الكهربية كل خلية من خلايا Enterochromaffin موريني مثقف الأولية

Summary

خلايا Enterochromaffin (EC) تضم مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا الظهارية المعدية المعوية. خلايا الجماعة الأوروبية منفعل كهربائياً وإطلاق السيروتونين، بعد صعوبات في استزراع وتحديد خلايا الجماعة الأوروبية محدودة الدراسات الفسيولوجية. الطريقة المعروضة هنا تؤسس نموذج ثقافة الأولية قابلة للفحص لخلايا الجماعة الأوروبية الكهربية.

Abstract

وتشكل خلايا Enterochromaffin (الجماعة الأوروبية) في الظهارة (غي) الجهاز الهضمي يتدنى أكبر من الخلايا انتيروندوكريني. كخلايا حسية متخصصة، بمعنى المحفزات لومينال خلايا الجماعة الأوروبية وتحويلها إلى أحداث إطلاق السيروتونين (5-هيروكسيتريبتاميني، 5-HT). ومع ذلك، هو غير مفهومة الكهربية لهذه الخلايا لأنها صعبة للثقافة وتحديد. الطريقة التي عرضت في هذه الورقة الخطوط العريضة الأولية EC خلية الثقافات الأمثل للكهربية خلية مفردة. هذا البروتوكول يستخدم مراسل المعدلة وراثيا بروتين فلوري سماوي (CFP) لتحديد خلايا الجماعة الأوروبية الماوس في الثقافات الابتدائية المختلطة، النهوض بالنهج المتبع للحصول على تسجيلات عالية الجودة الكهربية الخلية كلها في أوضاع المشبك الجهد والحالية.

Introduction

الظهارة (غي) الجهاز الهضمي مجتمع متنوع يتكون من عدة أنواع من الخلايا. الخلايا انتيروندوكريني تضم حوالي 1% من جميع الخلايا الظهارية، وخلايا enterochromaffin (المفوضية الأوروبية) هي أكبر انتيروندوكريني خلية السكان¹. وتظهر الدراسات الأخيرة أن انتيروندوكريني² و^3،EC⁴ خلايا منفعل كهربائياً. ونحن مهتمون بفهم الجماعة الأوروبية الرئيسية الخلية الكهربية. وهكذا، كان الغرض من هذه الدراسة إنشاء الأساسي الثقافات الخلية EC الأمثل للكهربية الخلية كلها.

خلية الجماعة الأوروبية القائمة عادة ما يتم إنشاء الأسطر التي تنتج وتفرز 5-HT (مثلاً، قجب-1⁵، بون⁶، كرج-1⁷) وقد استخدمت لدراسة الكهربية^5،8 من خلد الورمية الأنسجة. أن المعلومات المكتسبة من هذه الخطوط الخلية القيمة^5،8، فالدراسات الكهربية الخلية الأولية ضرورية لفهم فيزيولوجيا الخلية المفوضية الأوروبية بشكل صحيح. يتطلب الكهربية لخلايا الجماعة الأوروبية أولية بالعزلة وثقافة واحدة من الخلايا الظهارية، الذي كان محدودا باستمرارية انخفاض الثقافات الظهارية.

