Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet Abschnitte für die Beurteilung der Morphologie der peripheren Nerven

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die feinen Strukturen des peripheren Nerven visualisieren und 1-2 µm Abschnitte mit Toluidin blauer Färbung

Zusammenfassung

Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen. Aufgrund der weiten Verbreitung sind periphere Nerven häufig wegen Verletzung oder Krankheit beschädigt. Methoden und Strategien entwickelt wurden, um periphere Nervenverletzung in Tiermodellen, Funktion und Regeneration, bewerten analysieren die Morphometrie der peripheren Nerven ein wesentliches Ergebnis der terminal-Messung geworden ist. Toluidin blauer Färbung des Nervs Kreuz Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Abschnitte ist eine reproduzierbare Methode für die qualitative und quantitative Beurteilung der peripheren Nerven, ermöglicht die Visualisierung der Morphologie Anzahl der Axone und Grad der Myelinisierung. Diese Technik kann wie bei vielen anderen histologischen Methoden schwierig sein zu erlernen und zu beherrschen, mit schriftlichen Standardprotokolle. Die Absicht dieser Veröffentlichung ist daher um schriftliche Protokolle für Toluidin blauer Färbung der peripheren Nerven mit Videografie von der Methode, bei der Ischias Nerven geerntet von Ratten zu betonen. In diesem Protokoll beschreiben wir in Vivo peripheren Nerven Fixierung und Sammlung der Gewebe und Post-Fixierung mit 2 % Osmium ausgefällt, Einbettung von Nerven in Epoxidharz und regungsloses Nerven 1-2μm Dicke schneiden. Nerv Abschnitte dann auf einen Objektträger übertragen und gefärbt mit Toluidin blau, woraufhin sie quantitativ und qualitativ bewertet werden. Beispiele für die häufigsten Probleme sind sowie Schritte zur Eindämmung dieser Probleme angezeigt.

Einleitung

Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen¹. Periphere Nerven Mängel verursacht durch Erkrankungen und Trauma eine große Gesundheitsproblem darstellen und haben große wirtschaftliche Auswirkungen^2,3. Trotz der Fortschritte bei der Bewertung der Ergebnisse der peripheren Nervenverletzungen und Verständnis Nervenregeneration sind traditionelle Methoden wie Nerven Histologie und Färbetechniken wesentliche Instrumente, um qualitativ und quantitativ Nerven Gesundheit bewerten als terminal Ausgang Maß in Tiermodellen oder ausgeschnittenen menschliches Gewebe. Dies ist oft mit elektrophysiologische Messungen der peripheren Nervenfunktion, gepaart wo Morphometrie offenbaren kann, warum funktionelle Nervenregeneration habe oder nicht auftreten.

Toluidin blauer Färbung der Harz eingebettet Semi-dünne periphere Nerven Abschnitte ist eine spezielle Methode für imaging Markhaltige Nervenfasern, qualitativ hochwertige und klare detaillierte Bilder von Nerv Strukturen^4,5,6 . Toluidin blau ist ein acidophilen metachromatic Fleck, von William Henry Perkin im Jahre 1856⁷, entdeckt und wurde in mehreren medizinischen Anwendungen⁸verwendet. Toluidin blau gefärbten peripheren Nerven Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Segmenten ermöglicht eine übersichtliche Visualisierung von Nervenstrukturen. Visualisierung der Myelinscheide Struktur kann durch die Verwendung von Osmium ausgefällt Post-Fixierung^4,9verbessert werden. Osmium ausgefällt ist eine toxische Oxidationsmittel und Lipid Fixativ Agent, die Interaktion mit den Doppelbindungen in Lipiden, was zu krass definierten lipidreichen Myelinscheiden¹⁰. Jedoch Osmium ausgefällt ist giftig, teuer, erfordert eine längere Inkubationszeit der Nerv Segmenten und wird nicht immer verwendet.

