Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con toluidina

Abstract

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con gli assoni motori o sensoriali. Grazie alla distribuzione capillare, i nervi periferici sono spesso danneggiati a causa di trauma o della malattia. Come sono state sviluppate metodi e strategie per valutare la lesione periferica del nervo in modelli animali, funzione e rigenerazione, analizzando la morfometria del nervo periferico è diventata una misura essenziale risultato terminale. Sezioni di macchiatura del nervo trasversale blu di toluidina ottenute da sezioni del nervo resina incorporata è un metodo riproducibile per le valutazioni qualitative e quantitative dei nervi periferici, consentendo la visualizzazione del numero di morfologia degli assoni e grado di mielinizzazione. Questa tecnica, come con molti altri metodi istologici, può essere difficile da imparare e padroneggiare utilizzando protocolli standard scritte. L'intento di questa pubblicazione è pertanto per accentuare i protocolli scritti per la macchiatura dei nervi periferici con videografia del metodo, utilizzando i nervi sciatici raccolti dai ratti blu di toluidina. In questo protocollo, descriviamo in vivo fissazione del nervo periferico e raccolta del tessuto e la post-fissazione con 2% tetrossido di osmio, l'incorporamento dei nervi in resina epossidica e ultramicrotomo sezionamento dei nervi allo spessore di 1-2μm. Sezioni del nervo poi trasferito ad un vetrino e colorato con blu di toluidina, dopo che essi sono quantitativamente e qualitativamente valutati. Esempi dei problemi più comuni sono indicati, così come passaggi per attenuare questi problemi.

Introduzione

Nervi periferici si estendono in tutto il corpo, che innervano tessuti bersaglio con assoni sensoriali o motori¹. Nervo periferico difetti causati da patologie mediche e trauma rappresentano un problema importante di sanità pubblica e avere grande impatto economico^2,3. Nonostante i progressi nel valutare gli esiti delle lesioni del nervo periferico e comprensione di rigenerazione del nervo, metodi tradizionali come l'istologia del nervo e tecniche di colorazione sono strumenti essenziali per qualitativamente e quantitativamente valutare la salute del nervo come una misura di esito terminale in modelli animali o asportato tessuto umano. Questo è spesso accoppiato con misurazioni elettrofisiologiche della funzione di nervo periferico, dove morfometria può rivelare perché rigenerazione funzionale del nervo ha fatto o non si è verificato.

Blu di toluidina colorazione di sezioni semi-sottile nervo periferico resina incorporata è un metodo specializzato per l'imaging di fibre di nervo myelinated, fornendo l'alta qualità e immagini dettagliate di strutture nervose^4,,^{5,6 chiare} . Blu di toluidina è una macchia di leucodistrofia acidofile, scoperta da William Henry Perkin nel 1856⁷ed è stato utilizzato in diverse applicazioni mediche⁸. Sezioni blu-macchiato del nervo periferico di toluidina ottenute da segmenti di resina-incastonato del nervo consente una visualizzazione chiara delle strutture nervose. Visualizzazione della struttura della guaina di mielina può essere migliorata mediante l'uso di osmio tetrossido di post-fissazione^4,9. Tetrossido di osmio è un ossidante e del lipido fissativo agente tossico che interagisce con i legami doppi in lipidi, con conseguente crudamente definito foderi di myelin ricca di lipidi¹⁰. Tuttavia, tetrossido di osmio è tossico, costoso, richiede un'incubazione più lungo dei segmenti del nervo e non viene sempre utilizzato.

Metodi alternativi di lavorazione e colorazione sono stati sviluppati per la visualizzazione della morfologia del nervo periferico; Paraffina, sezionamento criogenico e resina epossidica resina-incastonato del nervo sezionamento seguita mediante colorazione con blu di toluidina o soluzione fenilendiamina è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti morfologici del nervo periferico rigenerazione ^11,12 . Questi metodi ogni hanno vantaggi e resa essenziale dati sul numero di assoni, mielina spessore, diametro dell'assone e diametro dell'assone a fibra myelinated diametro (g-ratio) ^11,13,14,15 .

