Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Résumé

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les structures fines des nerfs périphériques en obtenant et en coloration de 1 à 2 µm sections avec toluidine bleu

Résumé

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec les axones moteurs ou sensoriels. En raison de la généralisation, les nerfs périphériques sont souvent endommagés en raison d’un traumatisme ou d’une maladie. Méthodes et stratégies ont été développées pour évaluer les lésions des nerfs périphériques dans des modèles animaux, fonction et régénération, analysant la morphométrie des nerfs périphériques est devenue une mesure essentielle issue terminale. Points de coloration du nerf croix bleu de toluidine obtenues des sections nerveuses résine intégrée est une méthode reproductible pour les évaluations qualitatives et quantitatives des nerfs périphériques, permettant la visualisation de morphologie nombre d’axones et le degré de myélinisation. Cette technique, comme pour beaucoup d’autres méthodes histologiques, peut être difficile à apprendre et à maîtriser à l’aide de protocoles standard de l’écrits. Cette publication vise donc à accentuer des protocoles écrits pour la coloration des nerfs périphériques à la vidéographie de la méthode, à l’aide de nerfs sciatiques récoltés des rats bleu de toluidine. Dans ce protocole, nous décrivons la fixation in vivo des nerfs périphériques et collection du tissu et après fixation avec 2 % le tétroxyde d’osmium, incorporant des nerfs dans la résine époxyde et ultramicrotome sectionnement des nerfs à 2μm-1 épaisseur. Les sections nerveuses puis transféré à une lame de verre et colorées au bleu de toluidine, après quoi ils sont quantitativement et qualitativement évalués. Exemples de problèmes les plus courants sont indiqués, ainsi que des mesures pour atténuer ces problèmes.

Introduction

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec des axones moteurs ou sensoriels¹. Nerfs périphériques congénitales causées par des troubles médicaux et les traumatismes représentent un problème majeur de santé publique et ont de grandes incidences économiques^2,3. Malgré les progrès dans l’évaluation des résultats des lésions des nerfs périphériques et comprendre la régénération nerveuse, les méthodes traditionnelles comme l’histologie nerveuse et des techniques de coloration sont des outils indispensables pour évaluer qualitativement et quantitativement la santé nerveuse comme une mesure de résultat terminal dans des modèles animaux ou des tissus humains excisés. Ceci est souvent associé à des mesures électrophysiologiques de la fonction de nerf périphérique, où la morphométrie peut révéler pourquoi la régénération nerveuse fonctionnelle n’a ou n’a pas eu lieu.

Le bleu de toluidine souillant des sections de nerfs périphériques semi mince résine intégrée est une méthode spécialisée pour l’imagerie des fibres nerveuses myélinisées, de haute qualité et effacer des images détaillées de nerf structures^4,5,6 . Le bleu de toluidine est un colorant métachromatique acidophile, découvert par Perkin, en 1856,⁷et a été utilisé dans plusieurs applications médicales⁸. Sections de nerfs périphériques teinté bleu de toluidine provenant de segments de nerfs enrobées dans la résine permet une visualisation claire des structures nerveuses. Visualisation de la structure de la gaine de myéline peut être améliorée par l’utilisation de tétroxyde d’osmium après fixation^4,9. Le tétroxyde d’osmium est un oxydant et lipides fixateur agent toxique qui interagit avec des doubles liaisons dans les lipides, résultant dans la gaine de myéline des riches en lipides nettement défini¹⁰. Toutefois, le tétroxyde d’osmium est toxique et cher, nécessite une période d’incubation plus longue des segments du nerf et n’est pas toujours utilisée.

Méthodes alternatives de traitement et de coloration ont été développés pour la visualisation de la morphologie du nerf périphérique ; Paraffine, sectionnement cryogéniques et sectionnement de nerfs enrobées dans la résine époxy suivie par coloration au bleu de toluidine ou phénylènediamine solution a été utilisée pour quantifier les changements morphologiques des nerfs périphériques régénération ^11,12 . Ces méthodes ont leurs avantages et le rendement des données essentielles sur le nombre d’axones, l’épaisseur de la myéline, diamètre de l’axone et diamètre de l’axone à fibres myélinisées diamètre (g-ratio) ^11,13,14,15 .

