A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Riepilogo

Cellule enterocromaffini (EC) comprendono un piccolo sottoinsieme delle cellule epiteliali gastrointestinali. Dalle cellule EC sono elettricamente eccitabili e rilascio della serotonina, ancora difficoltà nella coltura e nell'identificazione di cellule EC hanno limitato gli studi fisiologici. Il metodo presentato qui stabilisce un modello di cultura primaria suscettibile di esame delle singole cellule EC di elettrofisiologia.

Abstract

Cellule enterocromaffini (EC) nell'epitelio gastrointestinale (GI) costituiscono la più grande sottopopolazione delle cellule enteroendocrine. Come le cellule sensoriali specializzate, cellule EC percepiscono stimoli luminal e convertono in eventi di rilascio di serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Tuttavia, l'elettrofisiologia di queste cellule è capito male perché sono difficili per cultura e per identificare. Il metodo presentato in questa carta contorni primaria CE, colture cellulari ottimizzati per elettrofisiologia singola cella. Questo protocollo utilizza un reporter transgenici ciano proteina fluorescente (CFP) per identificare le cellule di topo CE in colture miste di primarie, avanzando l'approccio per ottenere registrazioni di alta qualità di elettrofisiologia di tutta la cella in modalità di morsetto di tensione e di corrente.

Introduzione

L'epitelio gastrointestinale (GI) è una comunità variegata composta da diversi tipi di cellule. Le cellule enteroendocrine costituiscono circa 1% di tutte le cellule epiteliali e cellule enterocromaffini (EC) sono il più grande popolazione di cellule enteroendocrine¹. Studi recenti dimostrano che ce^3,4 cellule enteroendocrine² e sono elettricamente eccitabili. Siamo interessati a capire primario elettrofisiologia cellulare di CE. Così, lo scopo di questo studio era di stabilire colture primarie di cellule CE ottimizzati per elettrofisiologia tutta la cella.

Cella CE esistente linee che producono e secernono 5-HT (ad es., QGP-1⁵, BON⁶, KRJ-1⁷) e sono state usate per esaminare l'elettrofisiologia^5,8 vengono tipicamente generate da immortalato neoplastici tessuti. Mentre le informazioni acquisite da queste linee cellulari sono prezioso^5,8, studi di elettrofisiologia cellulare primaria sono necessari per comprendere correttamente la fisiologia cellulare CE. L'elettrofisiologia di cellule primarie CE richiede l'isolamento e coltura di singole cellule epiteliali, che è stato limitato dalla bassa redditività delle culture epiteliali.

Il metodo di cultura presentato in questo studio si basa sui topi transgenici con fluorescente identificati dalle cellule EC, come Tph1-CFP⁹, utilizzato in questo studio. Il metodo ottimizza primaria misto epiteliali colture sviluppate in precedenza^2,10 per singola cella elettrofisiologia³. Metodi precedenti utilizzate combinazioni di tripsina/EDTA plus A collagenosi o EDTA e DTT per digestione enzimatica e utilizzato gradienti di densità per isolare in modo specifico e cultura-cavia¹¹ e ratto CE cellule¹². Più recentemente, organoids intestinale sono stati generati e meccanicamente interrotta per registrazioni elettrofisiologiche⁴. Culture, usando questi metodi sono adatte per esperimenti, analisi di RT-qPCR di rilascio di serotonina e, mentre potrebbero essere usati per elettrofisiologia, fanno affidamento sul successo della generazione organoid che richiede tempo, gradienti di densità per identificare cellule EC e la effetti cellulari e dirompenti di tripsina ed EDTA. Al contrario, il protocollo descritto qui migliora trattamenti enzimatici e meccanici, ottimizza le condizioni di coltura e semplifica le procedure per produrre cellule EC di singole e sane adatte per gli elevati standard cellulari necessari per elettrofisiologia.

