Толуидиновый синий, окрашивание смолы встроенные разделы для оценки морфологии периферической нерв

Резюме

Здесь мы представляем протокол для визуализации тонких структур периферических нервов, получения и окрашивания 1-2 мкм секции с толуидиновый синий

Аннотация

По всему телу, иннервирующих тканях-мишенях с мотором или сенсорные аксоны продлить периферических нервов. Из-за широкого распространения периферических нервов часто повреждены из-за травмы или болезни. Как оценить повреждения периферических нервов в моделях животных, функции и регенерации, были разработаны методы и стратегии анализа морфометрия периферических нервов стала важнейших терминалов результат измерения. Толуидиновый синий, окрашивание нерва крест секций, полученные из смолы встроенных разделов нерва — воспроизводимый метод для качественной и количественной оценки периферических нервов, позволяя визуализации морфологии количество аксонов и степени миелинизации. Этот метод, как и в случае многих других гистологических методов, может быть трудно учиться и мастер, с помощью стандартных письменных протоколов. Поэтому цель данного издания – подчеркнет письменные протоколы для толуидиновый синий, окрашивание периферических нервов с видеосъемка метода, с помощью седалищного нервов заготавливаемым от крыс. В этом протоколе, мы опишем в естественных условиях фиксации периферических нервов и коллекции ткани, и после фиксации с 2% осмия тетраоксид, встраивание нервов в эпоксидной смолы и ultramicrotome секционирование нервов до толщины 1-2μm. Нерва разделы затем передан на стеклянное скольжение и витражи с толуидиновый синий, после чего они количественно и качественно оцениваются. Приведены примеры наиболее распространенных проблем, а также шаги для смягчения этих проблем.

Введение

Периферические нервы распространяется по всему телу, иннервирующих тканях-мишенях с мотором или сенсорные аксоны¹. Периферические нервные дефекты, вызванные медицинских расстройств и травм являются проблемой общественного здравоохранения и имеют большие экономические последствия^2,3. Несмотря на успехи в оценке результатов повреждений периферических нервов и пониманию регенерации нервных традиционные методы, такие как нерв гистологии и пятная методы являются важнейшими инструментами качественно и количественно оценить нерва здоровье как терминал результатов измерения в животных моделях или подакцизным тканей человека. Это часто в паре с электрофизиологические измерения функции периферических нервов, где морфометрия может раскрыть почему функциональных нервных регенерации сделал или не происходит.

Толуидиновый синий окрашивание участков смолы встроенных полутонкая периферических нервов — это специальный метод для визуализации Миелинизированные нервные волокна, обеспечивая высокое качество и четкие подробные изображения нервных структур^4,5,6 . Толуидиновый синий ацидофильной МЕТАХРОМАТИЧЕСКАЯ пятно, обнаруженный Уильям Перкин в 1856 году⁷и был использован в нескольких медицинских приложений⁸. Толуидиновый синий окрашенных периферических нервов секции полученных от смолы встроенный нерв сегментов позволяет четкие визуализации нервных структур. Визуализация Миелиновые оболочки структуры можно повысить путем использования осмия тетраоксид после фиксации^4,9. Осмия тетраоксид — токсичных окислителя и липидов фиксирующие агент, который взаимодействует с двойными связями в липидах, что приводит к совершенно определенный липид богатые миелина влагалищ¹⁰. Однако осмия тетраоксид токсичных, дорогие, требует больше инкубации нерв сегментов и не всегда используется.

Альтернативные методы обработки и окраски были разработаны для визуализации периферического нерва морфологии; Парафин, криогенные секционирование и эпоксидной смолы встроенный нерва секционирование следуют окрашивание с толуидиновый синий или фенилендиамином решения была использована для количественного определения морфологические изменения периферического нерва регенерации ^11,12 . Эти методы имеют свои преимущества и урожайность основных данных о количестве аксоны, толщина миелина, аксон диаметр и аксон диаметром до Миелинизированные волокна диаметром (g коэффициент) ^11,13,14,15 .