يعتمد الأسلوب الثقافة المقدمة في هذه الدراسة على الفئران المحورة وراثيا مع خلايا الجماعة الأوروبية المسماة فلوريسسينتلي، مثل Tph1-الحراجية المعتمدة⁹، المستخدمة في هذه الدراسة. الأسلوب الذي يحسن ابتدائية مختلطة الثقافات الظهارية وضعت سابقا^2،10 لخلية مفردة الكهربية³. استخدام تركيبات التربسين/يدتا بالإضافة إلى A كولاجيناز أو يدتا و DTT الهضم الأنزيمي الأساليب السابقة ويستخدم كثافة التدرجات إلى عزل على وجه التحديد والثقافة خنزير غينيا¹¹ والفئران خلايا الجماعة الأوروبية¹². في الآونة الأخيرة، كانت ولدت أورجانويدس المعوية وعطلت ميكانيكيا للتسجيلات الكهربية⁴. الثقافات باستخدام هذه الأساليب مناسبة تماما السيروتونين الإفراج عن التجارب، وتحليل RT-قبكر، وأنه، في حين أنها يمكن أن تستخدم للكهربية، تعتمد على نجاح الجيل أورجانويد مضيعة للوقت، وكثافة التدرجات تحديد خلايا الجماعة الأوروبية، الآثار المدمرة التي تخلفها الخلوية التربسين ويدتا. على النقيض من ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يحسن العلاج الأنزيمي والميكانيكية، ويحسن ظروف تثقيف، ويبسط إجراءات لإنتاج خلايا الجماعة الأوروبية واحد وصحية مناسبة للمعايير الخلوية العالية اللازمة للكهربية.

سوف تكون هذه الطريقة مفيدة للعلماء الذين يريدون العمل في خلايا الجماعة الأوروبية الأولية في الثقافات المختلطة بدلاً من الثقافات مخلدة وتريد التحقيق الكهربية للخلايا المفردة. ومع ذلك، قد يكون أقل ملاءمة لدراسة السكان الخلية التي تحتاج الثقافات الفرز أو طويلة الأجل تتطلب بقاء ح 72 الماضية.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) لينك. الجزء ثقافة الخلية الأولية من هذا البروتوكول يستند إلى أساليب نشرها مسبقاً التي يمكن الرجوع إليها لمزيد من التفاصيل¹⁰. يجب أن يوافق جميع الإجراءات التجريبية (إياكوك)، وجميع التجارب التي يجب أن يتم وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة.

1-إعداد الثقافة

1. وسائل الإعلام.
   1. تعد المفوضية الأوروبية خلية كاملة ثقافة وسائل الإعلام مع ارتفاع الجلوكوز تستكمل تعديل النسر المتوسطة (دميم [4500 مغ/لتر [دولبيكو ل) مع 5% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% لالجلوتامين و 1% البنسلين-ستربتوميسين (الجدول 1).
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   2. تصفية خلية الجماعة الأوروبية وسائل الإعلام ثقافة كاملة ووضع 25 مل من وسائل الإعلام في أنبوب 50 مل عند 37 درجة مئوية.
   3. تحضير الوسائط الهضم مع ارتفاع الجلوكوز [4,500 مغ/لتر [دميم وتستكمل مع 0.1% ألبومين المصل البقري (BSA) (الجدول 1).
   4. تصفية وسائل الإعلام الهضم ووضع أربعة مختبرين 10 مل من وسائل الإعلام في أنابيب منفصلة 50 مل واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. إنزيم.
   1. تزن 4 ملغ (صائم) أو 24 ملغم (للقولون) الحادي عشر كولاجيناز [إيه إيت زيرو زيرو وحدات/مغ] في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
      ملاحظة: كولاجيناز مستقرا عند-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
   2. ريسوسبيند كولاجيناز الكوة في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد مع Ca^{2 +} و Mg^{2 +}. دوامة الحل لدقة الجمع، ووضع على الجليد.
3. طلاء ألواح الثقافة.
   1. ذوبان الجليد 150 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية بين عشية وضحاها في ˚C 4 على الجليد.
   2. جعل حل مصفوفة خارج الخلية 5% w/v بخلط 100 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية المذابة مع 2 مل من المثلج الجلوكوز عالية خالية من المصل دميم.
      ملاحظة: المصفوفة خارج الخلية يتصلب في درجة حرارة الغرفة، ويجب التعامل مع الممصات مبردة مسبقاً، وأنابيب، ووسائل الإعلام حتى على استعداد للاطباق معطف.
   3. فورا معطف الزجاج الدائرة الداخلية للزجاج-أسفل الأطباق 35 ملم مع 250 ميليلتر من الحل المصفوفة خارج الخلية 5%. وستغطي هذه الوصفة الأطباق تصل إلى 8.
   4. وضع الأطباق أسفل الزجاج في حاضنة 37 درجة مئوية خلال خلية ثقافة العزلة الخطوات المتبقية. المصفوفة خارج الخلية يأخذ الحد ني ح 1 لتعيين ولكن يمكن المحتضنة لتصل إلى 2.5 س أثناء تنفيذ الخطوات الأخرى العزلة.
      ملاحظة: ختم إينكوبيشنز أطول من ح 3 يمكنك إنشاء تراكم المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تعرقل تشكيل أثناء الكهربية الخلية كلها.

