一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

要約

(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC 細胞の検査を受けやすいを確立します。

要約

腸クロム親和性 (EC) 胃腸の (GI) 粘膜上皮細胞 enteroendocrine 細胞の最も大きい subpopulation を構成します。専門にされた感覚的な細胞として EC 細胞内腔刺激を感知し、セロトニン (5-hyroxytryptamine、5 HT) リリース イベントに変換します。ただし、文化と特定することは困難であるために、これらの細胞の電気生理学はよくわかっていません。この論文概要主な EC 細胞培養の手法は、単一細胞の電気生理学の最適化されています。このプロトコルでは、電圧と電流クランプ モードでセル全体を電気生理学の高品質の録音を取得するアプローチを進める混合の初代培養マウス EC 細胞を識別するために遺伝子組換えシアン蛍光蛋白質 (CFP) 記者を利用しています。

概要

胃腸の (GI) 上皮は、いくつかの細胞の種類から成る多様なコミュニティです。Enteroendocrine 細胞を構成するほぼすべての上皮細胞の 1%、(EC) クロム親和細胞 enteroendocrine 細胞人口¹の最大。最近の研究では、enteroendocrine²と EC^3,4細胞が電気的興奮を示します。主な EC 細胞電気生理学を理解することに興味を持っております。したがって、本研究の目的は、全細胞の電気生理学のために最適化されたプライマリ EC 細胞培養を確立するだった。

生産 5-HT (例えばQGP 1⁵BON⁶:KRJ 1⁷) を分泌すると電気生理学^5,8を調べるに使用されている行は、通常から生成されます既存の EC 細胞不死化腫瘍組織。これらの細胞から得られる情報は貴重な^5,8一次電池電気生理学の研究が EC 細胞生理学を正しく理解する必要です。一次の EC 細胞の電気生理学には、分離と上皮文化の低い生存率によって制限されており、単一の上皮細胞の培養が必要です。

本論文で示した培養法は、Tph1 CFP⁹、この研究で使用されるのような蛍光に分類された EC 細胞を持つトランスジェニック マウスに依存します。メソッドの最適化混合プライマリ上皮文化を開発した単一細胞の電気生理学^32,10 。以前の方法酵素消化のトリプシン EDTA/プラス コラゲナーゼ A または EDTA と DTT の組み合わせ、特に特定し文化¹¹モルモットおよびラット EC 細胞¹²密度勾配を使用します。もっと最近、腸 organoids が生成され、機械的に電気生理学的記録⁴中断します。セロトニン Rt-qpcr 分析実験をリリースし、生理、使用できる時間がかかる organoid 世代、EC 細胞を識別するために密度勾配の成功に依存して、これらのメソッドを使用してカルチャが適していて、トリプシンと EDTA の細胞の破壊的な効果。対照的に、ここで説明されているプロトコルは、酵素、力学的処理を向上し、培養条件を最適化、シングルと健全な EC 細胞電気生理学に必要な高い携帯電話規格に適合を生成するための手順を合理化します。

このメソッドは、プライマリ EC 細胞不死化文化よりもむしろ混合文化の仕事をしたいし、単一細胞の電気生理学を調査する科学者の役に立つでしょう。ただし、並べ替えまたは長期的な文化サバイバル過去 72 時間を必要とする必要がありますセル人口の勉強はあまり適して証明するかもしれない。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) メイヨー クリニックのによって承認されています。このプロトコルの一次電池文化の一部は、さらに詳細¹⁰参照できる以前に公開された方法に基づいています。実験のすべてのプロシージャは (IACUC)、によって承認されなければならない、すべての実験は関連するガイドラインと規則に従って行う必要があります。