Zur Visualisierung der peripheren Nerven Morphologie wurden alternative Methoden der Verarbeitung und Färbung entwickelt; Paraffin, Kryo-Schnitt und Epoxy-Harz eingebettet Nerv Schnitt gefolgt von Färbungen mit Toluidin blau oder Phenylendiamin Lösung verwendet wurde, um morphologische Veränderungen der peripheren Nerven Regeneration ^{11,12 zu quantifizieren} . Jede dieser Methoden haben ihre vor- und Ertragsdaten wesentlich von der Anzahl der Axone, Myelin Dicke, Axon Durchmesser und Axon Durchmesser Markhaltige Faser Durchmesser (g-Wert) ^11,13,14,15 .

Der primäre Unterschied der Harz-Einbettung in diesem Protokoll ist, dass es 1-2 μm Dicke Querschnitte aufgrund der Härte des Harzes erleichtert unter Beibehaltung der histologischen Eigenschaften des Nervs zu erhalten. Diese dünne Abschnitte, im Gegensatz zu den 4-5 μm Dicke Abschnitte von Paraffin einbetten, erhalten bieten peripheren Nerven Abschnitte mit höherer Auflösung, so dass für eine genaue Quantifizierung der Axon Myelinisierung, wie der g-Wert, die nicht aus dickeren Abschnitte¹⁶gewonnen. Während Kryo-Schnitt verwendet werden kann um 1-2 µm Abschnitte zu erhalten, ist es unserer Erfahrung gewesen, ist es schwieriger, ohne zahlreiche große Risse zu bekommen. Solche Risse Abschnitte kann ungenau zählen die Anzahl der Axone und Aspekte der Myelinisierung.

Neben Toluidin Blau Färbung¹⁷eine silberne Färbung Methode¹⁸ und Masson trichrome Färbung⁴ auch einsetzbar, Nervenzellen Axone zu zeigen. Jedoch gebeizt mit Harz Einbettung der Ratte n. medianus Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin oder Masson trichrome zeigte schwache Myelinscheiden und unbekannte Strukturen, während Toluidin blauer Färbung klar Myelinscheide Bild zeigte und kann leicht quantifizierte⁴sein. Trotz einiger Einschränkungen Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet peripheren Nerven ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden kann, wenn Bilder mit hoher Auflösung der Nerv Morphologie erforderlich sind.

Der primäre Nachteil für die Einbettung von Harz ist, dass es zeitaufwendig ist und nicht für Immunostaining des gleichen Gewebes aufgrund der Schwierigkeiten der Antigen-Retrieval gegenüber Paraffin und eingebettete Gefrierschnitte Techniken zu ermöglichen. So kann es nicht im Allgemeinen das gleiche Gewebe für Immunostaining zu nutzen, die über Harz-Einbettung für Toluidin blauer Färbung verarbeitet wird. Obwohl nicht verwendet hier ggf. Immunohistochemistry im Harz eingebettete Abschnitte, die Verwendung von Glykol Methacrylat Einbettung Harze ermöglicht Immunohistochemistry Gewebeschnitte ausgeführt werden, aber es ist relativ teuer¹⁹. Dies kann etwas gemildert durch Einschneiden der peripheren Nervs, separate Segmente, einige für die Einbettung von Harz und andere für Immunostaining direkt nach der Fixierung.

Der Prozess der Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet periphere Nerven, wie mit die meisten histopathologische Analyse in fünf Stufen, einschließlich Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und färben²⁰unterteilt werden kann. Hier wollen wir ein Protokoll und einen praktischen Leitfaden für die Verwendung von Harz eingebettete Ratte Ischiasnerv Abschnitte gebeizt mit Toluidin blau erwerben Bilder in hoher Qualität bieten.

Protokoll

Erwachsene Sprague-Dawley Ratten wurden in diesem Projekt verwendet und alle Verfahren wurden von der University of Wyoming institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt.

1. Chirurgie und In Vivo -Nerv-Fixierung

Hinweis: Herstellerinformationen für alle Materialien und Geräte verwendet, die in diesem Protokoll finden Sie in der Tabelle der Materialien.

Hinweis: In Vivo Nerv Fixierung wird verwendet, um das Gewebe zu bewahren und reduzieren strukturelle Verschlechterung, die zwischen dem Zeitpunkt des Todes und Sammlung der Nerven auftreten können. In Vivo Gewebe Fixierung ist ein Standardverfahren für die Vorbereitung des Nervensystems Gewebe für Histologie, wo die Perfusion ist oft eine Vorstufe dazu. Die Anordnung und Größe der peripheren Nerven, die für in-situ Fixierung erlaubt. Wir empfehlen nicht Sammlung und Fixierung des Gewebes nach Euthanasie durch die Möglichkeit der Schädigung von Gewebe.