La principale distinction le plongement de résine dans le présent protocole est qu’il facilite l’obtention de 1 à 2 μm de sections transversales épaisseur en raison de la dureté de la résine tout en conservant les qualités histologiques du nerf. Ces coupes minces, plutôt que les sections d’épaisseur 4-5 μm provenant de paraffine déguisant, fournissent des sections de nerfs périphériques avec une résolution plus élevée, ce qui permet une quantification plus précise de la myélinisation des axones, tels que le g-rapport, qui ne peut pas être obtenu à partir de sections plus épais¹⁶. Sectionnement cryogéniques peut être utilisés pour obtenir des Articles de 1 à 2 µm, il a été notre expérience qu’il est plus difficile d’obtenir des sections sans grandes de nombreuses fissures. Ces sections fissurées peuvent causer comptage inexactes des aspects de la myélinisation et le nombre d’axones.

En plus de bleu de toluidine¹⁷, une médaille d’argent de coloration méthode¹⁸ et coloration trichrome de Masson⁴ permet également de montrer les axones. Toutefois, à l’aide de résine enrobage des sections de nerf médian rat teinté avec l’hématoxyline et éosine ou de Masson trichrome gaines de myéline ont montré faibles et structures non reconnus, alors que le bleu de toluidine coloration a montré clairement la myéline gaine image et peut facilement être quantifiés⁴. Malgré quelques limitations, nerfs de coloration de résine intégrée périphérique bleu de toluidine est une technique qui peut être utilisée lorsque des images de haute résolution de morphologie de nerf sont requises.

L’inconvénient principal pour l’incorporation de la résine est qu’il prend du temps et ne permet pas d’immunomarquage du même tissu en raison de la difficulté de recherche d’antigène par rapport à la paraffine et des techniques de coupes congelées d’incorporé. Ainsi, il n’est pas généralement possible d’utiliser le même tissu pour immunostaining qui est traitée par enrobage résine pour coloration bleu de toluidine. Bien que pas utilisé ici, si vous souhaitez l’immunohistochimie en résine sections embarquées, l’utilisation de l’incorporation des résines de méthacrylate de glycol permet l’immunohistochimie sur coupes de tissus, mais c’est relativement cher¹⁹. Cela peut être quelque peu atténué en coupant les nerfs périphériques en segments distincts, certains pour enrobage résine e.a. pour immunostaining directement après fixation.

Le processus de formation de bleu de toluidine taches de résine intégrée des nerfs périphériques, comme l’analyse histopathologique plus, peut être divisé en cinq étapes, y compris la fixation, déshydratation, enrobage, sectionnement et²⁰de coloration. Notre objectif ici est de fournir un protocole et des lignes directrices pratiques pour l’utilisation de résine teintées de sections de nerf sciatique de rat embarqués avec des images de haute qualité toluidine bleu d’acquérir.

Protocole

Rats Sprague Dawley adultes ont été utilisées dans ce projet et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université du Wyoming.

1. chirurgie et dans la Fixation du nerf Vivo

Remarque : Les informations sur le fournisseur pour tous les matériaux et équipements utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans la Table des matières.

NOTE : In vivo le fixation de nerf sert à préserver les tissus et réduire la dégradation structurelle qui peut survenir entre le moment de la mort et collection des nerfs. Fixation du tissu in vivo est une pratique courante pour la préparation des tissus du système nerveux pour l’histologie, où la perfusion est souvent un précurseur à cela. Le placement et la taille des nerfs périphériques autorisés pour fixation sur place. Nous ne recommandons pas de collection et la fixation des tissus après l’euthanasie en raison des risques de dégradation des tissus.