2-الأنسجة العزلة

1. وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية، التضحية 3to 6 الأسبوع عمره ذكرا كان أو أنثى Tph1-الحراجية المعتمدة المعدلة وراثيا الماوس (جاكسون مختبر الأسهم: 028366)⁹ أو سلالة مراسل آخر.
   ملاحظة: نحن نستخدم جرعة قاتلة من ارتفاع مستويات ثاني أكسيد الكربون واضطراب عنق الرحم كوسيلة ثانوية للتأكد من الوفاة. كما ترى "اللجنة أفام" على القتل الرحيم التفكك عنق الرحم أسلوب القتل رحيم الأولية المسموح بها من الأفراد المدربين على استخدامها إذا هي أول مرة مخدراً الحيوانات.
2. دبوس الماوس euthanized الخروج على مرحلة تشريح رغوة البوليسترين استخدام الإبر ز 21. إزالة التلوث من البطن الماوس مع الإيثانول 70%.
3. سحب الماوس الجلد مشدود استخدام الملقط الصغير-تشريح (#5)، ومن ثم استخدام مقص جراحي حاد جعل شق عرضية في الجزء السفلي من البطن الماوس لفضح داخل تجويف. إجراء شق آخر عمودياً حتى البطن حتى يتم كشفها القفص الصدري.
4. استخدام الملقط الصغير-تشريح للانتقال الأعور إلى يسار الفأرة لتحقيق رؤية واضحة من القولون.
5. استخدام مقص التشريح الجزئي لقص الجزء الأكثر البعيدة من القولون (ولكن لا يزال الأقرب إلى المستقيم) وجعل ثانية قطع القاصي للمعدة. مكان الأمعاء المستخرجة إلى 100 × 15 ملم² طبق بتري مليئة 20 مل فوسفات المثلج مخزنة المالحة (PBS).
6. استخدم مسطرة صغيرة لقياس وقطع 10 سم أما منتصف القولون أو صائم. استخراج القولون بقياس خارج الجزء 10 سم من الأمعاء يقع بروكسيمالي إلى الخفض الأولى المتخذة أعلاه المستقيم. التعرف الصائم بطي الأمعاء الدقيقة أكملها في نصف وجعل شق أولى في منتصف الطريق وشق ثاني الدانية للأول 10 سم قطع.
   ملاحظة: الاستمرار في تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة العزلة على الجليد.
7. ملء المحاقن مل 6 مع برنامج تلفزيوني الباردة الجليد ووضع إبرة المحقن في التجويف الجزء المعوية المستخرجة. استخدام الملقط الصغير-تشريح المشبك وختم الأمعاء حول إبرة حقنه، وتدفق بلطف 10 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق التجويف شطف بعيداً من البراز.
8. عكس الأنسجة المعوية بلطف النسيج الملقط الصغير-التشريح عن طريق التجويف ومعسر جدار الأمعاء، وتراجعه الأنسجة الأقرب إلى طرف الملقط. كرر هذه العملية حتى يصبح الجزء من الداخل إلى الخارج مع التجويف تواجه إلى الخارج.
9. استخدام مقص التشريح الجزئي لقطع الجزء الأنسجة إلى قطع 1 سم.
10. استخدام الملقط الصغير-تشريح لنقل شرائح الأنسجة في كوب 50 مل مليئة 5 مل PBS العقيمة. استخدام مقص التشريح الجزئي فرم قطع الأنسجة إلى اتساق المسيل.
11. ضع الأنسجة مفروم و 15 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في أنبوب نظيف 50 مل بنقل ماصة. تريتوراتي 2 مرات مع ماصة نقل، والانتظار للأنسجة لتسوية وإزالة 15 مل من المادة طافية برنامج تلفزيوني، واستبدال مع برنامج تلفزيوني جديد. كرر هذه العملية ثلاث مرات حتى برنامج تلفزيوني واضح.
12. ضع أنبوب 50 مل مع قطع الأنسجة غسلها بالثلج وإحضار دلو الجليد إلى غطاء زراعة الأنسجة.

