Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para visualizar belas estruturas de nervos periféricos obtendo e seções de 1-2 µm com toluidina a coloração azul

Resumo

Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios motor ou sensoriais. Devido à ampla distribuição, nervos periféricos são frequentemente danificados devido a trauma ou doença. Como métodos e estratégias foram desenvolvidas para avaliar lesão de nervo periférico em modelos animais, função e regeneração, analisando a morfometria do nervo periférico tornou-se uma medida de resultado terminal essencial. Seções de toluidina azul coloração do nervo Cruz obtidas de seções de nervo resina incorporada é um método reprodutível para avaliações qualitativas e quantitativas dos nervos periféricos, permitindo a visualização do número de morfologia de axônios e grau de mielinização. Esta técnica, tal como acontece com muitos outros métodos histológicos, pode ser difícil de aprender e dominar usando protocolos padrão de escrita. A intenção desta publicação é, portanto acentuar a protocolos escritos para toluidina azul coloração de nervos periféricos com Videografia do método, usando os nervos ciático de ratos colhidos. Neste protocolo, descrevemos na vivo fixação de nervo periférico e coleta do tecido e pós-fixação com 2% de tetróxido de ósmio, incorporação de nervos em resina epóxi e ultramicrotome de seccionamento dos nervos a espessura de 1-2μm. Seções do nervo, em seguida, transferido para uma lâmina de vidro e corados com azul de toluidina, após o qual são quantitativamente e qualitativamente avaliados. São mostrados exemplos dos problemas mais comuns, bem como medidas para atenuar esses problemas.

Introdução

Nervos periféricos se estendem por todo o corpo, que inervam tecidos-alvo com axônios sensoriais ou motor¹. Nervo periférico defeitos causados por doenças e trauma representam uma preocupação de saúde pública e tem grandes impactos econômicos^2,3. Apesar dos progressos em avaliar os resultados de lesões nervosas periféricas e entendendo a regeneração do nervo, métodos tradicionais como nervo histologia e técnicas de coloração são ferramentas essenciais para qualitativa e quantitativamente avaliar saúde do nervo como uma medida de resultado terminal em modelos animais ou tecidos humanos extirpado. Isto frequentemente é emparelhado com medições eletrofisiológicas da função do nervo periférico, onde a morfometria pode revelar por regeneração nervosa funcional fez ou não ocorreu.

Azul de toluidina a coloração das seções de nervo periférico semi fina de resina incorporada é um método especializado para as fibras nervosas mielinizadas, proporcionando alta qualidade de imagem e claro imagens detalhadas de nervo estruturas^4,5,6 . Azul de toluidina é uma mancha metachromatic acidófilo, descoberta por William Henry Perkin em 1856,⁷e tem sido utilizada em várias aplicações médicas⁸. Seções de nervo periférico manchadas de azul de toluidina obtidas de segmentos nervosos resina-incorporado permite a clara visualização das estruturas nervosas. Visualização da bainha de mielina estrutura pode ser reforçada pelo uso de tetróxido de ósmio pós-fixação^4,9. Tetróxido de ósmio é um oxidante e lipídios fixador agente tóxico que interage com as ligações duplas em lipídios, resultando em bainhas de mielina rica em lipídios starkly definidos¹⁰. No entanto, tetróxido de ósmio é tóxico, caro, exige uma maior incubação de segmentos nervosos e não é sempre usado.

Métodos alternativos de processamento e coloração foram desenvolvidos para visualização da morfologia do nervo periférico; Parafina, criogênico de corte e seccionamento de nervo incorporado de resina epóxi seguiram de coloração com azul de toluidina ou fenilenodiamina solução tem sido usada para quantificar as alterações morfológicas da regeneração de nervo periférico ^11,12 . Esses métodos têm suas vantagens e rendimento dados essenciais sobre o número de axônios, espessura da mielina, diâmetro do axônio e diâmetro do axônio para fibras mielinizadas diâmetro (g-ratio) ^11,13,14,15 .