Questo metodo sarà utile per gli scienziati che vogliono lavorare su cellule primarie di CE in colture miste anziché culture immortalizzate e vuole indagare l'elettrofisiologia delle singole cellule. Tuttavia, può rivelarsi meno appropriato per lo studio di popolazioni di cellule che hanno bisogno di colture di ordinamento o a lungo termine che richiedono sopravvivenza ultime 72 ore.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Mayo Clinic. La parte di cultura cellula primaria di questo protocollo è basata su metodi pubblicati in precedenza che è possibile fare riferimento per ulteriori dettagli¹⁰. Tutte le procedure sperimentali devono essere approvate da (IACUC), e tutti gli esperimenti devono essere eseguiti conformemente alle norme e linee guida pertinenti.

1. preparazione cultura

1. Media.
   1. Preparare terreni di coltura completo cella CE con alto glucosio per volta Eagle Medium (DMEM di [4500mg/L] quotazioni Dulbecco) completati con 5% di siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina e 1% penicillina-streptomicina (tabella 1).
      Nota: Media può essere memorizzato a 4 ° C fino ad un mese.
   2. Filtrare i terreni di coltura CE completo cella e inserire 25 mL di media in un tubo da 50 mL a 37 ° C.
   3. Preparare il supporto di digestione con alto glucosio [4.500 mg/L] DMEM completate con 0,1% albumina di siero bovino (BSA) (tabella 1).
   4. Filtrare i media di digestione e inserire quattro aliquote di 10 mL di media in provette separate da 50 mL e incubare a bagnomaria a 37 ° C.
      Nota: Media può essere memorizzato a 4 ° C fino ad un mese.
2. Enzima.
   1. Pesare 4 mg (digiuno) o 24 mg (due punti) di collagenasi XI [≥ 800 unità/mg] in una microcentrifuga da 1,5 mL.
      Nota: La collagenasi sono stabile a-20 ° C fino ad un anno.
   2. Risospendere l'aliquota in 1 mL di PBS freddo ghiaccio con Ca^{2 +} e Mg^{2 +}collagenasi. Vortice la soluzione per combinare accuratamente e metterli su ghiaccio.
3. Piastre di coltura del rivestimento.
   1. Scongelare i 150 µ l di matrice extracellulare durante la notte a 4 ° c sul ghiaccio.
   2. Fare una soluzione di 5% w/v matrice extracellulare mescolando 100 µ l di matrice extracellulare scongelata con 2 mL di DMEM privo di siero alto-glucosio ghiacciato.
      Nota: Matrice extracellulare si solidifica a temperatura ambiente e deve essere maneggiata con pipette pre-refrigerati, tubi e media fino al momento di cappotto piatti.
   3. Immediatamente cappotto il cerchio interno di vetro di piatti 35 mm con fondo di vetro con 250 µ l di soluzione di matrice extracellulare al 5%. Questa ricetta coprirà fino a 8 piatti.
   4. Posizionare i piatti con fondo di vetro in un incubatore a 37 ° C durante la procedura di isolamento di cultura cellulare. La matrice extracellulare richiede un minimo di 1 h per impostare, ma possono essere incubate per fino a 2,5 h durante l'esecuzione di altre procedure di isolamento.
      Nota: Incubazioni più di 3 h può creare un accumulo di matrice extracellulare che potrebbe ostacolare la guarnizione formazione durante elettrofisiologia tutta la cella.