Основной различие смолы-вложения в этот протокол является, что облегчает получение 1-2 мкм толщина сечения из-за твердости смолы при сохранении гистологические качеств нерва. Эти тонкие, в отличие от 4-5 мкм толщина секций, полученные из парафина встраивание, разделах периферических нервов разделы с более высоким разрешением, позволяющие более точную количественную оценку миелинизации аксона, таких как g коэффициент, который не может быть полученные от толще разделы¹⁶. Хотя криогенных секционирование может использоваться для получения разделы 1-2 мкм, это был наш опыт, что это более трудно получить секции без многочисленных крупных трещин. Такие трещины секций может привести к неточной подсчитывая количество аксонов и аспекты миелинизации.

Помимо окрашивания¹⁷толуидиновый синий серебряный пятнать метод¹⁸ и Массон trichrome окрашивание⁴ может использоваться также показать нервные аксоны. Однако с помощью смолы встраивание крыса срединного нерва секций витражи с гематоксилином и эозином или Массон в trichrome показал слабый миелиновой оболочки и непризнанных структуры, тогда как окрашивание толуидиновый синий показал ясно Миелиновые оболочки изображения и легко может быть количественных⁴. Несмотря на некоторые ограничения толуидиновый синий окраски смолы встроенные периферийные нервы это ценный метод, который может использоваться при необходимости изображения с высоким разрешением нерва морфологии.

Основным недостатком для встраивания смола является что это занимает много времени и не позволяет иммуноокрашивания же ткани из-за сложности антигена поиска по сравнению с парафином и замороженных встроенные разделы методов. Таким образом это не возможно использовать же ткани для иммуноокрашивания, который обрабатывается через встраивание смолы для окрашивания толуидиновый синий. Хотя не используется здесь, по желанию иммуногистохимия смолы встроенные разделы, использование гликоля метакрилата, встраивание смолы позволяет для иммуногистохимии выполняется на разделах ткани, но она является относительно дорогим¹⁹. Это могут быть несколько смягчены путем разрезания периферических нервов на отдельные сегменты, некоторые для встраивания смолы и другие для иммуноокрашивания сразу после фиксации.

Процесс окрашивания толуидиновый синий смолы встроенных периферических нервов, как с наиболее гистопатологические анализа, могут быть разбиты на пять этапов, включая фиксацию, обезвоживание, встраивание, секционирование и пятнать²⁰. Здесь мы стремимся предоставить протокол и практического руководства для использования смолы окрашенных встраиваемых крыса седалищного нерва разделы с толуидиновый синий получить высокое качество изображения.

протокол

Взрослый крысах Sprague-Dawley были использованы в этом проекте, и все процедуры были одобрены Университет Вайоминга институционального ухода за животными и использования Комитетом.

1. операции и в Vivo нерва фиксации

Примечание: Поставщиков информации для всех материалов и оборудования, используемых в настоящем Протоколе, перечислены в Таблице материалов.

Примечание: В естественных условиях фиксации нерва используется для сохранения ткани и снижения структурной деградации, которая может возникнуть между коллекции нервы и время смерти. В естественных условиях фиксации ткани является стандартной практикой для подготовки системы нервной ткани гистологии, где перфузии часто является прекурсором для этого. Размещение и размер периферических нервов, допускается для фиксации на месте. Мы не рекомендуем коллекции и фиксации ткани после эвтаназии благодаря возможности деградации ткани.