A principal distinção de resina-incorporação neste protocolo é que facilita a obtenção de secções de espessura 1-2 μm devido a dureza da resina, mantendo as qualidades histológicas do nervo. Estas seções finas, em oposição as 4-5 μm seções de espessura obtidas de parafina de incorporação, fornecem seções de nervo periférico com maior resolução, permitindo uma quantificação mais precisa de mielinização axônio, tais como o g-relação, que não pode ser Obtido a partir de secções mais espessas¹⁶. Enquanto criogênico de corte pode ser usado para obter seções de 1-2 µm, tem sido nossa experiência que é mais difícil obter seções sem numerosas fissuras grandes. Tais seções rachadas podem causar impreciso contagem do número de axônios e aspectos da mielinização.

Além do azul de toluidina coloração¹⁷, uma prata coloração método¹⁸ e de coloração tricromo de Masson⁴ também pode ser usada para mostrar os axônios do nervo. No entanto, usar resina incorporação das seções do nervo mediano de rato corados com hematoxilina e eosina ou de Masson tricromo mostrou fracas bainhas de mielina e estruturas não reconhecidas, Considerando que a coloração azul de toluidina mostrou imagem clara da bainha de mielina e pode facilmente ser quantificados⁴. Apesar de algumas limitações, nervos de toluidina azul coloração de resina incorporada periférica é uma valiosa técnica que pode ser usada quando as imagens de alta resolução da morfologia do nervo são necessárias.

A principal desvantagem para a incorporação de resina é que é demorado e não permite a imunocoloração do mesmo tecido devido à dificuldade de recuperação do antígeno quando comparado com parafina e congelados incorporado seções técnicas. Assim, não é geralmente possível utilizar o mesmo tecido para immunostaining é processado através de incorporação de resina para coloração de azul de toluidina. Embora não usado aqui, se é desejado a imuno-histoquímica em resina seções incorporadas, a utilização de resinas de incorporação de metacrilato de glicol permite imuno-histoquímica ser executada em cortes de tecido, mas é relativamente caro¹⁹. Isto pode ser um pouco atenuado pelo corte do nervo periférico em segmentos separados, alguns para a incorporação de resina e outros por imunocoloração diretamente após a fixação.

O processo de coloração de azul de toluidina de resina incorporado os nervos periféricos, como com análise histopatológica mais, pode ser dividido em cinco etapas, incluindo fixação, desidratação, incorporação, corte e coloração²⁰. Pretendemos fornecer um protocolo e orientação prática para usar resina seções do nervo ciático de rato incorporado com imagens de alta qualidade de toluidina azul para adquirir.

Protocolo

Utilizaram-se ratos Sprague Dawley adulto neste projeto e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade de Wyoming.

1. cirurgia e na fixação de nervo Vivo

Nota: Informações do fornecedor para todos os materiais e equipamentos utilizados no presente protocolo são listados na Tabela de materiais.

Nota: Fixação do nervo na vivo é usada para preservar o tecido e reduzir a degradação estrutural que pode ocorrer entre o momento da morte e a coleção dos nervos. Fixação de tecidos in vivo é uma prática padrão para a preparação do tecido do sistema nervoso para histologia, onde a perfusão geralmente é um precursor para isto. A colocação e o tamanho dos nervos periféricos permitido para fixação in situ. Não recomendamos coleção e fixação do tecido após a eutanásia devido à possibilidade de degradação de tecidos.