2. tessuto isolamento

1. Secondo orientamenti etici, sacrificio un 3per 6 settimana-vecchio maschio o femmina Tph1-CFP transgenico del topo (The Jackson Laboratory Stock: 028366)⁹ o un altro ceppo di reporter.
   Nota: Utilizziamo una dose fatale di innalzamento del livello di anidride carbonica e una dislocazione cervicale come un secondario significa garantire la morte. Il Comitato di AVAM sull'eutanasia ritiene dislocazione cervicale un metodo consentito eutanasia primario da individui addestrati nel suo utilizzo, se gli animali sono prima sedati.
2. Appuntare il mouse eutanasizzato fuori su un palco di dissezione di polistirene espanso usando gli aghi 21G. Decontaminare l'addome del mouse con etanolo al 70%.
3. Tirare la pelle del topo tesa utilizzando micro-dissezione forcipe (#5) e quindi utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione trasversale nella parte inferiore dell'addome del mouse per esporre la cavità intraperitoneale. Fare un'altra incisione verticalmente fino all'addome fino a quando la gabbia toracica è esposto.
4. Utilizzare il forcipe micro-dissezione per spostare l'intestino cieco a sinistra del mouse per raggiungere una visione chiara del colon.
5. Utilizzare le micro-dissezione Forbici per tagliare la porzione più distale del colon (ma ancora prossimale al retto) e fare un secondo taglio distale allo stomaco. Luogo pieno di intestini estratti in un 100 x 15 mm² piastra di Petri con 20 mL di fosfato ghiacciato tampone salino (PBS).
6. Utilizzare un piccolo righello per misurare e tagliare 10 cm di una metà del colon o digiuno. Estratto del colon misurando il segmento di 10 centimetri di intestino situato proximally al primo taglio preso sopra il retto. Identificare il digiuno piegando l'intero piccolo intestino a metà e facendo una prima incisione a metà del percorso e una seconda incisione 10 cm prossimale al primo taglio.
   Nota: Continuare a eseguire tutte le operazioni di isolamento successivo sul ghiaccio.
7. Riempire una siringa da 6 mL con PBS freddo ghiaccio e inserire l'ago della siringa nel lumen del segmento intestinale Estratto. Utilizzare il forcipe micro-dissezione per bloccare e sigillare gli intestini intorno all'ago di siringa e lavare delicatamente 10 mL di PBS attraverso il lume di sciacquare via materia fecale.
8. Invertire il tessuto intestinale dolcemente il forcipe micro-dissezione attraverso il lume di tessitura, pizzicando una parete intestinale, e ritraendo il tessuto prossimale fino alla punta delle pinze. Ripetere questo processo fino a quando il segmento è dentro-fuori con il lume verso l'esterno.
9. Utilizzare micro-dissezione Forbici per tagliare il segmento di tessuto in pezzi di 1 cm.
10. Utilizzare pinze per micro-dissezione per trasferire i segmenti di tessuto in un becher da 50 mL riempita con 5 mL di PBS sterile. Utilizzare le forbici micro-dissezione per tritare i pezzi di tessuto per ottenere una consistenza liquefatto.
11. Posizionare il tessuto macinata e 15 mL di PBS freddo ghiaccio in una provetta pulita 50 mL di pipetta. Triturare 2 volte con la pipetta, attendere che il tessuto per stabilirsi, 15 mL del surnatante PBS di rimuovere e sostituire con PBS fresco. Ripetere questo processo tre volte il PBS è chiaro.
12. Posizionare il tubo da 50 mL con pezzi di tessuto lavato sul ghiaccio e portare il secchiello del ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto.