3-الانزيمية وميكانيكية الهضم

1. الهضم الأول
   1. من حمام الماء، استرداد واحدة من 50 مل الأنابيب التي تحتوي على 10 مل من الهضم المعالجون مسبقاً وسائل الإعلام. إلى أنبوب 50 مل، إضافة 250 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني كولاجيناز الحل وقطع الأنسجة المعوية مفروم.
      ملاحظة: الحرص على تجنب بما في ذلك برنامج تلفزيوني أي من الخطوات السابقة الغسيل.
   2. ضع 50 مل الأنبوب في حمام مائي لمدة 5 دقائق (القولون أو صائم) عند 37 درجة مئوية. هز الأنبوب 2 x في الدقيقة.
      ملاحظة: أن التوقيت الأمثل وكثافة الهضم الميكانيكية قد تختلف وسوف تحتاج إلى أن يحددها المستخدم. تحديد شروط الهضم الأمثل، يمكن عرضها قاسمة 10 ميليلتر من الخلايا بعد كل عملية الهضم. أثناء الهضم 1، ينبغي أن تتألف المادة طافية من كتل من الخلايا.
   3. تريتوراتي الأنسجة ببطء مرة واحدة مع ماصة 10 مل مصلية. بإيجاز اسمحوا الأنسجة تسوية قطعة، ثم استخدم ماصة نقل لإزالة كامل 10 مل من المادة طافية.
2. الثانية الهضم: كرر الخطوات 3.1.1 إلى 3.1.3. زيادة فترة الحضانة إلى 10 دقيقة إذا هضم القولون والحفاظ على الوقت حضانة في 5 دقائق صائم.
   ملاحظة: عند المراقبة، المادة طافية لا يزال يتكون من كتل كبيرة من الخلايا.
3. الهضم الثالث
   1. كرر الخطوة 3.1.1
   2. وضع أنبوب 50 مل في حمام مائي 37 ˚C لمدة 10 دقائق (القولون أو صائم الصغيرة). هز الأنبوب x 2-3 في الدقيقة في كثافة أعلى من ديجيسشنز 1 و 2.
   3. ببطء "الماصة؛" الأنسجة صعودا وهبوطاً مع ماصة 10 مل مصلية. السماح لقطع الأنسجة تسوية لفترة قصيرة.
      ملاحظة: يجب أن تتألف المادة طافية من مزيج من الخلايا المفردة وكتل صغيرة.
   4. استخدام ماصة نقل إلى وضع 10 مل من المادة طافية في أنبوب 15 مل جديدة وإضافة 2 مل من حرارة المفوضية الأوروبية خلية كاملة ثقافة الإعلام، وعكس مرة واحدة لخلط.
   5. تدور في 100 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم ماصة نقل لإزالة المادة طافية. استخدام ماصة نقل ريسوسبيند بيليه المتبقية في 2.5 مل من حرارة المفوضية الأوروبية خلية كاملة ثقافة الإعلام.
4. الهضم الرابع: كرر الخطوات 3.3.1 إلى 3.3.5. زيادة فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة للقولون وتظل في 10 دقيقة صائم.
   ملاحظة: المادة طافية الآن يتكون من خلايا مفردة.

