甲苯胺蓝染色树脂嵌段评价周围神经形态学

摘要

在这里, 我们提出了一个通过获取和染色1-2 µm 段与甲苯胺蓝可视化周围神经精细结构的协议

摘要

周围神经延伸整个身体, 支配靶组织与马达或感觉轴突。由于广泛的分布, 周围神经经常因外伤或疾病而受损。由于对周围神经损伤的动物模型、功能和再生方法和策略进行了评估, 分析周围神经的形态计量已成为一个重要的终端结果测量。甲苯胺蓝染色神经横断面从树脂嵌入神经切片是一种重现性的方法, 定性和定量评估周围神经, 使可视化的形态学数字的轴突和程度髓鞘形成.这项技术, 和其他许多组织学方法一样, 很难用标准的书面协议来学习和掌握。因此, 本出版物的目的是强调书面协议, 以甲苯胺蓝染色的周围神经与录像的方法, 利用从大鼠的坐骨神经。在本协议中, 我们描述了在体外周神经固定和组织收集, 并后固定与2% 锇毒气, 嵌入神经在环氧树脂, ultramicrotome 切片的神经1-2μm 厚度。神经部分然后转移到玻璃滑动和染甲苯胺蓝色, 在之后他们定量地和定性地被评估。显示了最常见问题的例子, 以及缓解这些问题的步骤。

引言

周围神经延伸整个身体, 支配靶组织与马达或感觉轴突¹。由医疗失调和外伤引起的周围神经缺损是一个重大的公共卫生问题, 对^2、3的经济影响很大。尽管评估周围神经损伤的结果和了解神经再生的进展, 传统的方法, 如神经组织学和染色技术是定性和定量评估神经健康的基本工具作为最终的结果测量动物模型或切除人体组织。这通常与周围神经功能的电生理测量成配对, 在那里, 形态计量学可以揭示功能性神经再生的原因或没有发生。

甲苯胺蓝染色的树脂嵌入半薄外围神经切片是一种专门的方法, 以成像髓神经纤维, 提供高质量和清晰的详细图像的神经结构^4,5,6.甲苯胺蓝是一个耐热 metachromatic 染色, 发现的威廉亨利珀在 1856年⁷, 并已用于几个医疗应用⁸。甲苯胺蓝染色的周围神经部分获得的树脂嵌入神经段允许清晰的可视化神经结构。使用锇毒气后固定^4,9可增强髓鞘结构的可视化。锇毒气是一种有毒的氧化剂和脂质固定剂, 与脂质中的双键相互作用, 导致了明显的富含脂质的髓鞘¹⁰。然而, 锇毒气是有毒的, 昂贵的, 需要更长的神经段的孵化, 并不总是使用。

对周围神经形态学的可视化处理和染色方法进行了研究;石蜡, 低温切片, 环氧树脂嵌入神经切片后, 以甲苯胺蓝或苯二胺溶液染色, 用于定量测定周围神经再生^11,12 的形态学变化..这些方法各自有各自的优势和产生的关键数据的轴突, 髓鞘厚度, 轴突直径, 轴突直径髓纤维直径 (g 比) ^11,13,14,15.

该协议中的树脂嵌入的主要区别是它促进获得1-2 微米厚度剖面由于树脂的硬度, 同时保持神经的组织学质量。这些稀薄的部分, 相对于从石蜡嵌入获得的4-5 微米厚度部分, 提供了更高的分辨率的外围神经部分, 允许更准确的量化轴突髓鞘形成, 如 g 比, 这不能从较厚的部分¹⁶获得。虽然低温切片可用于获得1-2 µm 剖面, 但我们的经验是, 很难获得部分没有大量的大裂缝。这些破裂的部分可能导致不准确计数的轴突的数量和方面的髓鞘形成。

除了甲苯胺蓝染色¹⁷, 银染色法¹⁸和马尾松的三色染色⁴也可以用来显示神经轴突。然而, 使用树脂嵌入的大鼠中位神经切片染色的苏木精和三色或马尾的, 显示微弱的髓鞘和无法识别的结构, 而甲苯胺蓝染色显示明确的髓鞘图像, 容易能够量化⁴。尽管有一定的局限性, 甲苯胺蓝染色的树脂嵌入周围神经是一个宝贵的技术, 可用于当高分辨率图像的神经形态学需要。

树脂嵌入的主要缺点是它是费时的, 并且不允许同一个组织的染色由于抗原检索的困难与石蜡和被冻结的嵌入的部分技术相比。因此, 一般不可能利用相同的组织为染色, 通过树脂嵌入处理甲苯胺蓝染色。虽然在这里不使用, 如果在树脂嵌入部分需要免疫组化, 使用乙二醇甲基丙烯酸酯嵌入树脂允许免疫组化在组织切片, 但它是相对昂贵的¹⁹。这可以通过将周围神经分割成分开的部分来减轻, 有些用于植入树脂, 或者在固定后直接染色。