1. Die Ratte für die Vollnarkose vorbereiten, indem man sie in eine Kammer Induktion mit 2-3 % Isofluran, dann die narkotisierten Ratte in Bauchlage auf der Oberseite eine Dissektion Matte und auch bleiben bei 1-2 % der Isofluran über Narkose bugnase. Um ausreichende Tiefe der Narkose zu gewährleisten, testen Sie Tiere für Pedal Rückzug auf die Hinterfüße zu und überprüfen Sie das Fehlen von palpebrale Reflexe an den Augen durch Berühren der medialen Augenwinkel des Auges.
   Hinweis: Intraperitoneale Injektion von Ketamin ist eine häufig verwendete Alternative zu inhalierten Isofluran.
2. Um den Ischiasnerv freizulegen, rasieren Sie die Haare von den Hind limb(s) und reinigen Sie die rasierten Bereiche mit 70 % Ethanol. Mit einem Skalpell oder einer Schere, machen einen 2-3 cm Einschnitt in die Haut entlang der hinteren Gliedmaßen vom Knie bis zu den Trochanter Major, wo Palpation des Oberschenkelknochens mit dem sterilen Skalpell um die richtige Position des Schnittes zu gewährleisten. Das Femur befindet sich nur auf das zugänglichste Segment des Nervus ischiadicus proximal. Obwohl dies eine Operation nicht überleben wird, pflegen Sie sterile Techniken.
3. Nach dem vornehmen der hautinzision, suchen Sie das Flugzeug zwischen den Muskel Bizeps Femoris und den Musculus Muskel, und mit Mikrodissektion Schere trennen die zugrunde liegenden Faszie und setzen 2-3 cm des Nervus ischiadicus unterstreichen. Um eine klare Abschnitt des n. ischiadicus verfügbar zu machen, verwenden Sie einen Retraktor, um die Kluft zwischen den beiden Muskeln (Abbildung 1A) zu vergrößern. Trennen Sie mit feinen Zangen und Iris Schere vorsichtig den Nerv aus den umliegenden Bindegewebes, unter größter Sorgfalt nicht zu komprimieren oder Schnitten den Nerv.
4. Fügen Sie ausreichend Trump Fixativ (4 % Formaldehyd, 1 % Glutaraldehyd mit 1 X PBS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) mit 1,16 g NaH2PO4· H2O pro 100 mL) in den Hohlraum mit exponierten Nervs Nervus abdecken und 10 Minuten ruhen lassen. Wenn nötig, Platz Gaze unter der Hind Bein, um den Winkel zu verbessern, so dass mehr Fixiermittel in den Hohlraum hinzugefügt werden kann. Entfernen Sie das Fixiermittel nach 10 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
5. Mit einem sezierenden Mikroskop schnitten den Nerv von beiden Seiten mit feinen Dissektion Schere, sicherstellen, dass nicht zu dehnen oder zu kneifen der Ischiasnerv und sofort die Nerven-Abschnitte in 15 mL Röhrchen mit Trumps Fixiermittel bei 4 ° C für eine Woche, Ändern der Fixiermittel alle 48 h.
6. Nicht unbeaufsichtigt lassen Tiere während eines Teils des chirurgischen Eingriffs. Nach der Entfernung des Nervs einschläfern Sie Tiere durch zervikale Dislokation unter Narkose.