3. enzimatica e meccanica la digestione

1. Prima digestione
   1. Dal bagno di acqua, recuperare uno dei tubi 50 mL contenente 10 mL di media di digestione pre-riscaldato. Per il tubo da 50 mL, aggiungere 250 µ l della soluzione di PBS collagenosi e pezzi di tessuto intestinale macinate.
      Nota: fare attenzione a evitare di includere qualsiasi PBS da precedenti passaggi del lavaggio.
   2. Posizionare il tubo da 50 mL in un bagno d'acqua per 5 minuti (colon o digiuno) a 37 ° C. Agitare il tubo 2 x / min.
      Nota: Il timing ottimale e l'intensità di digestione meccanica possono variare e dovrà essere determinata dall'utente. Per determinare le condizioni di una digestione ottimale, un'aliquota di 10 µ l di cellule può essere visualizzata dopo ogni digestione. Durante la digestione 1, il surnatante dovrebbe consistere di grumi di cellule.
   3. Lentamente e triturare il tessuto una volta con una pipetta sierologica di 10 mL. Brevemente lasciate il tessuto pezzi stabilirsi, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere l'intero 10 mL di surnatante.
2. Secondo la digestione: ripetere i passaggi da 3.1.1 a 3.1.3. Aumentare il tempo di incubazione di 10 min se digestione del colon e mantenere il tempo di incubazione a 5min per digiuno.
   Nota: Al momento dell'osservazione, il surnatante ancora dovrebbe consistere di grandi ciuffi di cellule.
3. Terza digestione
   1. Ripetere il punto 3.1.1
   2. Posizionare il tubo da 50 mL in bagnomaria a 37 ˚ c per 10 min (colon o piccolo digiuno). Agitare la provetta 2-3 volte al minuto a un'intensità più elevata rispetto a digestioni 1 e 2.
   3. Lentamente di dispensare il tessuto su e giù con una pipetta sierologica di 10 mL. Consentire i pezzi di tessuto di stabilirsi per un breve periodo.
      Nota: Il surnatante dovrebbe consistere di una combinazione di singole cellule e piccoli ciuffi.
   4. Utilizzare una pipetta di trasferimento per inserire 10 mL del surnatante in una nuova provetta da 15 mL, aggiungere 2 mL di riscaldato CE cella completa cultura media e invertire una volta per mescolare.
   5. Spin a 100 x g per 5 min a temperatura ambiente, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere il surnatante. Utilizzare una pipetta di trasferimento per risospendere in 2,5 mL di terreni di coltura riscaldato CE cella completo.
4. Quarta digestione: ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.5. Aumentare il tempo di incubazione di 15 min per colon e rimangono a 10 min per il digiuno.
   Nota: Il surnatante ora dovrebbe consistere di singole cellule.

4. coltura cellulare

1. Utilizzare una pipetta di trasferimento per combinare le sospensioni cellulari raccolte da digestioni 3 e 4 in una nuova provetta da 15 mL (volume totale di 5 mL).
2. Rimuovere un'aliquota di 10 µ l di cellule di contare con un emocitometro e filare la sospensione delle cellule rimanenti a 100 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   Nota: La sospensione cellulare finale sarà composto di piccoli ciuffi e cellule singole.
3. Rimuovere il surnatante con una pipetta di trasferimento e risospendere il pellet in CE cella completa di coltura ad una densità di 1.000.000 cellule per mL.
   Nota: Il volume finale della sospensione cellulare dipenderà il conteggio finale delle cellule. Tipica cellula conta vanno da 2.000.000 a 4.000.000.
4. Togliere i piatti di cultura con fondo di vetro rivestito dall'incubatrice. Utilizzare una pipetta P1000 per sostituire la matrice extracellulare da ogni piatto di cultura con 250 µ l di sospensione cellulare finale.
   Nota: Il rivestimento di matrice extracellulare tende ad attaccarsi ai bordi del piatto con fondo di vetro. Deve prestare particolare attenzione a rimuovere il rivestimento dal lungo il bordo per prevenire l'accumulo di gel.
5. Preparare una soluzione stock di inibitore di ROCK Y-27632 a 1 mM. Aggiungere 2,5 µ l di soluzione di riserva ad ogni piatto fondo di vetro per ottenere una concentrazione di lavoro dell'inibitore ROCK 10 µM in ogni piatto.
   Nota: Questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza delle culture di digiuno ma è facoltativo per i due punti.
6. Posizionare ogni piatto di cultura in incubatore 37 ° C e 5% CO₂ per 24-72 h (Figura 1).