甲苯胺蓝染色的树脂嵌入周围神经的过程, 如大多数病理学分析, 可分为五个阶段, 包括固定, 脱水, 植入, 切片, 染色²⁰。本实验旨在为应用树脂嵌入甲苯胺蓝染色的大鼠坐骨神经切片提供一种实用的方案和实践指导, 以获得高质量的图像。

研究方案

本项目使用成人大大鼠, 所有程序均经怀俄明州大学动物保育和使用委员会批准。

1. 手术和体内神经固定

注: 本协议中使用的所有材料和设备的供应商信息列在材料表中。

注:体内神经固定用于保存组织并减少在死亡时间和神经收集之间可能发生的结构退化。在体内组织固定是一种标准的做法, 以制备神经系统组织的组织学, 其中灌注往往是这一前兆。周围神经的位置和大小允许原位固定。我们不建议在安乐死后, 由于组织退化的可能性, 收集和固定组织。

1. 准备大鼠全身麻醉, 将其放置在2-3% 异氟醚的感应腔内, 然后将麻醉大鼠置于解剖垫顶端的俯卧位, 并通过麻醉鼻锥维持1-2% 的异氟醚。为了确保足够深度的麻醉, 测试动物的踏板撤退的后腿, 并检查是否没有眼睑反射在眼睛通过触摸的眼睛内侧眼角。
   注: 腹腔注射氯胺酮是一种常用的替代吸入异氟醚。
2. 为了暴露坐骨神经, 剃掉后肢的毛发, 用70% 乙醇清洁剃须的区域。用手术刀或剪刀, 在皮肤沿后腿的2-3 厘米切口从膝到更大的粗隆, 在那里触诊股骨使用无菌手术刀, 以确保切口的正确位置。股骨位于坐骨神经最接近的部分。虽然这是一个非生存手术, 保持无菌技术。
3. 在做皮肤切口后, 定位在两头肌肌肉和臀阔肌肌肉之间的平面, 并使用显微切割剪刀分开的基础筋膜和暴露2-3 厘米的下划线坐骨神经。为了暴露坐骨神经的明显部分, 使用牵引器扩大两个肌肉之间的间隙 (图 1A)。用细镊子和虹膜剪刀, 小心地将神经从周围的结缔组织中分离出来, 注意不要压缩或切断神经。
4. 添加足够的王牌的固定剂 (4% 甲醛, 1% 戊二醛在 1x PBS (磷酸盐缓冲盐水) 与1.16 克 NaH2PO4 ·H2O 每100毫升) 进入含有暴露神经的腔内以遮盖神经, 让其坐10分钟。如有必要, 在后腿下放置纱布以改善角度, 使更多的固定剂可以加入腔内。10分钟后取出固定件, 再重复此步骤两次。
5. 使用解剖显微镜, 切断双方的神经使用细解剖剪刀, 确保不伸展或捏坐骨神经, 并立即把神经节在15毫升管包含王牌的固定在4°c 一个星期, 改变固定每48小时。
6. 在手术过程中, 不要把动物留在无人看管的地方。神经切除后, 弄死在麻醉下颈椎脱位。

2. 锇毒气处理和树脂嵌入

1. 后固定, 小心地清除任何剩余的脂肪和结缔组织从神经和使用锋利的手术刀把神经切成段约5毫米长度 (神经段可以分离和标记在不同的管)。准备新鲜的2% 锇毒气稀释在王牌的固定液, 并保持在玻璃管。将2% 锇毒气中的神经段浸入2小时, 这在短时间内可以在塑料管上。
   注: 一些塑料管与锇毒气反应, 导致溶液变暗, 因此不推荐在塑料管中长时间储存锇毒气。
2. 使用环氧树脂嵌入介质套件, 准备最后的嵌入公式:
   1. 将环氧树脂嵌入介质与 DDSA 溶液 (dodecenylsuccinic 酸酐; 混合物 A) 混合, 并将环氧树脂嵌入介质与 NMA 溶液 (methylnadic 酸酐; 混合物 B) 混合。让混合物 a 和 B 混合至少20分钟通过搅拌与磁性搅拌器。
   2. 在使用前, 混合混合物 A 和 B 并加入加速器 DPM-30 (24, 6-三 (dimethylaminomethyl) 苯酚) 的比例为1.5 到2.0% 的混合物的总体积。请注意, DPM-30 的解决方案应该精确地测量, 以防止块变暗的颜色和脆性。所有树脂化学物质都是有毒的;采取额外的照顾, 以防止皮肤接触或吸入。
3. 使用1.5 毫升管, 洗涤神经段与 PBS 和开始脱水过程通过安置神经段在不同的丙酮或蒸馏水段落: 30%, 60%, 90%, 浓度为10分钟每, 然后在100% 丙酮3次为10分钟每。 请注意, 乙醇可用于丙酮的地方。
4. 为树脂渗透, 安置神经片断在最后的嵌入的混合物的1个部分的混合物和1部分100% 丙酮为30分钟, 然后在最后的嵌入的混合物2个部分的混合物和1个部分100% 丙酮为30分钟, 最后将神经段放在最后的嵌入混合物中30分钟。
5. 将神经段放入硅橡胶嵌入模具 (我们使用了106毫米长 x 71 毫米宽度 x 7 毫米深度; 块尺寸 11 mm 长度 x 6 毫米宽度 x 3 毫米深度)。轻轻地将树脂放在神经的顶端, 确保覆盖整个神经段, 避免制造气泡。将含有神经段的模具留于树脂中, 聚合60摄氏度。