4-خلية ثقافة

1. استخدام ماصة نقل للجمع بين تعليق الخلية التي تم جمعها من 3 ديجيسشنز و 4 في أنبوب 15 مل جديدة (الحجم الإجمالي 5 مل).
2. قم بإزالة قاسمة 10 ميليلتر من الخلايا لحساب مع هيموسيتوميتير وتدور تعليق خلية المتبقية في 100 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: تعليق خلية النهائي سيتألف من كتل صغيرة وخلايا مفردة.
3. إزالة المادة طافية مع ماصة نقل وريسوسبيند بيليه في المفوضية الأوروبية خلية الإعلام ثقافة كاملة في كثافة الخلايا 1,000,000 كل مل.
   ملاحظة: وحدة التخزين النهائي لتعليق خلية سيتوقف على عدد الخلايا النهائية. حساب الخلية النموذجية تتراوح بين 2,000,000 إلى 4,000,000.
4. إزالة الأطباق الثقافة أسفل زجاج مصقول من الحاضنة. استخدام ماصة P1000 لاستبدال المصفوفة خارج الخلية من كل طبق الثقافة مع 250 ميليلتر من تعليق خلية النهائي.
   ملاحظة: طلاء المصفوفة خارج الخلية يميل إلى التمسك بحواف الطبق أسفل الزجاج. ويجب إيلاء عناية خاصة لإزالة الطلاء من على طول الحافة لمنع تراكم هلام.
5. جعل حل أسهم للمانع روك Y-27632 في 1 مم. إضافة 2.5 ميليلتر من حل الأسهم لكل طبق أسفل الزجاج لتحقيق تركيز عامل من 10 ميكرون روك المانع في كل طبق.
   ملاحظة: هذه الخطوة هو أمر حاسم لبقاء الثقافات صائم بل هو اختياري للقولون.
6. ضع كل طبق الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ حاضنة ح 24 إلى 72 (الشكل 1).

5-إعداد خلايا الجماعة الأوروبية لكامل الخلية الكهربية

1. خط القطر الداخلي لمرحلة مجهر مع الشريطين 5 × 0.5 سم من الشمع الفيلم لإنشاء الدائري. جبل الطبق الثقافة خلية 35 ملم داخل الدائري (الشكل 2أ-ب).
2. شطف الحطام العائم على حد سواء، مثل فاتحة المصفوفة خارج الخلية أو الخلايا الميتة، والمصل وسائط الثقافة تماما بعيداً عن المفوضية الأوروبية ختم خلايا لمنع أي من عرقلة تشكيل بين خلية الجماعة الأوروبية والقطب. استخدام الخيارات الثلاثة التالية لتحقيق دقيق خلية الغسيل كافياً للكهربية:
   1. الخيار 1: تبادل الحلول أكثر كفاءة في غرفة طويلة أكثر من ذلك من تعميم للدائرة. حيث كانت مثقف خلايا الجماعة الأوروبية في الأطباق جولة 35 مم، إنشاء إدراج اهليلجية بلاستيك للطبق.
      1. إنشاء الإدراج عليها 3D الطباعة أو عن طريق أساليب الطحن التقليدية. وكان ناعم إدراج استخدمنا من بلاستيك اﻷكريليك مع الأبعاد التالية (في مم): القطر الخارجي، 34.5؛ الداخلية القطع الناقص، 20 × 9؛ الطول الخارجي، 10؛ الارتفاع الداخلي، 1.5؛ جسر سبان، 3 × 3؛ إزالة الجسر، 1.5؛ مدخل ومخرج، 4 × 4 كل.
      2. انخفاض الإدراج إلى الطبق الثقافة (الشكل 2أ-ب) وتأمينه إلى أعلى مرحلة مجهر مع قطعتين ز 0.15 إلى 0.2 من نمذجة الطين إلى 1.2 × 0.3 × 0.1 سم المستطيلات (الشكل 2أ-ج).
      3. مع ماصة نقل بلاستيك، إضافة ببطء حل خارج الخلية إلى جانب واحد من الطبق (مدخل) بينما يسفط من الجانب الآخر (منفذ).
   2. الخيار 2: دون إدراج بلاستيكية هندسيا، إضافة الحل خارج الخلية ماصة نقل من جانب واحد من الطبق (مدخل) بينما يسفط من الجانب المعاكس (منفذ). ببطء تدوير موقع ماصة نقل (مثلاً، ن إلى ه إلى ق) أثناء النسخ المتطابق موضع الإبرة تطلع على الجانب الآخر (مثلاً S إلى ث إلى N).
   3. الخيار 3: معطف المصفوفة خارج الخلية على كوفيرسليبس مستطيلة في خطوة 1.3.3.، وثقافة تعليق خلية في هذه كوفيرسليبس في الخطوة 4، 4. نقل هذا ساترة إلى حجرة مستطيلة مليئة بحل خارج الخلية، مع حذف الخطوة 5.1 وتخطي الخطوة 5، 3. شطف الدائرة مع الحل خارج الخلية من ماصة نقل بلاستيك، كما هو موضح في الخيار 1 (5.2.1.3).
3. إعادة إرفاق المرحلة مع ثقافة الخلية أعلاه المجهر المقلوب (الشكل 2د). احتضان ثقافة خلية الجماعة الأوروبية في الحل خارج الخلية خالية من المصل في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد 4 ساعات، يشطف ثقافة مرة أخرى مع الحل خارج الخلية كما هو موضح أعلاه. المضي قدما في الكهربية الخلية كلها.