1. 文化準備

1. メディア。
   1. EC 細胞の完全な培養基の準備高グルコースと [4500 mg/L] ダルベッコの変更イーグル培地 (DMEM) 補足 5% ウシ胎児血清 (FBS)、1 %l-グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (表 1)。
      注: メディアが 4 ° C で最大 1 ヶ月間保存できます。
   2. EC 細胞の完全な文化メディアをフィルター処理し、37 ° C で 50 mL のチューブに 25 mL の培
   3. 高グルコース [4,500 mg/L] 0.1 %dmem で消化メディアを準備ウシ血清アルブミン (BSA) (表 1)。
   4. 濾紙の消化と別の 50 mL チューブにメディアの 4 つの 10 mL の因数を置き、37 ° C の水浴で孵化させなさい。
      注: メディアが 4 ° C で最大 1 ヶ月間保存できます。
2. 酵素。
   1. 4 mg (腸) のうち、24 mg (コロン) のコラゲナーゼ XI [≥800 単位/mg] 1.5 mL 遠心チューブに重量を量る。
      注: コラゲナーゼは 1 年間、-20 ° C で安定しました。
   2. 1 ml の氷冷 PBS Ca^{2 +}と Mg^{2 +}の因数のコラゲナーゼを再懸濁します。渦徹底的に結合、および氷の場所を解決します。
3. コーティング培養皿。
   1. 氷の上の 4 ° C で一晩細胞外マトリックスの 150 μ L を解凍します。
   2. 2 ml の冷たい無血清高グルコース DMEM の解凍の細胞外マトリックスの 100 μ L を混合することによって 5 %w/v 細胞外マトリックス ソリューションを作る。
      注: 細胞外マトリックスは室温で凝固し、コート料理する準備ができるまで中古冷蔵ピペット ・ チューブ ・ メディアで処理する必要があります。
   3. すぐにコートはガラス底 35 mm 料理のガラス内側の円 5% 細胞外マトリックス ソリューションの 250 μ L で。このレシピは 8品までをカバーします。
   4. 細胞培養分離手順中に 37 ° C の定温器にガラス底培養皿を置きます。細胞外マトリックスを設定する 1 時間の最小値を取る他の分離手順を実行しながら 2.5 h まで培養することができますが。
      注: 孵化 3 h 妨げる可能性が細胞外マトリックスの集結を作成することがより長くシール全細胞電気生理中に形成。

2. 組織分離

1. 倫理的なガイドラインに従って犠牲、3to 6 週齢雄または雌 Tph1 CFP トランスジェニック マウス (のジャクソン研究所株式: 028366)⁹または別のレポーターの歪み。
   注: 我々 は、二酸化炭素と頚部転位の上昇のレベルの致命的な線量を使用してセカンダリの死を確保する手段として。AVAM 委員会は、安楽死も頚部転位に動物はまず鎮静されている場合、その使用の訓練を受けて個人によって許容されるプライマリ安楽死法を考慮します。
2. 21 G の針を使用して発泡スチロール解離ステージ上を euthanized マウスを固定します。70% エタノールでマウスの腹部を消毒します。
3. マイクロ剥離鉗子 (#5) を使用するピンと張ったマウス皮膚を引っ張るし、腹腔を公開するマウスの腹部の下部横切開する手術用はさみを使用します。胸郭が公開されるまでは、腹部を垂直方向の別の切開を確認します。
4. マイクロ剥離鉗子を使用すると、盲腸をコロンの明確なビューを達成するためにマウスの左に移動します。
5. (しかし、まだ直腸に近位) コロンの最も遠位部分をカットし、2 番目の胃に遠位カットするミクロ解剖はさみを使用します。100 × 15 mm²シャーレに抽出された腸の溢れる冷たいリン酸 20 mL 緩衝生理食塩水 (PBS)。
6. 小さな定規を使用して測定し、結腸や空腸半ばいずれかの 10 cm をカットします。直腸の上撮影最初のカットに近位に位置する腸の 10 cm セグメントを測定することによって大腸を抽出します。小腸全体を半分に折ると、中間点での最初の切開とカット目切開 10 cm 最初に近位空腸を識別します。
   注: 引き続き氷の上それに続く分離のすべての手順を実行します。
7. 氷冷 PBS で 6 mL シリンジを入力し、抽出した腸管の内腔に注射針を配置します。クランプし、注射針の周りの腸をシールするマイクロ剥離鉗子を使用し、そっと離れて糞便を洗浄する内腔を 10 mL の PBS をフラッシュします。
8. 優しく内腔を介してマイクロ剥離鉗子を織り、腸の壁をつまんで、鉗子の先端に近位の組織を取り消し、腸の組織を反転します。セグメントがインサイド アウトになるまでこのプロセスを繰り返しますを外側に向けルーメンと。
9. ミクロ解剖はさみを使用すると、組織のセグメントを 1 cm に切る。
10. マイクロ剥離鉗子を使用すると、転送 5 mL 滅菌 PBS で 50 mL ビーカー内の組織のセグメント。液化の一貫性に組織部分をミンチにミクロ解剖はさみを使用します。
11. 転送ピペットでクリーン 50 mL のチューブにみじん切りにした組織と 15 mL の氷冷 PBS を配置します。転送ピペットで 2 回をカップ刻んだ、解決、PBS 清 15 mL を削除し、新鮮な PBS に置き換えるにティッシュを待ちます。PBS がクリアされるまで、このプロセスを 3 回繰り返します。
12. 氷の上洗浄ティッシュ部分と 50 mL のチューブを置き、ティッシュ文化フードに氷のバケツ。

