أزرق تولويدين تلطيخ أبواب جزءا لا يتجزأ من الراتنج للتقييم مورفولوجيا الأعصاب الطرفية

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتصور الهياكل الدقيقة للأعصاب المحيطية بالحصول على وتلوين الأجزاء 1-2 ميكرومتر مع تولويدين الأزرق

Abstract

الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية. نظراً للتوزيع على نطاق واسع، وكثيراً ما تلف الأعصاب الطرفية بسبب الصدمة أو المرض. كما وضعت أساليب واستراتيجيات لتقييم إصابات الأعصاب المحيطية في نماذج حيوانية، الدالة والتجدد، تحليل مورفوميتري للأعصاب الطرفية أصبح قياس نتائج محطة أساسية. تولويدين الأزرق تلطيخ العصب عبر المقاطع التي تم الحصول عليها من فروع العصب راتنج مضمن أسلوب استنساخه لعمليات التقييم النوعي والكمي للأعصاب المحيطية، وتمكين التصور مورفولوجيا عدد محاور عصبية ودرجة مييلينيشن. هذا الأسلوب، كما هو الحال مع العديد من أساليب نسيجية أخرى، يكون من الصعب تعلم وإتقان استخدام البروتوكولات المكتوبة القياسية. والغرض من هذا المنشور ذلك لإبراز البروتوكولات المكتوبة تولويدين الأزرق تلطيخ للأعصاب الطرفية مع بالفيديو للأسلوب، استخدام الأعصاب الوركي حصادها من الفئران. في هذا البروتوكول، يصف لنا في فيفو التثبيت بالاعصاب الطرفية ومجموعة من الأنسجة، وبعد انتهاء التثبيت مع 2% أكسيد الاوزميوم، تضمين للأعصاب في راتنج الإيبوكسي، وتقطيع أولتراميكروتومي للأعصاب بسمك 1-2μm. أقسام الأعصاب ثم نقلها إلى شريحة زجاجية والملون بالأزرق تولويدين، بعدها يتم كمياً ونوعيا قيموا. وترد أمثلة للمشاكل الأكثر شيوعاً، فضلا عن الخطوات اللازمة للتخفيف من هذه المسائل.

Introduction

الأعصاب المحيطية تمتد في جميع أنحاء الجسم، إينيرفاتينج الأنسجة المستهدفة مع محاور عصبية الحركية أو الحسية¹. العيوب الأعصاب المحيطية الناجمة عن الاضطرابات الطبية والصدمة تمثل شاغلا رئيسيا لصحة العامة والآثار الاقتصادية الكبيرة^2،3. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تقييم نتائج إصابات الأعصاب المحيطية وفهم العصب التجدد، الأساليب التقليدية مثل الأنسجة العصبية وتلطيخ تقنيات أداتين أساسيتين كمياً ونوعيا تقييم صحة العصب كقياس نتائج المحطة طرفية في نماذج حيوانية أو قصت الأنسجة البشرية. هذا هو غالباً ما يقترن القياسات الكهربية لوظيفة الأعصاب الطرفية، حيث يمكن أن تكشف عن مورفوميتري لماذا تجدد الأعصاب وظيفية أو لم يحدث.

أزرق تولويدين تلطيخ راتنج المضمنة أقسام شبه رقيقة الأعصاب الطرفية هو أسلوب متخصصة للتصوير myelinated الألياف العصبية، توفير جودة عالية وواضحة صور مفصلة للعصب هياكل^4،5،6 . أزرق تولويدين وصمة عار ميتاتشروماتيك acidophilic، اكتشف ويليام هنري بيركن في⁷من 1856، وقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات الطبية⁸. تولويدين الأعصاب الطرفية ملطخة باللون الأزرق المقاطع التي تم الحصول عليها من شرائح جزءا لا يتجزأ من الراتنج العصب يسمح لتصور واضح لهياكل العصب. ويمكن تعزيز التصور هيكل غمد المايلين باستخدام أكسيد الاوزميوم بعد انتهاء التثبيت^4،9. أكسيد الازميوم هو سامة الأكسدة والدهون مثبت عامل يتفاعل مع سندات مزدوجة في الدهون، أسفر عن¹⁰من اﻷغماد المايلين الغنية بالدهون محددة بشكل صارخ. بيد أكسيد الاوزميوم السامة، ومكلفة وتتطلب من حضانة أطول من شرائح العصب، ولا يستخدم دائماً.