La distinzione principale di resina-incorporare in questo protocollo è che facilita ottenere sezioni di spessore 1-2 μm a causa della durezza della resina pur mantenendo le qualità istologiche del nervo. Queste sezioni sottili, in contrasto con le sezioni di spessore di 4-5 μm ottenute da paraffina incorporamento, forniscono sezioni periferiche del nervo con risoluzione superiore, consentendo una più accurata quantificazione del myelination assone, come il rapporto di g, che non può essere ottenuti da più spesso sezioni¹⁶. Mentre criogenico di sezionamento può essere utilizzato per ottenere le sezioni 1-2 µm, è stato la nostra esperienza che è più difficile da ottenere sezioni senza numerose fessure di grandi dimensioni. Tali sezioni fessurate possono causare imprecisi conteggio del numero degli assoni e aspetti di mielinizzazione.

Oltre alla macchiatura¹⁷blu di toluidina, un argento che macchia il metodo¹⁸ e di colorazione tricromica di Masson⁴ utilizzabile anche per mostrare gli assoni del nervo. Tuttavia, utilizzando resina l'incorporamento delle sezioni del nervo mediano di ratto macchiato con ematossilina ed eosina o di Masson tricromica ha mostrati deboli foderi di myelin e strutture non riconosciuti, considerando che la macchiatura blu della toluidina ha mostrato la guaina mielinica chiara immagine e può facilmente essere quantificati⁴. Nonostante alcune limitazioni, i nervi che macchia di resina incorporata periferico blu di toluidina è una tecnica importante che può essere utilizzata quando sono necessarie immagini ad alta risoluzione della morfologia del nervo.

Lo svantaggio principale per l'incorporamento di resina è che richiede tempo e non consente di immunostaining del tessuto stesso a causa della difficoltà di ricupero dell'antigene rispetto alla paraffina e tecniche di sezioni congelate incorporato. Così, non è generalmente possibile utilizzare lo stesso tessuto per immunostaining che viene elaborato tramite l'incorporamento di resina per la macchiatura blu della toluidina. Anche se non usato qui, se non si desidera immunohistochemistry in resina sezioni embedded, l'utilizzo di incorporamento resine di metacrilato di glicole consente immunohistochemistry essere eseguita su sezioni di tessuto, ma è relativamente costoso¹⁹. Questo può essere un po' mitigato tagliando il nervo periferico in segmenti separati, alcuni per l'incorporamento di resina ed altri per l'immunocolorazione direttamente dopo la fissazione.

Il processo di macchiatura blu della toluidina di resina incorporati i nervi periferici, come con l'analisi istopatologica più, può essere suddiviso in cinque fasi, tra cui la fissazione, la disidratazione, l'incorporamento, sezionamento e macchiatura²⁰. Qui ci proponiamo di fornire un protocollo e una guida pratica per l'utilizzo di resina incorporati ratto nervo sciatico sezioni macchiate con immagini di alta qualità per acquisire blu di toluidina.

Protocollo

Questo progetto sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley adulti e tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali di Università del Wyoming.

1. chirurgia e nel Vivo del nervo fissazione

Nota: Informazioni sul fornitore per tutti i materiali e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella materiali.

Nota: In vivo la fissazione del nervo viene utilizzata per conservare i tessuti e ridurre il degrado strutturale che può verificarsi tra il momento della morte e raccolta dei nervi. Fissazione del tessuto in vivo è una pratica standard per la preparazione del tessuto del sistema nervoso per l'istologia, dove la perfusione è spesso un precursore di questo. Il posizionamento e le dimensioni dei nervi periferici ha permesso per la fissazione in situ. Si sconsiglia di accumulazione e fissazione del tessuto dopo l'eutanasia a causa della possibilità di degradazione del tessuto.

