleri nedeniyle, ağır malzeme büyük bir gemi, altına batan nedeniyle homojen olmayan lizis örnek birden fazla konturlar gerekliliği nedeniyle Isıtma. Bu nedenle, basınçlı kap^16,17dekompresyon dayalı azot kavitasyon lizis tercih yöntemi kullanır. Bu yöntemde, hücreler hücreleri yumuşatır ve lizis daha duyarlı olmaları için soğuk oda ilk arttı. Bunlar azot kavitasyon cihazda yerleştirilir sukroz ve mannitol içeren bir arabellek mitokondri sağlam tutmak yardımcı olacak bir ozmotik basınç sağlamak için eklenir. Azot kavitasyon cihazı sonra çözülür hücreleri oksijensiz azot büyük miktarda basınç altında. Baskı yayımlanan azot kabarcıklar hücre zarı rüptür sonucu çözüm dışında olduğu gibi. Bu yöntem mekanik homojenizasyon yöntemleri içeren aşağıdaki gibi kesme vurguluyor ve sürtünme birkaç avantaj sunar: 1) herhangi bir dış fiziksel stres hücrelerde önlenmiş olur; 2) örnek soğur adyabatik bir genişleme organelleri hasar yok ısı sağlar; 3) hücre bileşenleri oksidasyon inert azot gazı tarafından korunur; 4) pH hiçbir değişiklik suspending orta; 5) aynı yıkıcı güçler her hücre içinde ve örnek boyunca uygulandığından düzgün ve tekrarlanabilir işlemidir; 6) işlemi hızlı ve 20-30 dakika içinde tamamlanabilir.

Mitokondri kültürlü hücre ve dokulara yalıtım literatürde yaygın olarak tarif edilmiştir ve bu fark centrifugations bir sıra tarafından bir nazik hücre bozulma dayanır. Şu anda kullanılan protokolleri çoğunu önceki yüzyıl¹⁸ortasında geliştirilen özgün yordamları izleyin. Temel biyokimyasal yaklaşımlar doğru ancak literatürde vurgulanmış ve fark edilmeden kaldı birkaç yanlış vardır. Biz sistematik olarak bildirilen genel ilkeleri incelenmiş ve sonuç mitoribosomes için iletişim kuralı en iyi duruma getirmek için: 1) dahil edilmesi Mg^{2 +} ve K⁺ arabellek çok önemli değil. Bu olay oluşmaz KCl yardımcı olur bir jel¹⁹, ancak, sitoplazmik protein önleyebilirsiniz bizim protokol açıklandığı gibi yeterli bir seyreltme sağlanan iddia edilmiştir. Ayrıca, dışlanma Mg^{2 +} contaminations sitoplazmik ribozomlara²⁰tarafından azaltmak yararlıdır; 2) yayımlanan organelleri hipo-ozmotik ortamından korumak için orta hücreleri maksimal mümkün hacim oranı tutmak için gerek yoktur. Bizim iletişim kuralı ozmotik desteğinde yeterince Sükroz içeren arabellekleri ve mitokondri yalıtım arabellek içeren hücrelerin seyreltme tarafından sağlanan (2.II.5 adım) büyük ölçekli bir hazırlık organelleri verimli ayrılması için önemlidir.

Mitokondri yalıtım tamponunun pH fizyolojik değerleri yakın yani 7.5, hangi de aşağıdaki mitoribosome hazırlık için optimum pH olmasıdır. Bağlama ajan EDTA ve EGTA bulaşıcı iyonları şelasyon yapın için yalıtım medya eklenir ve onlar-şelasyon yapın ücretsiz magnezyum ve kalsiyum, anılan sıraya göre. EDTA dahil iç mitokondri zar¹⁴hasar için yol açabilir, bu nedenle konsantrasyonu bir önlem olarak 1 mM için sınırlıdır tartışıldı. Biz herhangi bir fark 5 mM EDTA sükroz yoğunluğu geçişin son arıtma adımda kullanırken gözlemledik değil.

Açıklanan protokol burada insan hücreleri HEK293S elde edilen mitoribosome arınma için kullanır. Hazırlık kalitesini biyokimyasal olarak ve yapısal olarak atomik çözünürlük için soruşturma olması elde edilen örnek sağlar. Bu bir insan mitoribosomal kompleksleri, kalite kontrol derlemeler ve mitoribosomal alt birimleri ara ürün çeviri yöntemi uygulamak izin verir. Ayrıca, kanser hücrelerinin OXPHOS kapasitesi ve bitişik stromal doku²¹ile karşılaştırıldığında yüksek mitokondrial protein çeviri güçlendirilmiş beri mitoribosomes kanser²²için kurulan uyuşturucu hedefler vardır. Bu nedenle, bu iletişim kuralını kullanan mitoribosomes belirli arıtma için inhibitörleri huzurunda tıbbi uygulamalar olacaktır. Ayrıca, mitoribosomal mutasyonlar kalıtsal mitokondriyal hastalıklar²³için bağlantılı olmuştur. Bu mutasyonlar yapısı üzerinde doğrudan etkileri olduğundan, burada sunulan yaklaşım onların yapısal karakterizasyon için faydalı olacaktır. Protokol deneysel olarak genişletilmiş ve bilimsel sorular mücadele insan mitokondri çeviride temel anlayış ve tıbbi önemini çeşitli için uygulanır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate	Thermo Scientific	31966-021
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific	16000-044
Blasticidin S HCl	Thermo Scientific	R210-01
Zeocin selection reagent	Thermo Scientific	R25001	100 mg/ml
Freestyle 293 Expression medium	Thermo Scientific	12338026
T175 tissue culture flask with vented cap	Sarstedt	83.3912.002
Shaker flasks with vented cap	Thermo Scientific	4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800
250 ml conical bottle tubes, sterile	Corning	430776
Eve automated cell counter	NanoEnTek	E1000
Nitrogen cavitation cell disruption vessel	Parr Instruments	4635, 4639	safety volume: 40ml, 600ml respectively
Dnase (RNA-free)	HT Biotechnology	N401a
Teflon/glass dounce homogenizers	Cambridge Glassblowing Limited		Size designed upon request
SW40 tubes for mitochondria gradient	Beckman	344060	Polypropylene, thin wall
Transfer pipettes	Sarstedt	86.1171
TLA 120.2 tubes for cushion	Beckman	343778	Polycarbonate, thick wall
TLS-55 tubes for gradient	Beckman	347356	Ultra-clear
Gradient Station IP	BioComp	153-002