3. 酵素および機械的消化

1. 最初の消化
   1. 水の風呂に予め温めておいた消化メディアの 10 mL を含む 50 の mL の管の 1 つを取得します。50 mL チューブ 250 μ L の PBS コラゲナーゼの解決とみじん切りにした腸組織部分を追加します。
      注: 前の洗浄のステップから任意の PBS を含むを避けるために注意してください。
   2. 37 ° C で 5 分間 (結腸や空腸) 水のお風呂に 50 mL のチューブを配置します。2 管を振る毎分 x。
      注: 最適なタイミングと強度機械的消化の異なる場合があります、ユーザーが決定する必要があります。最適な消化条件を決定するには、各消化後細胞の 10 μ L の因数を表示できます。消化 1 中の細胞の塊の上清を含みます。
   3. ゆっくりと組織を 10 mL の血清ピペットで 1 回カップ刻んだ。簡単に作品を解決、組織し転送ピペットを使用して上清中の全体の 10 mL を削除します。
2. 2 番目の消化力: 3.1.1 に 3.1.3 の手順を繰り返します。コロンを消化する場合 10 分インキュベーション時間が長く、空腸の 5 分でインキュベーション時間を保ちます。
   注: 観測、上澄み成るべきであるまだ細胞の大きな塊。
3. 第 3 回消化
   1. 3.1.1 の手順を繰り返します
   2. 37 ° C の水浴 (コロンまたは小さい腸) 10 分間に 50 mL のチューブを配置します。消化力 1 と 2 よりもより高い強度で毎分 2-3 x がチューブを振る。
   3. ゆっくりピペット組織の 10 mL の血清ピペットと上下に。短い時間のために解決する組織の部分を許可します。
      メモ: 単一細胞と小さな塊の組み合わせの上澄みを含みます。
   4. 新しい 15 mL チューブに上清の 10 mL を配置温め EC 細胞の完全な文化メディア、2 mL を追加し、ミックスに一度反転転送ピペットを使用します。
   5. 100 × g室温で 5 分間で回転し、上清を除去する転送ピペットを使用します。転送ピペットを使って温めた EC 細胞完全な文化媒体の 2.5 mL の残りのペレットを再懸濁します。
4. 第 4 回消化: 3.3.1 に 3.3.5 の手順を繰り返します。コロンの 15 分インキュベーション時間を増加し、腸を 10 分のままに。
   注: 上清今単一のセルで構成されます。