وقد وضعت أساليب بديلة لمعالجة وتلطيخ للتصور مورفولوجيا الأعصاب المحيطية؛ البارافين وتمزيقها المبردة، وتقطيع العصب جزءا لا يتجزأ من راتنج الإيبوكسي تليها تلطيخ مع أزرق تولويدين أو حل فينيلينيدياميني قد استخدمت لقياس التغيرات المورفولوجية للأعصاب المحيطية التجديد ^11،12 . كل هذه الأساليب لديها مزايا والغلة البيانات الأساسية في العدد من محاور عصبية وسمك المايلين وقطر إكسون وقطر إكسون للألياف ميليناتيد القطر (ز-نسبة) ^11،،من^1314،15 .

الفرق الأساسي من الراتنج التضمين في هذا البروتوكول أنه يسهل الحصول على 1-2 ميكرومتر سمك المقاطع العرضية بسبب صلابة الراتنج مع الحفاظ على الصفات النسيجي للعصب. توفر هذه المقاطع رقيقة، بدلاً من 4-5 ميكرومترات سمك المقاطع التي تم الحصول عليها من البارافين التضمين، أقسام الأعصاب الطرفية مع دقة أعلى، مما يسمح لتحديد كمي myelination إكسون، مثل نسبة ز، التي لا يمكن أن تكون أكثر دقة التي تم الحصول عليها من أثخن الأبواب¹⁶. بينما تمزيقها المبردة التي يمكن استخدامها للحصول على الأجزاء 1-2 ميكرومتر، فقد خبرتنا أن من الأصعب الحصول على المقاطع دون تصدعات كبيرة عديدة. يمكن أن يسبب مثل هذه المقاطع متصدع عد غير دقيق لعدد محاور عصبية وجوانب مييلينيشن.

بالإضافة إلى أزرق تولويدين تلطيخ¹⁷، يمكن أيضا استخدام فضية تلطيخ الأسلوب¹⁸ و Masson's trichrome المصبوغة⁴ لإظهار العصب محاور عصبية. ومع ذلك، استخدام الراتنج تضمين المقاطع العصب الوسيط الفئران الملون مع أما الهيماتوكسيلين ويوزين أو ماسون في اﻷغماد المايلين خافت أظهرت trichrome وهياكل غير المعترف بها، بينما تلطيخ تولويدين الأزرق وأظهرت صورة واضحة المايلين غمد ويمكن بسهولة تكون الكمية⁴. وعلى الرغم من بعض القيود، الأعصاب تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج المضمنة الطرفية هو تقنية قيمة يمكن استخدامها عندما تكون الصور عالية الدقة للعصب مورفولوجيا مطلوباً.

العيب الرئيسي لتضمين الراتنج هو أنها تستغرق وقتاً طويلاً ولا تسمح إيمونوستينينج النسيج نفسه نظراً لصعوبة استرجاع مستضد بالمقارنة مع البارافين وتقنيات الأقسام المضمنة المجمدة. وهكذا، من غير الممكن عموما الاستفادة من الأنسجة نفسها إيمونوستينينج التي يتم معالجتها عن طريق تضمين الراتنج لتلطيخ تولويدين الأزرق. على الرغم من عدم المستخدمة هنا، إذا كان المطلوب هو إيمونوهيستوتشيميستري في الراتنج يسمح المضمنة أقسام، استخدام ميثاكريلات غليكول التضمين راتنجات immunohistochemistry المراد تنفيذها على أقسام الأنسجة، إلا أنها باهظة الثمن نسبيا¹⁹. هذا يمكن التخفيف إلى حد ما بقطع الأعصاب الطرفية إلى أجزاء منفصلة، وبعض لتضمين الراتنج وآخرون ل immunostaining مباشرة بعد التثبيت.