1. Preparare il ratto per anestesia generale collocandolo in una camera di induzione con 2-3% isoflurane, poi posizionare il ratto anestetizzato in posizione prona sulla cima di una stuoia di dissezione e mantenere a 1-2% di isoflurane via anestetica cono di naso. Per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia, test animali per pedale ritiro alle zampe posteriori e verificare l'assenza di riflessi palpebrali agli occhi toccando il canthus mediale dell'occhio.
   Nota: L'iniezione intraperitoneale di ketamina è un'alternativa comunemente usata per via inalatoria isoflurano.
2. Per esporre il nervo sciatico, radersi i capelli dell'hind limb(s) e pulire le zone rasate con etanolo al 70%. Con un bisturi o forbici, praticare un'incisione di 2-3 cm in pelle lungo l'arto dal ginocchio fino al grande trocantere, dove palpazione del femore utilizzando il bisturi sterile per accertare la corretta posizione dell'incisione. Il femore si trova appena prossimale rispetto al segmento più accessibile del nervo sciatico. Anche se si tratta di un intervento chirurgico non-sopravvivenza, mantenere tecniche sterili.
3. Dopo aver effettuato l'incisione cutanea, individuare l'aereo tra il muscolo bicipite femorale e del muscolo di maximus del gluteus e usando le forbici microdissection separare la fascia sottostante ed esporre 2-3 cm del nervo sciatico sottolineatura. Per esporre una sezione trasparente del nervo sciatico, è necessario utilizzare un riavvolgitore per ampliare il divario tra i due muscoli (Figura 1A). Con una pinzetta e forbici iris, separare con cura il nervo dal tessuto connettivo, ponendo la massima cura di non comprimere o tagliare il nervo circostante.
4. Aggiungere fissativo sufficiente Trump (4% formaldeide, glutaraldeide al 1% in PBS 1X (tamponato fosfato salino) con 1,16 g di NaH2PO4· H2O / 100 mL) nella cavità contenente il nervo per coprire il nervo e lasciate riposare per 10 min. Se necessario, garza posto sotto la cerva gamba per migliorare l'angolo in modo che altro fissativo può essere aggiunto nella cavità. Rimuovere il fissativo dopo 10 min e ripetere questo passaggio altre due volte.
5. Usando un microscopio per dissezione, tagliare il nervo da entrambi i lati utilizzando forbici dissezione bene, facendo attenzione a non allungare o pizzicare il nervo sciatico e subito messo le sezioni del nervo in provette da 15 mL contenenti fissativo di briscola a 4 ° C per una settimana, cambiando il fissativo ogni 48 h.
6. Non lasciare gli animali incustoditi durante qualsiasi parte della procedura chirurgica. Dopo la rimozione del nervo, eutanasia animali di dislocazione cervicale mentre sotto anestesia.

2. trattamento tetrossido di osmio e l'incorporamento di resina

1. Post di fissazione, attentamente rimuovere qualsiasi residuo grasso e tessuti connettivi dal nervo e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il nervo in segmenti di circa 5 mm di lunghezza (nervo segmenti possono essere separati e identificati in diversi tubi). Preparare fresco tetrossido di osmio 2% diluito in soluzione fissante di Trump e tenere in un tubo di vetro. Immergere i segmenti del nervo in tetrossido di osmio 2% per 2 h, che può essere in tubi di plastica per questo breve periodo di tempo.
   Nota: Alcuni tubi di plastica reagiscono con tetrossido di osmio, causando un oscuramento della soluzione, in modo prolungato stoccaggio di tetrossido di osmio in tubi di plastica non è raccomandato.
2. Utilizzando una resina epossidica embedding kit medium, preparare la formula finale di incorporamento:
   1. Mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione DDSA (anidride dodecenylsuccinic; miscela A) e mescolare la resina epossidica mezzo di inclusione con soluzione NMA (anidride methylnadic; miscela B). Lasciare entrambe le miscele A e B mescolare per almeno 20 minuti agitando con un agitatore magnetico.
   2. Immediatamente prima dell'uso mescolare la miscela A e B e aggiungere l'acceleratore DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) nella proporzione di 1.5-2.0% del volume totale della miscela. Si noti che la soluzione DPM-30 dovrebbe essere misurata proprio per evitare il blocco da diventando di colore scuro e fragili. Tutti i prodotti chimici resina sono tossici; prestare particolare attenzione per evitare il contatto con la pelle o per inalazione.
3. Utilizzando provette da 1,5 mL, lavare segmenti del nervo con PBS e iniziare il processo di disidratazione collocando i segmenti del nervo in acetone/distillata diversi passaggi dell'acqua: 30%, 60%, 90%, concentrazioni per 10 minuti ciascuno, quindi in 100% di acetone 3 volte per 10 minuti ciascuno.  Si noti che l'etanolo può essere utilizzato al posto di acetone.
4. Per l'infiltrazione di resina, posizionare i segmenti del nervo in una miscela di 1 parte della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min, poi in una miscela di 2 parti della miscela finale di incorporamento e 1 parte 100% acetone per 30 min , e infine posto il nervo segmenti in finale l'incorporamento di miscela per 30 min.
5. Mettere i segmenti del nervo in incorporamento stampi in gomma siliconica (ci hanno usato Lunghezza 106 mm x 71 mm di larghezza x profondità mm 7; bloccare Dimensione Lunghezza 11 mm x 6 mm di larghezza x 3 mm di profondità). Aggiungere delicatamente la resina sopra i nervi, facendo attenzione a coprire i segmenti di intero nervo evitando bolle d'aria. Lasciare lo stampo contenente segmenti di nervo con la resina per polimerizzare a 60 ° C durante la notte.