4. 細胞培養

1. 転送ピペットを使用して新しい 15 mL チューブ (5 mL 容量) に消化力 3 と 4 から収集した細胞懸濁液を組み合わせます。
2. 診断とカウントし、室温で 5 分間 100 x gで残りの細胞懸濁液をスピンするセルの 10 μ L の因数を削除します。
   メモ: 最終的な細胞懸濁液が小さな塊と単一のセルで構成します。
3. 転送ピペットで上澄みを除去し、EC セル完全培地 1 mL あたり 1,000,000 セルの密度でペレットを再懸濁します。
   注: 細胞懸濁液の最終巻は、最後のセル数に依存します。一般的なセルは、2,000,000 からの 4,000,000 までをカウントします。
4. インキュベーターからコーティング ガラス底培養皿を削除します。P1000 ピペットを使用して、各培養皿から細胞外マトリックスを置き換えて最終的な細胞懸濁液を 250 μ l 添加します。
   注: 細胞外マトリックスのコーティングは、ガラス底皿の端に固執する傾向があります。ゲルの蓄積を防ぐために縁からコーティングを除去する特別な注意が必要です。
5. 1 mM で ROCK 阻害剤 Y-27632 の原液を作る。各皿に 10 μ M の ROCK 阻害剤の作業濃度を達成するために各ガラス底皿に原液の 2.5 μ L を追加します。
   注: この手順は、空腸文化の生存のために重要ですが、コロンは省略可能。
6. 72 に 24 h (図 1) の 37 ° C、5% CO₂インキュベーターで各培養皿を配置します。

5. 全細胞電気生理学の EC 細胞の調製

1. O リングを作るためにワックス フィルムの 2 つの 5 × 0.5 cm ストリップと顕微鏡ステージの内径を行します。O リング (図 2A B) 内 35 mm 細胞培養ディッシュをマウントします。
2. 両方の浮かんでいる残骸を洗い流し、未接続の細胞外マトリックスや死んだ細胞、EC から完全に培地の血清などを妨げるからどちらかを防ぐために細胞シール EC 細胞と電極の形成。徹底的な細胞の電気生理学のための十分な洗浄を実現する 3 つの次のオプションを使用:
   1. オプション 1: ソリューション exchange より効率的な長い室内楽円形より商工会議所します。EC 細胞培養丸 35 mm 料理で、料理用プラスチック製楕円の挿入を作成します。
      1. 3 D プリントすることによって伝統的な加工方法は、挿入を作成します。用いて挿入 (mm) で次の次元を持つアクリル樹脂から粉砕された: 外径 34.5;内側の楕円、20 x 9;外側の高さ、10;内側の高さ、1.5;橋のスパン、3 x 3;橋のクリアランス、1.5;入口と出口、4 × 4。
      2. 培養皿 (図 2の B) に挿入を下げ、0.1 cm 四角形 (図 2の C) x 0.3 x 1.2 に押された粘土の 2 つの 0.15、0.2 g で顕微鏡ステージの上部に固定します。
      3. プラスチック転送ピペットをゆっくりと反対側 (コンセント) から吸引しながら皿 (入口) の片側に細胞外ソリューションを追加します。
   2. オプション 2: エンジニア リング プラスチック製インサートなしソリューションを追加細胞外転送ピペットで料理 (入口) の片側から反対側 (コンセント) から吸引しながら。ゆっくりと反対側 (例えばS w n) 吸引針の配置をミラーリングしながら転送ピペット (例えばN s e) の位置を回転させます。
   3. オプション 3: ステップ 1.3.3 で長方形のカバーガラス上細胞外基質のコート。、4.4 の手順でこれらの coverslips に細胞懸濁液を文化。この coverslip を細胞外液、5.1 のステップを省略して、ステップ 5.3 をスキップでいっぱいの四角い部屋に転送します。オプション 1 (5.2.1.3) で説明したようにチャンバー内にプラスチック転送ピペットから細胞外の溶液をすすいでください。
3. 培養倒立顕微鏡 (図 2D) 上でステージを接続し直します。室温で無血清細胞外の溶液の EC 細胞培養を孵化させなさい。
4. 4 時間後に、上記のように再び細胞外溶液による文化をすすいでください。全細胞電気生理学を続行します。