6-كل خلية الكهربية لخلايا الجماعة الأوروبية من الثقافة الأولية

1. تحقيق ختم جيجا خلية كاملة
   1. سحب دستة أقطاب لمقاومة MΩ 1-5.
      الملاحظات: الماصات 1 – 2 MΩ المقاومة التي تسفر عن الأختام GΩ 10-100 أداء أفضل. النار التلميع نصائح القطب ليس من الضروري لتحقيق GΩ الأختام.
   2. معطف بالتساوي مخروط الآنف من جميع الماصات مع البوليمر. عقد ماصة الأفقي للأرض وعمودي على الجزء الأمامي من بندقية الحرارة. قم بتدوير الماصة حتى يصلب البوليمر ببطء.
   3. صب قاسمة للحل داخل الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. نقل 1.2 مل من هذا الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل عن طريق حقنه 1 مل. سحب آخر مل 0.7 من حل داخل الخلايا في المحاقن. تبديد الهواء من نهاية المحاقن. إرفاق جي 34 مرنة، إبرة 67 ملم للمحاقن، وطرد أي الهواء المتبقي من هذه الإبرة.
   4. التعرف Tph1-الحراجية المعتمدة + الخلية التي ليست على اتصال بأي خلية أخرى أو الحطام.
   5. ملء نصيحة قطب كهربائي مع الحل داخل الخلايا. الردم الماصة بحقنه. بعناية فليك الماصة مع ظفر تبديد واجهة فقاعة الهواء.
   6. مع المكبس وضعت مع 0.3 مل هواء، إرفاق حقنه 6 مل بالمأخذ حامل الأنابيب. جبل مسرى في الحامل.
      ملاحظة: الاتصال حقنه بالانبوب قبل مسرى يدخل حمام الحل للحفاظ على ضغط محايدة أو إيجابية داخل الحل داخل الخلايا قبل الختم.
   7. تحميل بروتوكول جهد-المشبك خطوتين يسجل التيارات تفعيل الحالة المستقرة بسلم جهد في الخطوة الأولى، ويسجل التيارات المتاحة بجهد واحد في الخطوة الثانية. قم بفتح اختبار الختم (5 أم في 50 كيلو هرتز).
   8. أقل الكهربائي في حمام الحل. مع ميكرومانيبولاتورس، المناورة القطب نصيحة في الطائرة مع الأفقي مباشرة ومن الخلية. طرد 0.3 مل الهواء من المحاقن.
   9. تحرك بلطف مسرى أفقياً على طول المحور السيني للمس الخلية. احترس نقرة تظهر في الخلية المفوضية الأوروبية و/أو زيادة في مقاومة الغشاء على اختبار الختم. إذا لزم الأمر، تعديل الكهربائي إلى أسفل على طول محور ع و/أو أفقياً على طول المحور س، لا تتحرك في الماضي خط الوسط للخلية.
   10. تطبيق 0.1-0.2 مل شفط في المحاقن 6 مل. اضغط المكبس مطرد حتى يتحقق 100 MΩ، ثم حرر مقبض من المكبس. الانتظار للخلية إلى جيجا-الختم. قطع المحاقن مع حركة أونسكريوينج بلطف.
       ملاحظة: إذا كان عدم ختم خلية تابعة للجماعة الأوروبية في البداية، قد يكون من الممكن إعادة ختم ذلك مع محاولة لاحقة. للقيام بذلك بلطف سحب مسرى بعيداً عن خلية تابعة للجماعة الأوروبية مع < 20 MΩ ختم المقاومة. التوجيه الكهربائي المستهلك ميكرومانيبولاتورس، أبحر حول الخلية المفوضية الأوروبية الهادفة إلى مصفوفة يدوياً واضحة بعيداً أو الحطام. ثم محاولة ختم الخلية الجماعة الأوروبية مع قطب طازجة.
2. خلية كله سجل الجهد عن طريق بوابة نا⁺ الحالية.