عملية تولويدين الأزرق تلطيخ راتنج مضمن الأعصاب المحيطية، كما مع تحليل آخر نسيجية، يمكن تقسيم إلى خمس مراحل، بما في ذلك التثبيت، الجفاف، والتضمين، وتمزيقها، وتلطيخ²⁰. ونحن نهدف هنا إلى توفير بروتوكول ومبادئ توجيهية عملية لاستخدام الراتنج الملون فروع العصب الوركي الفئران المضمنة مع تولويدين الأزرق للحصول على صور ذات جودة عالية.

Protocol

واستخدمت الفئران "سبراغ داولي" الكبار في هذا المشروع ووافق جميع الإجراءات بجامعة وايومنغ مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة.

1-الجراحة وفي تثبيت العصب فيفو

ملاحظة: يتم سرد معلومات المورد لجميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول للمواد.

ملاحظة: يتم استخدام في فيفو التثبيت العصب للمحافظة على الأنسجة والحد من التدهور الهيكلي التي يمكن أن تحدث بين وقت الوفاة وجمع للأعصاب. في فيفو تثبيت الأنسجة ممارسة معيارية لإعداد النسيج العصبي للأنسجة، حيث التروية غالباً ما تكون مقدمة لهذا. موضع وحجم الأعصاب المحيطية المسموح به للتثبيت في الموقع. لا نوصي بجمع وتثبيت الأنسجة بعد القتل الرحيم نظراً لإمكانية تدهور الأنسجة.

1. إعداد الفئران للتخدير العام بوضعه في دائرة للاستقراء مع إيسوفلوراني 2-3%، ثم وضع الفئران أنيسثيتيزيد في موقف المعرضة على رأس حصيرة تشريح والاحتفاظ بها في 1-2% إيسوفلوراني عن طريق تخدير الآنف مخروط. لضمان العمق الكافي للتخدير، اختبار الحيوانات لسحب الدواسة تحت أقدام هند والتحقق من عدم وجود ردود الفعل بالبيبرال في العيون بلمس كانتوس الآنسي للعين.
   ملاحظة: حقن داخل الكيتامين بديل استخداماً إلى المستنشق isoflurane.
2. كشف العصب الوركي، حلق شعر hind limb(s) وتنظيف المناطق حلق مع الإيثانول 70%. بدون مشرط أو مقص، جعل شق 2-3 سم في الجلد على طول أطرافهم هند من الركبة حتى تروتشانتير أكبر، حيث الجس من عظم الفخذ باستخدام مشرط معقم لضمان الموقع المناسب للشق. ويقع عظم الفخذ الدانية فقط في متناول معظم الجزء من العصب الوركي. على الرغم من أن هذا عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة، المحافظة على تقنيات عقيمة.
3. بعد إجراء شق الجلد، تحديد موقع الطائرة بين العضلات الفخذية ذات الرأسين وعضلة عضلة مكسيموس، واستخدام مقص ميكروديسيكشن فصل اللفافة الكامنة وفضح 2-3 سم على العصب الوركي التسطير. لعرض مقطع واضح للعصب الوركي، استخدام ضام إلى توسيع الفجوة بين عضلات هما (الشكل 1A). مع غرامة ملقط ومقص آيريس، بعناية منفصلة العصب من الأنسجة الضامة، أخذ عناية كبيرة ليس ضغط أو قطع العصب المحيطة.
4. إضافة مثبت كافية ترامب (فورمالدهايد 4 ٪، 1 ٪ glutaraldehyde في 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) مع 1.16 غرام NaH2PO4· H2O كل 100 مل) في تجويف يحتوي على الأعصاب المكشوفة لتغطية العصب والسماح للجلوس لمدة 10 دقائق. إذا كان ضروريا، شاش مكان تحت هند الساق لتحسين الزاوية بحيث يمكن إضافة مزيد من مثبت في التجويف. إزالة مثبت بعد 10 دقيقة، وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
5. استخدام مجهر تشريح، قطع العصب من كلا الجانبين باستخدام مقص تشريح غرامة، مع التأكد من عدم تمدد أو قرصه العصب الوركي، وفورا بوضع المقاطع العصب في أنابيب 15 مل تحتوي على مثبت ترامب في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد، تغيير مثبت كل 48 ساعة.
6. لا تترك الحيوانات غير المراقب خلال أي جزء من العملية الجراحية. بعد إزالة العصب، euthanize الحيوانات بخلع عنق الرحم تحت التخدير.