5. preparazione di cellule EC per tutta la cella elettrofisiologia

1. Linea il diametro interno della fase microscopio con due strisce di 5 x 0,5 cm di pellicola di cera per creare un o-ring. Montare la piastra di coltura cellulare di 35 mm all'interno dell'o-ring (Figura 2A-B).
2. Risciacquare entrambi detriti galleggianti, matrice extracellulare non collegata o le cellule morte e siero di terreni di coltura completamente lontano CE cellule per impedire o da ostacolare guarnizione formazione tra la cella di CE e l'elettrodo. Uso delle tre opzioni seguenti per raggiungere cella completa di lavaggio sufficiente per elettrofisiologia:
   1. Opzione 1: Soluzione exchange è più efficiente in un alloggiamento lungo piu ' di una circolare dell'alloggiamento. Poiché le cellule EC sono state coltivate in piatti rotondi 35 mm, creare un inserto ellittico in plastica per il piatto.
      1. Creare l'inserto dalla stampa 3D o da metodi di fresatura tradizionale. L'inserto che abbiamo usato è stato lavorato da plastica acrilica con le seguenti dimensioni (in mm): diametro esterno, 34.5; ellisse interna, 20 x 9; Altezza esterna, 10; Altezza interna, 1,5; portata di ponte, 3 x 3; gioco del ponte, 1,5; entrata ed uscita, 4 x 4.
      2. Abbassare l'inserto nella piastra di coltura (Figura 2A-B) e fissarlo alla parte superiore del tavolino del microscopio con due pezzi di 0,15-0,2 g di modellazione argilla pressata 1.2 x 0.3 x rettangoli di 0,1 cm (Figura 2A-C).
      3. Con una pipetta di trasferimento in plastica, aggiungere lentamente soluzione extracellulare su un lato del piatto (in entrata) mentre ad aspirazione dal lato opposto (outlet).
   2. Opzione 2: Senza un inserto in plastica ingegnerizzato, aggiungere soluzione extracellulare di pipette di trasferimento da un lato del piatto (in entrata) mentre ad aspirazione dal lato opposto (outlet). Ruotare lentamente la posizione della pipetta di trasferimento (ad es., N e a S) mentre il mirroring il posizionamento dell'ago aspirazione sul lato opposto (ad es., S a W a N).
   3. Opzione 3: Cappotto tabella extracellulare su vetrini coprioggetto rettangolari al punto 1.3.3. e la sospensione cellulare su questi vetrini coprioggetti al punto 4.4 della coltura. Trasferire questo vetrino coprioggetto un vano rettangolare riempito con soluzione extracellulare, saltando il punto 5.1 e saltando il punto 5.3. Sciacquate la vaschetta con la soluzione extracellulare di una pipetta di trasferimento in plastica, come descritto nell'opzione 1 (5.2.1.3).
3. Fissare nuovamente il palco con la coltura delle cellule sopra il microscopio invertito (Figura 2D). Incubare la coltura delle cellule EC nella soluzione extracellulare privo di siero a temperatura ambiente.
4. Dopo 4 ore, sciacquare la cultura nuovo con soluzione extracellulare come descritto sopra. Procedere con elettrofisiologia tutta la cella.