   1. إرفاق حقنه 3 مل وضعت مع 0.5 – 1.0 مل الهواء. تطبيق الاستفادة سريعة من الشفط (0.1 – 0.5 مل) في حقنه 3 مل. كرر حتى يتحقق الوصول إلى كل خلية، ثم افصل بلطف المحاقن.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف في البداية أداء حقنه وتغير تدريجيا مع الوقت والاستخدام، الممارسة مسبقاً مع المحاقن 3 مل (ختم النهاية مع سبابة) لضمان أن سوف نكص المكبس داخل 0.1 – 0.2 موقف مل من الانطلاق. إذا لم يكن كذلك، ثم تبادل المحاقن لواحدة جديدة.
   2. قم بتشغيل خلية كاملة السعة التعويض. ضبط المقاومة السعة وسلسلة. قم بتشغيل سلسلة المقاومة التعويض. مع الفارق في 60 مرض التصلب العصبي المتعدد، ضبط التعويض المقاومة سلسلة تنبأ ثم تصحيحها. إغلاق اختبار الختم.
   3. سجل متوسط 5 تشغيل كامل الخلية عن طريق بوابة الجهد الحالي Na⁺ (الشكل 3أ).
   4. يحيط علما بمعلمتين من بوابات الجهد الحالي Na⁺ بسرعة: الجهد في النافذة الحالية (الشكل 3ب، رموز حمراء، والتقاطع منحنيات الحالة المستقرة التنشيط والمنظمة) والحالية ذروة نا⁺ الكثافة.
      ملاحظة: خلايا الجماعة الأوروبية مع ذروة نا⁺ تيارات أكثر من السلطة الفلسطينية-50 في الجهد عادة وضع المشبك سيتوجه إلى إطلاق إمكانات انتزع في وضع المشبك الحالي. بالإضافة إلى ذلك، التيارات أكبر من السلطة الفلسطينية-200 في الجهد المشبك (الشكل 3أ) ثم عادة إطلاق إمكانات العمل تلقائياً في المشبك الحالية من إمكانات غشاء (الخط الأحمر، الشكل 3د) القرب من الجهد الإطار الحالي (رموز حمراء، الشكل 3ب).
3. وقد سجل آثار إمكانات العمل.
   1. إيقاف سلسلة المقاومة التعويض. إيقاف تشغيل الأوامر الخارجية. التبديل الوضع من الخامس-المشبك-المشبك. ضبط المكاسب. تحميل بروتوكولا المشبك الحالية عرضية. ضبط مقدار عقد الحالي إلى 0 السلطة الفلسطينية. قم بتشغيل الأوامر الخارجية.
      تنبيه: لا التبديل من الخامس-المشبك-المشبك (أو العكس بالعكس) دون إيقاف أول الأمر الخارجي.
   2. ملاحظة إمكانات غشاء يستريح. ضبط عقد الحالي الإدخال حيث أن إمكانات غشاء يقرأ أدناه الإطار الحالي (مثلاً، -80-100 mV). ضبط بروتوكول المشبك العرضية الحالي حيث يكون الفاصل خطوة الإدخال الحالي أقل من قيمة عقد الحالية (الشكل 3ج اقحم، خطوات السلطة الفلسطينية + 2-3 السلطة الفلسطينية تحتجز حاليا).
   3. وقد سجل آثار إمكانات العمل. ملاحظة أقل قدر من حقن لإطلاق النار قبالة بإمكانيات العمل الحالية (الشكل 3جيم، اكتساح 3 5، خطوة السلطة الفلسطينية + 4 من السلطة الفلسطينية-3 عقد = pA + 1).
4. سجل إمكانات العمل العفوي.
   1. إيقاف تشغيل الأوامر الخارجية. تحميل بروتوكول المشبك الحالي فجوة خالية (غير عرضية).
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الأمر الخارجي مرة أخرى حتى تم التحقق من مقدار الضغط الحالي في البروتوكول المشبك خالية من الفجوة الحالية تكون مناسبة للخلية.
   2. تغيير عقد الحالي أن يكون مقدار التيار حقن في الاجتياح الأخير في البروتوكول انتزع أنه لم يطلق النار بإمكانيات العمل (الشكل 3دمن الإدخال الحالي أثناء الاجتياح الثاني، خطوة السلطة الفلسطينية + 2 من السلطة الفلسطينية-3 عقد =-1 السلطة الفلسطينية).
   3. قم بتشغيل الأوامر الخارجية. الاختيار مزدوج أن توقع عقد الحالي يجلب غشاء المحتملة عن عتبة لإطلاق النار بإمكانات العمل. تعديل عقد الحالية إذا لزم الأمر. سجل النشاط العفوي.