2-أكسيد الاوزميوم المعاملة وتضمينها الراتنج

1. بعد التثبيت، بعناية إزالة أي الدهون المتبقية والأنسجة الضامة من العصبية واستخدم مشرط حاد لقطع العصب إلى شرائح حوالي 5 مم في الطول (العصب يمكن فصل أجزاء والمسمى في أنابيب مختلفة). إعداد الطازجة أكسيد أوزميوم 2% المخفف في حل مثبت ترامب وتبقى في أنبوب زجاج. تزج شرائح العصب في أكسيد الاوزميوم 2% ح 2، التي يمكن أن تكون في أنابيب بلاستيكية لهذه الفترة القصيرة من الزمن.
   ملاحظة: بعض أنابيب البلاستيك يتفاعل مع أكسيد الاوزميوم، مما تسبب سواد من الحل، ولذلك لا ينصح بتخزين طويلة من أكسيد الاوزميوم في أنابيب بلاستيكية.
2. استخدام الإيبوكسي تضمين مجموعة متوسطة، إعداد الصيغة النهائية التضمين:
   1. المزيج الإيبوكسي التضمين المتوسطة مع الحل دسا (دوديسينيلسوكسينيك الخل؛ خليط A) والمزيج الإيبوكسي التضمين المتوسطة مع دكتور الحل (ميثيلناديك الخل؛ خليط ب). واسمحوا كلا المخاليط مزيج أ وب 20 دقيقة على الأقل بالتحريك مع محرض مغناطيسية.
   2. فورا قبل الاستخدام، مزيج الخليط A و B وإضافة المسرع DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) في نسبة 1.5 إلى 2.0 في المائة الحجم الكلي للمخلوط. لاحظ أن الحل DPM-30 ينبغي قياس أدق الحيلولة دون أن يصبح داكن اللون وهش في الكتلة. جميع راتنج الكيماويات السامة؛ اتخاذ المزيد من الحيطة لمنع تماس الجلد أو الاستنشاق.
3. استخدام أنابيب 1.5 مل، تغسل شرائح العصب مع برنامج تلفزيوني وبدء عملية الجفاف عن طريق وضع شرائح العصب في الممرات المائية المختلفة الأسيتون/المقطر: 30%، 60%، 90%، تركيزات لمدة 10 دقائق، ثم في الأسيتون 100% 3 مرات لكل 10 دقائق.  ملاحظة يمكن استخدام الإيثانول أن مكان الأسيتون.
4. لتسلل الراتنج، ضع شرائح العصب في خليط جزء 1 من خليط الدمج النهائي والاسيتون 100% الجزء 1 لمدة 30 دقيقة، ثم في خليط من 2 أجزاء من خليط الدمج النهائي والاسيتون 100% الجزء 1 لمدة 30 دقيقة ، وأخيراً مكان قطع العصب في النهائي التضمين الخليط لمدة 30 دقيقة.
5. وضع شرائح العصب في تضمين قوالب مطاط السيليكون (استخدمت طول 106 مم × 71 مم عرض × 7 مم عمق؛ كتلة الحجم 11 مم طول × 6 مم عرض × 3 مم). إضافة الراتنج على رأس الأعصاب، مع التأكد من تغطية قطاعات العصب كلها وتجنب الوقوع في فقاعات الهواء بلطف. اترك القالب الذي يحتوي على شرائح العصب مع الراتنج بلمرة عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