6. tutta la cella elettrofisiologia di cellule EC da coltura primaria

1. Raggiungimento di una cellula intera Giga-seal
   1. Tirare una dozzina gli elettrodi ad una resistenza di 1 – 5 MΩ.
      Note: Pipette di resistenza di 1 – 2 MΩ che producono 10-100 GΩ guarnizioni le migliori prestazioni. Fuoco le punte dell'elettrodo di lucidatura non è necessario realizzare guarnizioni GΩ.
   2. Cappotto in modo uniforme il cono di naso di tutte le pipette con polimero. Tenere la pipetta in posizione orizzontale per terra e perpendicolare alla parte anteriore di una pistola di calore. Ruotare lentamente la pipetta fino a quando il polimero si indurisce.
   3. Versare una parte aliquota della soluzione intracellulare in una provetta conica da 15 mL. Trasferimento 1,2 mL di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL tramite siringa 1 mL. Un altro 0,7 mL di soluzione intracellulare aspirare con la siringa. Dissipare l'aria dall'estremità della siringa. Collegare un flessibile G 34 67 mm ago alla siringa e scovare eventuali residui di aria da questo ago.
   4. Identificare un Tph1-CFP + cella che non è a contatto con altre cellule o detriti.
   5. Riempire la punta dell'elettrodo con la soluzione intracellulare. Recupero informazioni la pipetta dalla siringa. Scorri attentamente la pipetta con un'unghia per dissipare l'interfaccia di bolla di aria.
   6. Con lo stantuffo redatto con 0,3 mL di aria, collegare una siringa da mL 6 all'uscita del titolare della tubazione. Montare l'elettrodo nel supporto.
      Nota: Collegare la siringa al tubo prima che l'elettrodo entri la soluzione del bagno per mantenere la pressione neutra o positiva all'interno della soluzione intracellulare prima della sigillatura.
   7. Caricare un protocollo di tensione-morsetto in due fasi che registra correnti d'attivazione allo steady-state di una scala di tensione sul primo gradino e registra le correnti disponibili da un'unica tensione sul secondo gradino. Aprire il test di tenuta (5 mV 50 kHz).
   8. Abbassare l'elettrodo nella soluzione di bagno. Con i micromanipolatori, manovrare l'elettrodo punta in piano con e orizzontale direttamente dalla cella. Espellere i 0,3 mL di aria dalla siringa.
   9. Spostare delicatamente l'elettrodo orizzontalmente lungo l'asse x per toccare la cella. Guarda per una fossetta a comparire sulla cella CE e/o un aumento nella resistenza di membrana sulla prova di tenuta. Se necessario, regolare di nuovo l'elettrodo giù lungo l'asse z e/o orizzontalmente lungo l'asse x, non si muove oltre la linea mediana della cella.
   10. Applicare 0,1 – 0,2 aspirazione mL sulla siringa 6 mL. Tenere premuto lo stantuffo costante fino a 100 MΩ è raggiunto, quindi rilasciare la presa dallo stantuffo. Attendere che la cella a giga-seal. Staccare delicatamente la siringa con un movimento di svitamento.
       Nota: Se una cella CE non sigillare inizialmente, potrebbe essere possibile sigillare nuovamente con un tentativo successivo. Per effettuare questa operazione, tirare delicatamente l'elettrodo esterno una cella CE con < 20 resistenza di tenuta MΩ. Sterzo l'elettrodo esaurito con i micromanipolatori, circumnavigare la cella CE mirata a matrice manualmente chiaro via o detriti. Quindi, il tentativo di sigillare la cella CE con un elettrodo di fresco.
2. Record a cellula intera tensione-gated Na⁺ corrente.
   1. Collegare una siringa da 3 mL redatta con 0,5 – 1,0 aria mL. Applicare un colpetto rapido di aspirazione (0,1 – 0,5 mL) su una siringa da 3 mL. Ripetere finché non si ottiene accesso a cellula intera, quindi staccare delicatamente la siringa.
      Nota: poiché le prestazioni di una siringa possono variare inizialmente e cambiano gradualmente con il tempo e l'uso, pratica in anticipo con la siringa da 3 mL (sigillando l'estremità con un dito indice) per assicurarsi che lo stantuffo sarà rinculo entro 0,1 – 0,2 mL di iniziare la sua posizione. Se così non fosse, poi scambiare la siringa per uno nuovo.
   2. Attivare la compensazione di capacitanza a cellula intera. Regolare la serie della capacità e della resistenza. Attivare la compensazione della resistenza serie. Ritardo impostato a 60 ms, regolare la compensazione serie resistenza previsto poi corretto. Chiudere la prova di tenuta.
   3. Registrare una media di 5 piste di corrente di cellule intere tensione-gated Na⁺ (Figura 3A).
   4. Rapidamente prendere nota di due parametri di corrente tensione-gated di Na⁺ : la tensione alla finestra corrente (Figura 3B, simboli rossi, l'intersezione delle curve di attivazione e inattivazione allo steady-state) e la corrente di picco Na⁺ densità.
      Nota: CE le cellule con correnti di picco Na⁺ più di pA-50 in modalità di tensione morsetto comunemente andrà a fuoco potenziali hanno suscitati in modalità corrente del morsetto. Inoltre, correnti superiori a pA-200 nel morsetto di tensione (Figura 3A) allora solitamente fuoco potenziali di azione spontaneamente a pinza amperometrica da potenziali di membrana (linea rossa, Figura 3D) vicino la tensione della finestra corrente (simboli rossi, Figura 3B).
3. Record ha suscitato i potenziali di azione.
   1. Disattivare la compensazione della resistenza serie. Disattivare il comando esterno. Cambiare la modalità da V-clamp-morsetto. Regolare il guadagno. Caricare un protocollo attuale episodica di morsetto. Regolare la quantità di corrente a 0 di mantenimento PA. Attivare il comando esterno.
      Attenzione: Non accendere da V-clamp-Morsetto (o viceversa) senza prima spegnere il comando esterno.
   2. Nota il potenziale di membrana di riposo. Regolare la corrente di mantenimento input in modo che il potenziale di membrana legge sotto la finestra corrente (ad es., -80 a -100 mV). Regolare il protocollo corrente episodica di morsetto in modo che l'intervallo di passaggio della corrente di ingresso è inferiore al valore di corrente di mantenimento (inserto diC nella figura 3, + 2 passaggi di pA PA-3 corrente di tenuta).
   3. Record ha suscitato i potenziali di azione. Si noti la quantità minima di corrente iniettata per fuoco spento un potenziale di azione (Figura 3C, sweep 3 di 5, un passo + 4 pA da pA-3 holding = pA + 1).
4. Registrare i potenziali di azione spontanei.
   1. Disattivare il comando esterno. Caricare un protocollo morsetto attuale gap-free (non episodico).
      Nota: Non accendere il comando esterno indietro fino a quando la quantità di detenzione corrente nel protocollo morsetto privo di divario attuale è stata verificata per essere adatto per la cella.
   2. Modificare la corrente di essere la quantità di corrente iniettata nell'ultima operazione nel protocollo hanno suscitato che non è stato generato un potenziale di azione di mantenimento (Figura 3D, l'ingresso di corrente durante la seconda sweep, un passo + 2 pA da pA-3 holding =-1 pA).
   3. Attivare il comando esterno. Controllare che la corrente di mantenimento previsto porta la membrana potenziale sotto la soglia di un potenziale di azione del fuoco. Se necessario, regolare la corrente di mantenimento. Registrare l'attività spontanea.