3. sezionamento di ultramicrotomo

1. Preparare la lama di vetro usando un coltellinaio di vetro (Figura 1B) e fare vetro coltelli con barche (Figura 1), che vengono utilizzati per raccogliere le sezioni del nervo che galleggia sull'acqua distillata.
2. Posizionare blocchi nervosi resina incorporato nel supporto ultramicrotomo con il trapezio lato rivolto verso l'alto. Utilizzando l'ambito di ultramicrotomo, tagliare qualsiasi eccesso di resina che circonda il tessuto nervoso e rendere il blocco di affrontare una forma trapezoidale e come vicino alla superficie longitudinale del nervo possibile usando una lama di taglio singolo, come una lama di rasoio. Non penetrano la superficie longitudinale del segmento del nervo, che è riconoscibile per la sua colorazione scura di tetrossido di osmio.
   Nota: Rimozione della resina in eccesso riduce l'area della resina essere sezionato e migliorare le prestazioni di lama e taglio nei passaggi successivi.
3. Utilizzando l'ultramicrotomo, rendere più sezioni trasversali sufficiente esporre una superficie di sezione trasversale uniforme del tessuto del nervo usando un coltello di vetro normale. Una volta fatto questo, passare a un coltello di vetro cui barca è riempito con acqua distillata a temperatura ambiente e regolare l'ultramicrotomo a 1-2 μm per tagliare sezioni sottili.
4. Trasferimento sezioni sottili galleggiante dalla barca di coltello di vetro a una goccia d'acqua deionizzata su vetrino con anello in metallo (Figura 1). A secco diapositive contenente sezioni passando più volte sopra una fiamma per pochi secondi, facendo attenzione a non surriscaldare le sezioni. Macchia secche sezioni immediatamente con toluidina blu o conservare a temperatura ambiente per diversi giorni prima della colorazione.
   Nota: Sezioni possono essere asciugati anche utilizzando una piastra scalda a 60 ° C per 15 min. Un lento processo di essiccazione rende liscia le sezioni.

4. blu di toluidina colorazione

1. Preparare la soluzione di 1% di blu di toluidina sciogliendo 2 g di borato di sodio in 100 mL di acqua deionizzata, quindi aggiungere 1 g di blu di toluidina e mescolare fino a scioglimento. Filtrare la soluzione utilizzando carta da filtro (dimensione dei pori: 11 µm) e mantenere la soluzione in un flacone opaco a temperatura ambiente fino a due settimane.
2. Utilizzando una pipetta di plastica o micro pipetta, aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina nella parte superiore le sezioni del nervo e lasciare per 20-30 s.
3. Lavare via tutte le soluzione di blu di toluidina in eccesso delicatamente immergendo i vetrini in acqua deionizzata vaschetta e ripetere 3 - 4 volte fino a quando le sezioni sono chiare. Asciugare i vetrini almeno 15 min a 60 ° C o una notte a temperatura ambiente e poi coprire le sezioni con un vetrino coprioggetto utilizzando il mezzo di montaggio regolare. Esaminare le diapositive montate immediatamente o conservare a temperatura ambiente.
4. Esaminare sotto un microscopio chiaro. Un obiettivo ad immersione X 100 è consigliato per immagini dettagliate utilizzate per calcolare i rapporti di g.

Risultati

Resina incorporati nervo periferico sezioni colorate con toluidina blu consentono quantificazioni di accurati dati istologici. Una panoramica della procedura è illustrata nella (Figura 2). Nervo sciatico sezioni incorporato nel terreno di resina e colorato con blu di toluidina ha mostrato chiare immagini con risoluzione ottimale (figure 3). Danno del nervo può causare molti cambiamenti nel nervo strutture morfologiche, ad esempio, cambiamen...

Discussione

Gli esami delle strutture morfologiche della lesione del nervo periferico e la rigenerazione sono soggetti frequenti di Studio¹³. In questo protocollo, descriviamo la procedura per ottenere immagini di alta qualità per quantificazioni di dati istologici utilizzando tessuto di nervo sciatico del ratto incorporato in blocchi in resina e colorato con blu di toluidina. Questa tecnica fornisce un'immagine della morfologia del nervo in cui la rigenerazione del nervo può essere quantificata misurando i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80