3-تقطيع قبل أولتراميكروتومي

1. إعداد سكاكين الزجاج باستخدام صانع سكين زجاج (الشكل 1B) وجعل السكاكين الزجاج مع قوارب (الشكل 1)، التي تستخدم لتجميع المقاطع العصب تطفو على الماء المقطر.
2. وضع كتل الأعصاب راتنج المضمنة في حامل أولتراميكروتومي مع الجانب المنحرف مواجها لأعلى. باستخدام نطاق أولتراميكروتومي، تقليم أي راتنج الزائدة المحيطة بالانسجة العصبية، وكتلة تواجه شكل شبه منحرف وأقرب سطح طولية للعصب ممكن استخدام شفرة مفرد ذو حدين، مثل شفرة حلاقة. عدم اختراق السطح طولية من الجزء العصبية، ومعترف بها في تلطيخ الظلام بأكسيد الازميوم.
   ملاحظة: سوف يقلل تشذيب راتنج الزائدة مجال الراتنج يكون مقطوع وتحسين أداء بليد وقطع في الخطوات اللاحقة.
3. باستخدام في أولتراميكروتومي، جعل متعددة المقاطع العرضية يكفي لتعريض سطح مقطع عرضي موحد من الأنسجة العصبية باستخدام سكين زجاج عادي. بمجرد القيام بذلك، قم بالتبديل إلى سكين زجاج الذي قارب مليء بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة وضبط أولتراميكروتومي إلى 1-2 ميكرومتر قطع مقاطع رقيقة.
4. نقل المقاطع رقيقة عائمة من القارب سكين الزجاج إلى قطره ماء منزوع على شريحة الزجاج باستخدام حلقة معدنية (الشكل 1). الجاف للشرائح التي تحتوي على مقاطع بتمرير عدة مرات على لهب لبضع ثوان، مع التأكد من عدم أسخن المقاطع. وصمة عار الأجزاء المجففة فورا مع تولويدين الأزرق أو تخزين في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام قبل التلوين.
   ملاحظة: الأقسام يمكن أيضا أن تجفف باستخدام لوحة أكثر دفئا عند 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يجعل عملية تجفيف بطيئة المقاطع السلس.

4-تولويدين الأزرق تلطيخ

1. إعداد الحل 1% من تولويدين الأزرق بتذويب ز 2 من بورات الصوديوم في 100 مل مياه، ثم أضف 1 ز تولويدين الأزرق ويحرك حتى يذوب. تصفية الحل باستخدام ورق الترشيح (المسامية الحجم: 11 ميكرومتر)، ويبقى الحل في زجاجة معتمة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. استخدام ماصة بلاستيكية أو بيبيتور الصغرى، إضافة قطره حل تولويدين الزرقاء على رأس فروع العصب ويغادر إلى 20-30 ثانية.
3. شطف جميع الحل تولويدين الأزرق الزائد بلطف غمس الشرائح في جرة المياه. وكرر 3-4 مرات حتى تكون المقاطع واضحة. الجاف للشرائح على الأقل 15 دقيقة في 60 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وثم تغطي الأجزاء مع ساترة استخدام التركيب العادية المتوسطة. دراسة الشرائح المحملة مباشرة أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
4. فحص تحت مجهر خفيفة. ينصح بعدسة غمر نفط X 100 لصور مفصلة المستخدمة لحساب نسب ز.

النتائج

راتنج مضمن الأعصاب الطرفية المقاطع ملطخة تولويدين الأزرق تسمح لبيانات نسيجية دقيقة كوانتيفيكيشنز. لمحة عامة عن الإجراء الذي يظهر في (الشكل 2). أقسام الأعصاب الوركي جزءا لا يتجزأ من الراتنج المتوسطة وملطخة بالصور أزرق تولويدين أظهرت واضح مع الدقة المثلى (<...

Discussion

امتحانات هياكل المورفولوجية لإصابة الأعصاب المحيطية والتجديد مواضيع متكررة من دراسة¹³. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات للحصول على صور ذات جودة عالية للبيانات النسيجي كوانتيفيكيشنز استخدام أنسجة العصب الوركي الفئران جزءا لا يتجزأ من كتل الراتنج والملون باللون الأزرق تول?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80