1. Preparar o rato para anestesia geral, colocando-o em uma câmara de indução com 2-3% de isoflurano, em seguida, coloque o rato anestesiado de bruços em cima de uma esteira de dissecação e mantenha 1-2% de isoflurano através do cone de nariz anestésica. Para garantir a adequada profundidade da anestesia, teste de animais para a retirada de pedal para as patas e verificar a ausência de reflexos palpebrais os olhos tocando o canto medial do olho.
   Nota: Injeção Intraperitoneal de cetamina é uma alternativa comumente usada para isoflurano inalado.
2. Para expor o nervo ciático, raspar o cabelo da hind limb(s) e limpar as áreas depiladas com etanol a 70%. Com um bisturi ou tesoura, faça uma incisão de 2-3 cm na pele ao longo do membro posterior do joelho até o trocanter maior, onde a palpação do fêmur com o bisturi estéril para assegurar a localização adequada da incisão. O fêmur situa-se imediatamente proximal ao segmento mais acessível do nervo ciático. Mesmo que esta é uma cirurgia não-sobrevivência, manter técnicas estéreis.
3. Depois de fazer a incisão da pele, localizar o avião entre os músculos bíceps femoral e o músculo glúteo máximo e usando uma tesoura microdissection separados da fáscia subjacente e expor 2-3cm do nervo ciático de sublinhado. Para expor uma clara secção do nervo ciático, use um afastador para alargar o fosso entre os dois músculos (figura 1A). Com pinça fina e tesoura de íris, separe com cuidado o nervo do tecido conjuntivo, tomando muito cuidado para não comprimir ou cortado o nervo circundante.
4. Adicione o fixador do Trump suficientes (formol 4%, 1% de glutaraldeído em 1X PBS (solução salina tamponada fosfato) com 1,16 g de NaH2PO4· H2O, por 100 mL) na cavidade que contém o nervo exposto, para cobrir a lata e deixe descansar por 10 min. Se necessário, lugar de gaze sob o hind perna melhorar o ângulo para que mais fixador pode ser adicionado na cavidade. Retire o fixador após 10 min e repita mais duas vezes.
5. Usando um microscópio de dissecação, cortou o nervo de ambos os lados com uma tesoura bem dissecação, certificando-se não esticar ou beliscar o nervo ciático e imediatamente colocar as seções de nervo em tubos de 15 mL contendo fixador do Trump a 4 ° C, durante uma semana, alterando o fixador a cada 48 h.
6. Não abandone animais durante qualquer parte do procedimento cirúrgico. Após a remoção do nervo, eutanásia em animais por deslocamento cervical sob anestesia.

2. tratamento tetróxido de ósmio e a incorporação de resina

1. Fixação de postar, cuidadosamente remover qualquer gordura restante e tecidos conjuntivos do nervo e usar um bisturi afiado para cortar o nervo em segmentos de aproximadamente 5 mm de comprimento (nervo segmentos podem ser separados e etiquetados em tubos de diferentes). Tetróxido de ósmio fresco 2% diluído em solução fixador do Trump de preparar e manter em um tubo de vidro. Mergulhe os segmentos nervosos em tetróxido de ósmio de 2% por 2 h, que pode ser em tubos de plástico para este curto período de tempo.
   Nota: Alguns tubos de plástico reagem com tetróxido de ósmio, causando um escurecimento da solução, por armazenamento prolongado de tetróxido de ósmio em tubos de plástico não é recomendado.
2. Usando um kit de médio a incorporação de epóxi, prepare a fórmula final de incorporação:
   1. Misture a cola epoxy incorporação médio com solução DDSA (anidrido dodecenylsuccinic; mistura A) e misture o epóxi incorporação médio com solução NMA (anidrido methylnadic; mistura B). Deixe ambas as misturas A e B misturam pelo menos 20 min por agitação com um agitador magnético.
   2. Imediatamente antes do uso, misture a mistura A e B e adicione o acelerador do DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) na proporção de 1,5 a 2,0% do volume total da mistura. Observe que a solução do DPM-30 deve ser medida precisamente para impedir que o bloco se tornando escuro na cor e quebradiços. Todos os produtos químicos de resina são tóxicos; Tome cuidado extra para evitar o contacto com a pele ou por inalação.
3. Usando tubos de 1,5 mL, lavar segmentos nervosos com PBS e iniciar o processo de desidratação, colocando os segmentos nervosos em acetona/destilada diferentes passagens de água: 30%, 60%, 90%, as concentrações de 10 min cada e, em seguida, em 100% de acetona por 10 min cada por 3 vezes.  Observe que o etanol pode ser usado no lugar da acetona.
4. Para a infiltração de resina, coloque os segmentos nervosos em uma mistura de 1 parte de mistura de incorporação final e 1 parte 100% acetona por 30 min, em seguida, em uma mistura de 2 partes de mistura de incorporação final e 1 parte 100% acetona por 30 min , e finalmente o lugar do nervo segmentos na final incorporação mistura por 30 min.
5. Colocar os segmentos nervosos em borracha de silicone, moldes de incorporação (tenho usado o comprimento de 106 mm x 71 mm de largura x 7 mm de profundidade; bloquear tamanho 11 mm de comprimento x 6 mm de largura x 3 mm de profundidade). Adicione delicadamente a resina em cima dos nervos, certificando-se de cobrir os segmentos todo nervo e evitar bolhas de ar. Deixe o molde contendo segmentos nervosos com a resina para polimerizar a 60 ° C durante a noite.