1. Готовить крыс для общей анестезии, поместив его в камеру всасывание с изофлюрановая 2-3%, а затем место наркотизированных крыс в лежачем положении на вершине рассечение мат и поддерживать на 1-2% изофлюрановая через обезболивающий носовой конус. Для обеспечения адекватной глубины анестезии, подопытных животных для педали вывода на задние лапы и проверьте отсутствие глазной рефлексы на глаза, прикоснувшись медиального угла глазной щели глаза.
   Примечание: Внутрибрюшинного введения кетамин является часто используемым альтернативой вдыхаемого изофлюрановая.
2. Подвергать седалищного нерва, брить волосы hind limb(s) и чистые бритые районы с 70% этиловом спирте. С помощью скальпеля или ножницы, сделать 2-3 см разрез в коже вдоль задних конечностей от колена до более вертела, где пальпация бедренной кости с помощью стерильным скальпель обеспечить правильное место разреза. Бедренная кость расположен только проксимальнее наиболее доступный сегмент седалищного нерва. Несмотря на то, что это-выживание хирургии, поддерживать стерильные приемы.
3. После внесения Кожный разрез, найдите плоскости между двуглавой мышцы бедра мышцы и большая ягодичная мышца и ножницами microdissection отделить основной фасции и разоблачить 2-3 см подчеркивание седалищного нерва. Для предоставления четкой секции седалищного нерва, используйте втягивающего устройства для разрыв между двумя мышцы (рис. 1A). С тонкой щипцы и Ирис ножницы тщательно отдельными нерв от окружающих соединительной ткани, принимая большую осторожность, чтобы не сжать или вырезать нерва.
4. Добавьте достаточно Трамп фиксатор (4% формальдегида, глютаральдегид 1% в однократном ПБС (-фосфатный буфер) с 1,16 г NaH2PO4· H2O на 100 мл) в полость, содержащая подвергается нерв для того чтобы покрыть нерва и пусть сидят в течение 10 мин. Если необходимо, марлевые место под задние ноги улучшить угол, так что больше фиксатором могут быть добавлены в полость. Снимите фиксатор после 10 минут и повторите этот шаг еще два раза.
5. Под микроскопом рассечения, сократить нерва с обеих сторон с помощью тонкой Рассечение ножницами, чтобы не растянуть или сжать седалищный нерв и сразу же поставить разделов нерва в 15 мл пробирки, содержащие Трампа фиксатором на 4 ° C на одну неделю, изменяя фиксатор каждые 48 ч.
6. Не оставляйте животных без присмотра во время любой частью хирургической процедуры. После удаления нерва усыпить животных путем дислокации шейки матки под наркозом.

2. осмия тетраоксид лечение и встраивание смолы

1. Сообщение фиксации, тщательно удалите оставшиеся жира и соединительной ткани из нерва и использовать острый скальпель нарезать нерв сегментов около 5 мм в длину (воспалении сегменты могут быть разделены и помечены в разных трубок). Подготовьте свежие 2% осмия тетраоксид разводят в Trump фиксирующие решения и хранить в стеклянной трубки. Погружайте нерв сегментов в 2% осмия тетраоксид 2 h, который может быть в пластиковые трубы для этого короткого периода времени.
   Примечание: Некоторые пластиковые трубы реагируют с осмия тетраоксид, вызывая потемнение решения, поэтому не рекомендуется длительное хранение осмия тетраоксид в пластиковых тубах.
2. С помощью эпоксидных, встраивание Средний комплект, подготовка окончательного внедрения формулы:
   1. Mix эпоксидной, встраивание среднего раствором DDSA (dodecenylsuccinic ангидрид; смесь A) и смеси эпоксидных, встраивание среднего раствором НМА (methylnadic ангидрид; смесь B). Пусть обе смеси, которые A и B mix по крайней мере 20 минут перемешивания с магнитной мешалкой.
   2. Непосредственно перед применением перемешать смесь A и B и добавить ускоритель DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) в соотношении 1,5-2,0% от общего объема смеси. Обратите внимание, что решение DPM-30 должны оцениваться именно для того, чтобы предотвратить превращение темного цвета и хрупкий блок. Все смолы химические вещества, токсичные; принять дополнительные меры для предотвращения контакта с кожей или вдыхания.
3. Использование 1.5 мл пробирок, мыть нерв сегментов с PBS и начать процесс обезвоживания, поместив нерв сегментов в разных ацетон/дистиллированной воды проходы: 30%, 60%, 90%, концентрации за 10 мин, затем в 100% ацетона 3 раза по 10 мин.  Обратите внимание, что этанол может использоваться вместо ацетона.
4. Для проникновения смолы место нерв сегментов в смесь 1 часть окончательного внедрения смеси и 1 часть 100% ацетона для 30 мин, затем в смесь из 2 частей окончательного внедрения смеси и 1 часть 100% ацетона для 30 мин , и наконец место нерв сегментов в финале встраивание смесь для 30 мин.
5. Положите нерв сегментов в Силиконовой резины, встраивание формы (мы использовали длина 106 мм х 71 мм ширина х 7 мм Глубина; заблокировать размер 11 мм длина х 6 мм ширина х 3 мм глубина). Аккуратно добавьте смолы на вершине нервы, убедившись в том охватить весь нерв сегментов и избежать воздушных пузырей. Оставьте плесень, содержащие нерв сегментов смолой для полимеризации при 60 ° C на ночь.