النتائج

الثقافات:
إرفاق إلى الأطباق بعد 4 ساعات الابتدائي الخلايا الظهارية مورين من طراز Tph1-الحراجية المعتمدة المعدلة وراثيا وهي جاهزة للتجارب الفسيولوجية بين 24 إلى 72 ح. عندما قد لا تم تحسين ظروف الثقافة، وثقافة الخلايا الظهارية تتألف من كتل كبيرة، تعويم الحطام الخلو?...

Discussion

فهم تماما وظيفة الخلية المفوضية الأوروبية يتطلب أسلوب ثقافة الأولية عالية الجودة لإنشاء خلايا للكهربية الخلية كلها. الثقافات الأولية ظهارة غي تقليديا صعباً بسبب بقاء منخفضة. التخفيف من حدة هذه العوامل المؤثرة الأخرى، الأسلوب الحالي غلة الثقافات المفرد EC الخلايا من الأمعاء الصغيرة أو ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Glucose DMEM	Sigma	D6546	Store at 4˚ C for no longer than 1 month
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	F4135	Freeze in 25 mL aliquots  and store long term at -20˚ C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Penicillin/ Streptomycin	Sigma	P0781	Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A2153	Store at 4˚ C for long term storage
Collagenase XI	Sigma	C9407	Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg	Sigma	D8662	Store long term at   4˚ C
Y-27632 (Rock Inhibitor)	StemCell	72304	Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C
100x15mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
Matrigel, Growth Factor Reduced	Corning	354230	Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6-mL syringe with regular luer tip	Monoject
3-mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6