(2) Osmium ausgefällt Behandlung und Harz einbetten

1. Post-Fixierung, sorgfältig entfernen Sie alle verbleibenden Fett und Bindegewebe vom Nerv und mit einem scharfen Skalpell schnitten den Nerv in Segmente ca. 5 mm in der Länge (Nerv Segmente getrennt und in verschiedene Leitungen gekennzeichnet werden können). Bereiten Sie frische 2 % Osmium ausgefällt in Trumps Fixativ Lösung verdünnt und halten in einer Glasröhre. Tauchen Sie Nerven Segmente in 2 % Osmium ausgefällt für 2 h, die im Kunststoff-Rohre für diesen kurzen Zeitraum der Zeit sein kann.
   Hinweis: Einige Kunststoffrohre reagieren mit Osmium ausgefällt, verursacht eine Verdunkelung der Lösung, daher längerer Lagerung von Osmium ausgefällt in Kunststoffrohren nicht empfohlen.
2. Mit einer Epoxy Einbettung mittlere Kit, bereiten Sie die endgültige Einbettungs-Formel:
   1. Mischen Sie das Epoxidharz einbetten Medium mit DDSA-Lösung (Dodecenylsuccinic-Anhydrid; Mischung A) und mischen Sie das Epoxidharz einbetten Medium mit NMA-Lösung (Methylnadic-Anhydrid; Mischung B). Lassen Sie beide Mischungen, die A und B mindestens 20 min durch Rühren mit einem Magnetrührer mischen.
   2. Unmittelbar vor der Anwendung mischen Sie A und B-Mischung und fügen Sie das Gaspedal DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) im Verhältnis von 1,5 bis 2,0 % des Gesamtvolumens des Gemisches. Beachten Sie, dass die DPM-30 Lösung gemessen werden sollte, gerade um zu verhindern, dass den Block immer dunkel in der Farbe und spröde. Alle Harz-Chemikalien sind giftig; seien Sie besonders vorsichtig, Hautkontakt oder Inhalation zu verhindern.
3. Mit 1,5 mL-Tuben, Nerv Segmenten mit PBS waschen und die Austrocknung zu starten, indem man die Nerv Segmenten in verschiedenen Aceton/destilliertes Wasser Passagen: 30 %, 60 %, 90 %, Konzentrationen für 10 min, dann in 100 % Aceton 3 Mal für 10 Minuten.  Beachten Sie, dass Ethanol anstelle Aceton verwendet werden kann.
4. Platzieren Sie für Harz Infiltration den Nerv Segmenten in einer Mischung aus 1 Teil der abschließenden Einbettung Mischung und 1 Teil 100 % Aceton für 30 min, dann in einer Mischung aus 2 Teilen der abschließenden Einbettung Mischung und 1 Teil 100 % Aceton für 30 min , und schließlich der Nerv im Finale Segmenten Platz Einbettung Mischung für 30 Minuten.
5. Silikon-Kautschuk Einbettung Formen die Nerv Segmenten umgesetzt (wir haben 106 mm Länge x 71 mm Breite x 7 mm Tiefe verwendet; Blocklänge Größe 11 mm x 6 mm Breite x 3 mm Tiefe). Fügen Sie sanft das Harz auf die Nerven, und achten Sie auf decken die gesamten Nerv Segmenten und verhindern, dass Luftblasen. Lassen Sie die Form mit Nerv Segmenten mit dem Harz über Nacht bei 60 ° C polymerisieren.

3. Schnitt durch regungsloses

1. Bereiten Sie Glas Messer mit einer Glas-Messermacher (Abbildung 1 b) und machen Sie Glas Messer mit Booten (Abbildung 1), die verwendet werden, auf das destillierte Wasser schwimmenden Nerv zu sammeln.
2. Ort Harz eingebettet Nervenblockaden in regungsloses Halter mit der trapezförmige Seite nach oben. Mit regungsloses Rahmen, kein überschüssiges Harz rund um das Nervengewebe zu trimmen, und den Block eine Trapezform Gesicht und möglichst nahe an der längs-Oberfläche des Nervs wie möglich mit einer einseitig geschliffenen Klinge wie eine Rasierklinge. Dringen Sie nicht längs Oberfläche des Segments Nerv, die erkennbar durch seine dunkle Färbung von Osmium ausgefällt.
   Hinweis: Trimmen des überschüssigen Harzes verringert sich das Gebiet des Harzes werden geschnitten und Leistung der Blade und schneiden in den nachfolgenden Schritten verbessern.
3. Mit der regungsloses stellen Sie mehrere Querschnitte ausreichend, um eine gleichmäßige Querschnitt Oberfläche des Nervengewebes mit einem einfachen Glas-Messer verfügbar zu machen. Sobald dies geschehen ist, wechseln Sie zu einem Glas Messer, dessen Schiff mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt ist, und passen Sie die regungsloses, 1-2 μm dünne Abschnitte geschnitten.
4. Übertragen Sie schwimmende Dünnschliffe aus dem Glas-Messer-Boot zu einem Rückgang von entionisiertem Wasser auf Objektträger mit Metallöse (Abbildung 1). Trocknen Sie Folien mit Abschnitten, indem man mehrere Male über einer Flamme für ein paar Sekunden, und achten Sie nicht auf die Abschnitte zu überhitzen. Getrocknete Teile sofort mit Toluidin blauer Fleck oder für mehrere Tage vor der Färbung bei Raumtemperatur lagern.
   Hinweis: Abschnitte können auch mit einer Warmhalteplatte bei 60 ° C für 15 min getrocknet werden. Eine langsame Trocknung macht die Abschnitten glatt.