Risultati

Culture:
Cellule epiteliali murine primarie effettuate in un modello transgenico Tph1-CFP allegare ai piatti dopo 4 ore e sono pronte per esperimenti fisiologici tra 24-72 h. Quando le condizioni di coltura non avevano state ottimizzate, la coltura delle cellule epiteliali ha consistito di grandi ciuffi, galleggiante di detriti cellulari, membrane danneggiate e segnale debole di PCP nelle cellule CE (Figura 1A). Culture ch...

Discussione

Comprendere appieno la funzione delle cellule CE richiede un metodo di coltura primaria di alta qualità per generare cellule per elettrofisiologia tutta la cella. Colture primarie di epitelio GI erano stata tradizionalmente difficile dovuto la bassa sopravvivenza. Alleviare questo fattore di confusione, il presente metodo produce colture di cellule EC singolare dall'intestino sia piccolo o grande che sono in grado di sopravvivere per diversi giorni.

Abbiamo trovato che erano critici per migli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Glucose DMEM	Sigma	D6546	Store at 4˚ C for no longer than 1 month
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	F4135	Freeze in 25 mL aliquots  and store long term at -20˚ C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Penicillin/ Streptomycin	Sigma	P0781	Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A2153	Store at 4˚ C for long term storage
Collagenase XI	Sigma	C9407	Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg	Sigma	D8662	Store long term at   4˚ C
Y-27632 (Rock Inhibitor)	StemCell	72304	Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C
100x15mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
Matrigel, Growth Factor Reduced	Corning	354230	Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6-mL syringe with regular luer tip	Monoject
3-mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6