1. Préparer le rat pour l’anesthésie générale en le plaçant dans une chambre à induction avec 2-3 % isoflurane, puis placez le rat anesthésié en position couchée sur le dessus d’un tapis de dissection et maintenir à 1-2 % d’isoflurane via coiffe anesthésique. Afin d’assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie, tester les animaux pour pédale retrait sur les pattes postérieures et vérifier l’absence de réflexes palpébrales dans les yeux en touchant le canthus médial de le œil.
   Remarque : L’injection intrapéritonéale de la kétamine est une alternative couramment utilisée pour inhalation isoflurane.
2. Pour exposer le nerf sciatique, se raser les cheveux de la hind limb(s) et nettoyer les zones rasées avec l’éthanol à 70 %. Avec un scalpel ou des ciseaux, faire une incision de 2 à 3 cm dans la peau le long du membre postérieur du genou jusqu'à la grand trochanter, où palpation du fémur utilisant le scalpel stérile pour s’assurer que l’emplacement de l’incision. Le fémur se trouve proximale par rapport au segment plus accessible du nerf sciatique. Même s’il s’agit d’une chirurgie sans survie, maintenir les techniques stériles.
3. Après avoir fait l’incision cutanée, repérer le plan entre le muscle biceps fémoral et le muscle grand fessier et à l’aide de ciseaux de microdissection séparer l’aponévrose sous-jacente et exposer les 2-3 cm du nerf sciatique soulignement. Pour exposer une section libre du nerf sciatique, utiliser un enrouleur à élargir le fossé entre les deux muscles (Figure 1 a). Avec une pince fine et ciseaux iris, soigneusement séparer le nerf entourant les tissus conjonctifs, prenant grand soin de ne pas compresser ou couper le nerf.
4. Ajouter le fixateur de Trump suffisante (4 % de formaldéhyde, glutaraldéhyde à 1 % dans du PBS 1 x (tamponné phosphate salin) avec 1,16 g de NaH2PO4· H2O / 100 mL) dans la cavité contenant le nerf exposé pour couvrir le nerf et laisser reposer pendant 10 min. Si nécessaire, lieu gaze sous la postérieur des jambes pour améliorer l’angle afin que le fixateur plus peut être ajouté dans la cavité. Retirez le fixateur après 10 min et répéter cette étape deux fois plus.
5. À l’aide d’un microscope à dissection, couper le nerf des deux côtés à l’aide de ciseaux de dissection fine, faire attention à ne pas étirer ou pincer le nerf sciatique et mettre immédiatement les sections nerveuses dans des tubes de 15 mL contenant le fixateur de Trump à 4 ° C pendant une semaine, changer la fixatif toutes les 48 h.
6. N’abandonnez pas animaux au cours de n’importe quelle partie de l’intervention chirurgicale. Après l’ablation du nerf, euthanasier les animaux par dislocation cervicale sous anesthésie.

2. le tétroxyde d’Osmium traitement et résine enrobage

1. Après fixation, soigneusement retirer le nerf de toute les gras et les tissus conjonctifs et utiliser un scalpel tranchant pour couper le nerf en segments environ 5 mm de longueur (nerf segments peuvent être séparés et étiquetés dans différents tubes). Préparer des frais de 2 % le tétroxyde d’osmium dilué dans une solution de fixation de Trump et garder dans un tube de verre. Immerger les segments de nerf dans le tétroxyde d’osmium 2 % pendant 2 h, ce qui peut être dans des tubes en plastique pour cette courte période de temps.
   Remarque : Certains tubes en plastique réagissent avec le tétroxyde d’osmium, causant un assombrissement de la solution, pour un stockage prolongé du tétroxyde d’osmium dans des tubes en plastique n’est pas recommandé.
2. À l’aide d’un époxyde enrobage moyen kit, préparer la formule finale d’encastrement :
   1. Mélanger l’époxy enrobage moyen avec une solution DDSA (l’anhydride dodecenylsuccinic ; mélange A) et mélanger l’époxy enrobage moyen avec une solution NMA (l’anhydride methylnadic ; mélange B). Laissez les deux mélanges A et B mélangent au moins 20 min en remuant avec un agitateur magnétique.
   2. Immédiatement avant l’emploi, mélanger le mélange A et B et ajouter l’accélérateur DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) dans la proportion de 1,5 à 2,0 % du volume total du mélange. Notez que la solution de DPM-30 devrait être mesurée précisément pour empêcher le bloc de couleur foncée et cassants. Tous les produits chimiques de résine sont toxiques ; prendre des précautions supplémentaires pour éviter le contact avec la peau ou par inhalation.
3. À l’aide de tubes de 1,5 mL, laver les segments du nerf avec du PBS et démarrer le processus de déshydratation en plaçant les segments du nerf en acétone/distillée différents passages de l’eau : 30 %, 60 %, 90 %, des concentrations de 10 min chacun, puis dans l’acétone 100 % 3 fois pendant 10 min chaque.  Notez que l’éthanol peut être utilisé à la place de l’acétone.
4. Pour l’infiltration de la résine, placer les segments du nerf dans un mélange de 1 partie du mélange final encastrement et 1 partie 100 % acétone pendant 30 min, puis dans un mélange de 2 parts du mélange final encastrement et 1 partie 100 % acétone pendant 30 min , et enfin lieu le nerf se segmente en finale incorporant le mélange pendant 30 min.
5. Mettre les segments du nerf en incorporant des moules de caoutchouc de silicone (nous ont utilisé la longueur de 106 mm x 71 mm largeur x 7 mm de profondeur ; bloquer taille longueur 11 mm x 6 mm largeur x 3 mm de profondeur). Doucement, ajouter la résine sur le dessus les nerfs, en veillant à couvrir les segments du nerf ensemble et éviter les bulles d’air. Laisser le moule contenant des segments de nerf avec la résine de polymériser à 60 ° C pendant la nuit.