3. corte por Ultramicrotome

1. Facas de vidro usando uma máquina de faca de vidro (figura 1B) de preparar e fazer facas de vidro com barcos (Figura 1), que são usados para recolher seções de nervo que flutua na água destilada.
2. Resina de lugar incorporado bloqueios no porta-ultramicrotome com a trapezoidal virados para cima. Usando o escopo de ultramicrotome, apare qualquer excesso de resina ao redor do tecido nervoso e fazer com que o bloco de enfrentar uma forma trapezoidal e quanto perto da superfície longitudinal do nervo possível usando uma único-lamina, como uma lâmina de barbear. Não penetram a superfície longitudinal do segmento do nervo, que é reconhecido por sua coloração escura por tetróxido de ósmio.
   Nota: Remoção de excesso de resina irá reduzir a área de resina para ser seccionado e melhorar o desempenho da lâmina e corte em etapas subsequentes.
3. Usando o ultramicrotome, fazer várias seções de cruz suficientes para expor uma superfície uniforme de seção transversal do tecido nervoso usando uma faca de vidro liso. Depois disso, alterne para uma faca de vidro cujo barco é preenchido com água destilada à temperatura ambiente e ajustar o ultramicrotome para 1-2 μm para cortar seções finas.
4. Transferi flutuantes seções finas do barco de faca de vidro para uma gota de água deionizada na lâmina de vidro usando metal loop (Figura 1). Secar slides contendo seções passando várias vezes sobre uma chama por alguns segundos, certificando-se de não superaquecer as seções. Mancha secadas seções imediatamente com toluidina azul ou armazenar à temperatura ambiente durante vários dias antes da coloração.
   Nota: As seções podem também ser secadas usando um prato quente a 60 ° C por 15 min. Um processo de secagem lento faz com que as seções suave.

4. azul de toluidina coloração

1. Preparar a solução de azul de toluidina 1% pela dissolução de 2 g de borato de sódio em 100 mL de água desionizada, em seguida, adicionar 1 g de azul de toluidina e mexa até dissolver. Filtrar a solução usando papel de filtro (reduz o tamanho dos poros: 11 µm) e manter a solução em um frasco opaco em temperatura ambiente por até duas semanas.
2. Utilizando uma pipeta plástica ou micro pipeta, adicione uma gota de solução de azul de toluidina no topo as seções de nervo e deixar por 20-30 s.
3. Enxaguar com solução de azul de toluidina todo excesso mergulhando suavemente as lâminas em frasco de água desionizada e repita 3 - 4 vezes até seções são claras. Seque o slides pelo menos 15 min a 60 ° C, ou durante a noite à temperatura ambiente e em seguida, cubra as seções com uma lamela utilizando o meio de montagem regular. Examinar os slides montados imediatamente ou armazenar à temperatura ambiente.
4. Examine sob um microscópio de luz. Uma lente de imersão de óleo X 100 é recomendado para imagens detalhadas, usadas para calcular índices de g.

Resultados

Resina incorporado seções manchadas de toluidina azuis permitem quantificações dados histológicos precisos de nervo periférico. Uma visão geral do processo é mostrada na (Figura 2). Seções de nervos ciático incorporado no meio de resina e corados com azul de toluidina mostrou clara imagens com resolução ideal (figuras 3). Dano do nervo pode causar muitas alterações no nervo estruturas morfológicas, por exemplo, mudanças nas f...

Discussão

Exames das estruturas morfológicas da lesão de nervo periférico e regeneração são temas frequentes de estudo¹³. Este protocolo, descreveremos os passos para obter imagens de alta qualidade para quantificações dados histológicos utilizando tecido de nervo ciático rato incorporado em blocos de resina e corados com azul de toluidina. Esta técnica fornece uma imagem da morfologia do nervo em que a regeneração do nervo pode ser quantificada através da medição do número de axônios, gra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80