6 EC 細胞初代培養からのセル全体電気生理学

1. セル全体のギガ シールを達成します。
   1. 1-5 MΩ の抵抗に 1 ダースの電極を引き出します。
      ノート: 10 100 GΩ シールをもたらす 1-2 MΩ 抵抗のピペットを発揮します。研磨電極ヒント火は GΩ シールを達成するために必要ではありません。
   2. ポリマーとすべてピペットの鼻の円錐形を均等にコートします。地面にピペット水平および垂直熱銃の前面に保持します。ポリマーを硬くなるまでピペットをゆっくりと回転します。
   3. 細胞内の溶液の因数を 15 mL の円錐管に注ぐ。1 mL 注射器経由で 1.5 mL 遠心チューブにこのソリューションの 1.2 mL を転送します。注射器に別 0.7 mL の細胞内の溶液を撤回します。注射器の端から空気を払拭します。柔軟な 34 G、67 mm 針、注射器を添付、この針から残りの空気を洗い流します。
   4. 識別、Tph1-CFP + セル他のセルまたは破片との接触ではないです。
   5. 細胞内の溶液で電極先端部を入力します。バックフィル シリンジ、ピペット。慎重に空気気泡界面を払拭するために指の爪でピペットをフリックします。
   6. 空気の 0.3 ml 策定プランジャー、6 mL の注射器をチューブ ホルダーのアウトレットに接続します。ホルダーに電極をマウントします。
      注: は、電極シーリング前に細胞内のソリューション内で中立または正圧を維持するためにお風呂のソリューションに入る前にチューブに注射器を接続します。
   7. 最初のステップの電圧はしご定常活性化電流を記録し、2 番目の手順の単一電圧で使用できる電流を記録する二段階電圧クランプ プロトコルを読み込みます。シール テストを開きます (5 50 kHz で mV)。
   8. 浴液に電極を下げます。、マニピュレーターで、電極先端の面と水平に直接セルからを操縦します。0.3 mL シリンジから空気を排出します。
   9. 優しくタッチする x 軸に沿って水平方向に電極を移動します。シール試験における膜抵抗に EC 細胞および/または増加に登場するディンプルを監視します。必要な場合は、過去のセルの正中線を動かさず、x 軸に沿って水平方向におよび/または z 軸に沿ってにダウン電極を調整してください。
   10. 適用 0.1 – 0.2 mL 6 mL の注射器に吸引します。100 MΩ が達成されるまでプランジャーを安定した保持し、ピストンからのグリップを解放します。ギガ シールにセルを待ちます。そっと忍び込んでモーションと注射器を外します。
       注: EC 細胞は最初に密閉されない場合があります再後続の試行でそれを封印することが可能。これを行うには、ゆっくりと EC 細胞から電極を引き出します < 20 MΩ シール抵抗。マニピュレーターの使用済み電極をステアリング、手動で明確な距離行列やゴミにターゲットを絞った EC 細胞を一周します。新鮮な電極を用いた EC 細胞をシールを試みます。
2. レコード全体細胞電位依存性 Na⁺現在。
   1. 0.5-1.0 策定 3 mL シリンジを添付 mL 空気。吸引のクイック タップを適用 (0.1 – 0.5 mL) 3 mL シリンジに。、全体のセルへのアクセスを達成するまでを繰り返し、ゆっくり注射器を切断します。
      注記: 注射器のパフォーマンスすることができます最初に変わるし、プランジャー 0.1 – 0.2 内で反動することを確保するためと使用、(人差し指の端シール) 3 mL シリンジであらかじめ練習時間とともに徐々 に変化、その開始の mL を配置します。されていない場合は、新しい 1 つの注射器を交換します。
   2. 全セル容量補正を入れます。容量や直列抵抗を調整します。シリーズ抵抗補正を入れます。60 ms で設定、遅れで予測し、修正のシリーズ抵抗補正を調整します。シールのテストを終了します。