4. Toluidin blauer Färbung

1. Bereiten Sie 1 % ige Lösung von Toluidin blau durch 2 g Natrium Borat in 100 mL entionisiertem Wasser auflösen dann fügen Sie 1 g Toluidin blau hinzu und rühren Sie, bis aufgelöst. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier (Porengröße: 11 µm) und halten Sie die Lösung in eine undurchsichtige Flasche bei Raumtemperatur bis zu zwei Wochen.
2. Mit einem Kunststoff-Pipette oder Mikro-Pipette, einen Tropfen Toluidin blau Lösung oben auf der Nerv-Abschnitte und lassen für 20-30 s.
3. Spülen Sie alle überschüssige Toluidin blau-Lösung durch die Folien in entionisiertem Wasser Glas sanft eintauchen und wiederholen Sie 3-4 Mal, bis Abschnitte klar sind. Trocknen Sie die Folien mindestens 15 min bei 60 ° C oder über Nacht bei Raumtemperatur und dann bedecken Sie die Abschnitte mit einem deckgläschen mit regelmäßigen Eindeckmedium. Untersuchen Sie die gerahmten Dias sofort oder bei Raumtemperatur lagern.
4. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop. A 100 X Öl Immersion-Objektiv empfiehlt sich für detaillierte Bilder verwendet, um g-Werte zu berechnen.

Ergebnisse

Harz eingebettet peripheren Nerven Abschnitte mit Toluidin blau gebeizt für genaue histologische Daten Quantifizierungen ermöglichen. Ein Überblick über das Verfahren zeigt (Abbildung 2). Ischias-Nerven-Abschnitte in Harz Medium eingebettet und befleckt mit Toluidin blau zeigte klare Bilder mit einer optimalen Auflösung (Abb. 3). Nervenschäden kann viele Veränderungen in Nervenzellen morphologische Strukturen, z. B. Veränderungen der ...

Diskussion

Untersuchungen der morphologischen Strukturen der periphere Nervenverletzung und Regeneration sind häufige Themen der Studie¹³. In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um Bilder in hoher Qualität für histologische Daten Quantifizierungen mit Ratte Ischias-Nervengewebe eingebettet in Harz Blöcken und gefärbt mit Toluidin blau zu erhalten. Diese Technik bietet ein Bild der Nerv Morphologie der Nervenregeneration durch Messung der Zahl von Axonen, Grad der Myelinisierung, Vorhandensein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline	Gibco	14200-075
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Sodium Tetraborate Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Epoxy Embedding Medium Kit	Sigma-Aldrich	45359
Sodium Hydroxide Solution	Sigma-Aldrich	72068	To adjust Trump's fixative pH
Acetone	Fisher Chemical	170942
Osmium Tetroxide Solution	Sigma-Aldrich	75632
VWR Micro Slides, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Glass Knife Maker	RMC Products	GKM-2
Ultramicrotome	RMC Products	MT-XL
15 mL Conical Tube	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Glass Vial	Sigma-Aldrich	854190
Razor Blades	VWR	55411-050	For trimming resin block
Perfect Loop	Electron Microscopy Sciences	70944	For picking up thin resin sections
Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm	Electron Microscopy Sciences	71012
100 Watt Oven	Millipore	6350115
Whatman Filter Paper	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 mL plastic pipette	Sigma-Aldrich	Z331740
Micro-surgical Kit	World precision instruments
Olympus fluorescence microscope			Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80