3. секционирование по Ultramicrotome

1. Подготовка стекла ножи с помощью ножа чайник стекла (рис. 1B) и сделать стекло ножи с лодки (рис. 1 c), которые используются для сбора разделов нерва, плавающей на дистиллированной воде.
2. Место смолы встроенные блоки нерва в держатель ultramicrotome с трапециевидной стороной вверх. С помощью области ultramicrotome, обрезать любой избыток смолы, окружающие ткани нерва и сделать блок сталкиваются трапециевидную форму и как близко к поверхности продольные нерва как можно с помощью одним краем лезвия, как лезвие бритвы. Не проникают поверхности продольные сегмента нерва, которая распознается по его темный пятнать, осмия тетраоксид.
   Примечание: Обрезки избыточных смолы уменьшит площадь смолы для быть секционного и улучшения производительности лезвие и резки в последующих шагах.
3. Используя ultramicrotome, сделайте несколько поперечных сечений для выявления форма поперечного сечения поверхности нервных тканей, с использованием простого стекла нож достаточно. Как только это будет сделано, перейдите на нож стекла которых лодка заполнена с дистиллированной водой при комнатной температуре и отрегулировать ultramicrotome до 1-2 мкм для резки тонких секций.
4. Передать плавающей шлифов из лодки нож стекла капля деионизованной воды на слайде стекла с использованием металлической петлю (рис. 1 d). Сухие слайды, содержащие разделы, передав несколько раз на огне в течение нескольких секунд, убедившись в том, чтобы не перегреть разделы. Пятно сушеные секции сразу с толуидиновый синий, или хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней до окрашивания.
   Примечание: Разделы можно также сушат с помощью плиты теплее при 60 ° C 15 мин. Медленный процесс сушки делает разделы гладкой.

4. толуидиновый синий пятнать

1. Подготовить раствор 1% толуидиновый синий, растворяя 2 g Борат натрия в 100 мл деионизированной воды, затем добавить 1 g толуидиновый синий и размешайте до растворения. Фильтр решения с помощью фильтровальной бумаги (размер пор: 11 мкм) и сохранить решение в непрозрачной бутылке при комнатной температуре до двух недель.
2. Использование пластиковых дозаторов или микро дозаторов, добавить каплю раствора толуидиновый синий верхней секции нерва и оставить на 20-30 s.
3. Смыть все избыточные решения толуидиновый синий, осторожно опуская слайды в дейонизированной воде банку и повторить 3 - 4 раза до тех пор, пока разделы ясны. Сухие слайды по крайней мере 15 мин при 60 ° C, или на ночь при комнатной температуре, а затем покрыть разделы с coverslip, с помощью регулярных монтажа средних. Изучить навесные слайды сразу или хранить при комнатной температуре.
4. Рассмотреть под микроскопом света. Объектив 100 X нефти погружения рекомендуется для подробного изображения, используемые для вычисления g коэффициенты.

Результаты

Смола встроенных периферических нервов, разделы, окрашенных с толуидиновый синий позволяют для точных гистологических данных количественной. Обзор процедуры показан на (рис. 2). Седалищного нервов разделы встроенных в смолы и витражи с толуидиновый си...

Обсуждение

Экзаменов морфологических структур, травмы периферических нервов и регенерации являются частые темы исследования¹³. В этом протоколе мы описывают шаги для получения высокого качества изображений для количественной гистологических данных с использованием крыса седалищн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80