3. sectionnement par Ultramicrotome

1. Préparer des couteaux de verre à l’aide d’un verrier de couteau (Figure 1 b) et fabriquer des couteaux de verre avec des bateaux (Figure 1), qui servent à recueillir les sections nerveuses flottant sur l’eau distillée.
2. Placez les blocs nerveux résine intégrée dans le porte d’ultramicrotome trapézoïdale face vers le haut. À l’aide de la portée ultramicrotome, couper n’importe quel excès de résine qui entoure le tissu de nerf et réaliser le bloc face à une forme trapézoïdale et comme près de la surface longitudinale du nerf possible à l’aide d’une lame à simple tranchant, comme une lame de rasoir. Ne pénètrent pas la surface longitudinale du segment du nerf, qui est reconnaissable par sa coloration sombre par le tétroxyde d’osmium.
   Remarque : Suppression de l’excès de résine réduira l’aire de résine pour être sectionné et améliorer les performances de la lame et coupe dans les étapes suivantes.
3. En utilisant l’ultramicrotome, faire plusieurs coupes suffisantes pour exposer une surface uniforme coupe transversale du tissu nerveux à l’aide d’un couteau de verre plat. Une fois cela fait, passez à un couteau de verre dont le bateau est rempli d’eau distillée à la température ambiante et ajuster l’ultramicrotome à 1-2 μm pour couper des sections minces.
4. Transfert flottants lames minces du bateau de couteau verre à une goutte d’eau déionisée sur lame de verre à l’aide de la boucle en métal (Figure 1). Sécher les diapositives contenant des sections en passant plusieurs fois au-dessus d’une flamme pendant quelques secondes, faire attention à ne pas surchauffer les sections. Teindre des sections séchées immédiatement avec la toluidine bleu ou conserver à température ambiante pendant plusieurs jours avant la coloration.
   NOTE : Sections peuvent également être séchées à l’aide d’un chauffe-plat à 60 ° C pendant 15 min. Un lent processus de séchage rend les sections lisse.

4. toluidine bleu coloration

1. Préparer la solution à 1 % de bleu de toluidine dissoudre 2 g de borate de sodium dans 100 mL d’eau désionisée, puis ajouter 1 g de bleu de toluidine et remuer jusqu'à dissolution. Filtrer la solution à l’aide de papier filtre (taille des pores : 11 µm) et conserver la solution dans un flacon opaque à la température ambiante jusqu'à deux semaines.
2. À l’aide d’une pipette en plastique ou les micro pipette, ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine sur le dessus les sections nerveuses et laisser pendant 20-30 s.
3. Rincez toutes les solution de bleu de toluidine excès en plongeant doucement les lames dans le pot d’eau déionisée et répétez 3 ou 4 fois jusqu'à ce que les sections sont claires. Sécher les lames au moins 15 min à 60 ° C ou une nuit à température ambiante et puis recouvrir les sections d’un lamelle couvre-objet à l’aide du milieu de montage régulier. Examiner les diapositives montées immédiatement ou conserver à température ambiante.
4. Examiner sous un microscope optique. Un objectif d’immersion 100 X oil est recommandé pour des images détaillées permettant de calculer des ratios g.

Résultats

Résine intégrée des nerfs périphériques sections colorées au toluidine bleues permettent des analyses quantitatives précises données histologiques. Un aperçu de la procédure apparaît (Figure 2). Sections de nerfs sciatiques incorporé dans le milieu de la résine et colorées au bleu de toluidine a montré clairement des images avec une résolution optimale (3 chiffres). Lésions nerveuses peuvent causer beaucoup de changements dan...

Discussion

Examens des structures morphologiques des lésions du nerf périphérique et la régénération sont fréquents sujets d’étude¹³. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour obtenir des images de haute qualité pour les analyses quantitatives de données histologiques à l’aide de tissu de nerf sciatique du rat incorporés dans des blocs de résine et colorées au bleu de toluidine. Cette technique fournit une image de la morphologie de nerf dans laquelle la régénération nerveuse p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80