   3. 全細胞電位依存性 Na⁺電流 (図 3A) の 5 失点の平均を記録します。
   4. すぐに電位依存性 Na⁺電流の 2 つのパラメーターのメモを取る: 現在] ウィンドウ (図 3B、赤のシンボル、交差点の定常状態の活性化と不活性化のカーブ) や Na⁺現在のピーク電圧密度です。
      注: EC 細胞 Na⁺電流よりも現在のクランプ モードにおける誘発電位を発生させる電圧クランプ モード一般的で-50 pA 行きます。また、-200 pA クランプ電圧 (図 3A)、通常より大きい電流発生電位膜電位 (赤い線、図 3D) の電圧付近から現在のクランプで自発的に、ウィンドウの現在の (赤い記号、図 3B)。
3. レコードには、活動電位が誘発されます。
   1. シリーズ抵抗補正をオフにします。外部コマンドをオフにします。・ クランプする V クランプからモードを切り替えます。ゲインを調整します。エピソードの現在クランプ プロトコルを読み込みます。保持 0 に電流の量を調整するペンシルバニア州外部コマンドをオンにします。
      注意: から切り替えないでください V クランプ ・ クランプ (またはその逆) 外部コマンドをオフ最初になし。
   2. 静止膜電位を注意してください。入力ウィンドウの現在の下膜電位が読み取られるように保持電流を調整する (例えば、 -100-80 mV)。電流入力のステップ間隔が (図 3Cはめ込み、+2 pA について-3 pA が現在保持している) 現在の持株の値よりも小さいので、エピソードの現在のクランプ プロトコルを調整します。
   3. レコードには、活動電位が誘発されます。活動電位の発射を電流の最小量に注意してください (図 3C、掃引を保持-3 pA から +4 pA ステップ 5 の 3 + 1 pA =)。
4. レコードの自発的な活動電位。
   1. 外部コマンドをオフにします。ギャップ フリー (間欠的) 現在クランプ プロトコルを読み込みます。
      注: セルに合うようにギャップのない現在のクランプ プロトコルの保持電流の量を確認するまで、背面外部コマンドを切らないでください。
   2. 活動電位は発生した誘発プロトコルで前回のスイープで電流量が現在の持株を変更 (図 32 番目のスイープ中にD、現在の入力、保持-3 pA から +2 pA ステップ-1 pA を =)。
   3. 外部コマンドをオンにします。ダブル予測保持電流が膜電位活動電位を発生させる閾値以下をもたらすことを確認します。必要な場合は、保持電流を調整します。自発的な活動を記録します。

結果

文化:
トランスジェニック Tph1 CFP モデルから作られた一次マウス上皮細胞は、4 時間後料理に接続し、24 に 72 h 間生理学実験の準備が整いました。培養条件が最適化されていない、大きな塊、浮遊細胞の残骸、破損した膜および EC 細胞 (図 1A) で CFP 微弱の上皮細胞培養が成っていた。電気生理学のために最適化されて...

ディスカッション

完全に EC 細胞機能を理解すると、全細胞電気生理学のための細胞を生成する高品質培養法が必要です。消化管上皮初代培養は、低い生存のため従来難しかった。この交絡要因を緩和する、現在メソッドは、数日間存続が可能な小規模または大規模な腸から単数形の EC 細胞の培養を生成します。

次が電気生理学に合うように文化の質の向上にとって重要なことが分かった...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm x 15 mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip	Monoject
3 mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6