3. Ultramicrotome 切片

1. 用玻璃刀制造者 (图 1B) 制作玻璃刀, 用小船制造玻璃刀 (图 1C), 用来收集在蒸馏水上漂浮的神经部分。
2. 将树脂嵌入的神经块放置到 ultramicrotome 支架上, 梯形侧朝上。使用 ultramicrotome 的范围, 修剪任何多余的树脂周围的神经组织, 并使该块面对一个梯形形状和接近的纵向表面的神经尽可能使用单刃刀片, 如剃刀刀片。不要穿透神经段的纵面, 由锇毒气的深色染色可辨认。
   注: 多余树脂的修整将减少树脂的面积, 提高刀片的性能, 并在随后的步骤中进行切割。
3. 使用 ultramicrotome, 使多个横断面足以暴露一个统一的断面表面的神经组织使用普通的玻璃刀。一旦完成, 切换到一个玻璃刀, 其船在室温下充满蒸馏水, 并调整 ultramicrotome 到1-2 微米, 以削减薄部分。
4. 将浮动薄剖面从玻璃刀船转移到玻璃滑梯上的去离子水上, 使用金属环 (图 1D)。干燥的幻灯片包含部分, 通过多次在火焰上传递几秒钟, 确保不过热的部分。染色后, 立即用甲苯胺蓝染干切片或在室温下贮存几天。
   注意: 切片也可以用60摄氏度的热板干燥15分钟。缓慢的干燥过程使剖面平滑。

4. 甲苯胺蓝染色

1. 在100毫升去离子水中溶解2克硼酸钠, 然后加入1克甲苯胺蓝, 搅拌直至溶解, 制备甲苯胺蓝1% 溶液。用滤纸 (孔径:11 µm) 过滤溶液, 在室温下将溶液保持在不透明的瓶子中长达两周。
2. 使用塑料吸管或微 pipettor, 增加一滴甲苯胺蓝溶液的顶部的神经部分, 并离开 20-30 s。
3. 冲洗所有甲苯胺蓝溶液过剩通过轻轻地把幻灯片浸入去离子水罐子, 重复3-4 次, 直到部分是明确的。干燥幻灯片至少15分钟, 在60摄氏度或隔夜在室温下, 然后覆盖的部分与盖玻片使用定期安装介质。立即检查已安装的幻灯片或在室温下存储。
4. 在光显微镜下检查。对于用于计算 g 比值的详细图像, 建议使用100X 油浸出透镜。

结果

树脂嵌入周围神经部分染色甲苯胺蓝允许准确的组织学数据 quantifications。过程概述 (图 2)。在树脂培养基中嵌入的坐骨神经部分和甲苯胺蓝染色显示清晰的图像, 最佳分辨率 (图 3)。神经损伤可引起神经形态学结构的许多变化, 如神经纤维、轴突直径和髓鞘厚度的变化。该方法能保持神经结构的自然形态, 有利于测量轴突直径与总纤维直径...

讨论

对周围神经损伤和再生的形态学结构的检查是研究的¹³个经常科目。在本协议中, 我们描述了获取高品质图像的步骤, quantifications 利用大鼠坐骨神经组织嵌入树脂块和染色甲苯胺蓝的组织学数据。该技术提供了一种神经形态学的图像, 可以通过测量轴突数、髓鞘形成程度、浸润性纤维化组织的存在和健康神经来量化神经再生。虽然图像显示切片和处理未受伤的神经作为样本, 同样?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80