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Method Article
* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.
위장 (GI) 상피에 Enterochromaffin (EC) 세포 enteroendocrine 세포의 가장 큰 부분 모집단을 구성합니다. 특수 감각 세포로 EC 셀 luminal 자극을 감지 하 고 세로토닌 (5-hyroxytryptamine, 5-HT) 출시 이벤트로 그들을 변환. 그러나, 그들은 어려운 문화 하 고 식별 하는 때문에이 세포의 전기 생리학 이해 가난 하 게 된다. 이 종이 윤곽선 주 EC 세포 배양에 메서드 단일 셀 전기 생리학에 대 한 최적화. 이 프로토콜은 혼합된 기본 문화권에서는, 전압 및 전류 클램프 모드에서 전체 세포 생리학의 높은-품질 레코딩 취득에 접근을 전진 마우스 EC 셀을 식별 하기 위해 유전자 변형 시안색 형광 단백질 (CFP) 기자를 활용 합니다.
위장 (GI) 상피는 여러 종류의 세포로 구성 된 다양 한 커뮤니티입니다. Enteroendocrine 셀 약 모든 상피 세포의 1%를 구성 하 고 enterochromaffin (EC) 세포가 가장 큰 enteroendocrine 셀 인구1. 최근 학문은 enteroendocrine2 와 EC3,4 셀 전기 고르기는 보여준다. 우리 주 EC 세포 생리학을 이해에 관심이 있습니다. 따라서,이 연구의 목적은 전체 세포 생리학에 대 한 최적화 된 기본 EC 셀 문화를 확립 했다.
생산 5-HT (예를 들어, QGP-15,6봉, KRJ-17) 분 비와 전기 생리학5,8 검사에 사용 되는 일반적으로에서 생성 된 기존 EC 셀 불후 종양 약 조직입니다. 이러한 셀 라인에서 획득 한 정보는 귀중 한5,8, 1 차 셀 전기 생리학의 연구 EC 세포 생리학을 제대로 이해 하는 데 필요한 있습니다. 기본 EC 셀의 전기 생리학 격리 상피 문화의 낮은 생존 능력에 의해 제한 된 단일 상피 세포의 문화 필요 합니다.
이 연구에서 제시 하는 문화 메서드 Tph1 CFP9,이 연구에 사용 된 같은 붙일 레이블된 EC 세포와 유전자 변형 쥐에 의존 합니다. 메서드를 사용 하면 최적화 혼합된 기본 상피 문화 개발 이전 단일 셀 전기 생리학32,10 . 이전 방법 효소 소화에 대 한 트립 신/EDTA 플러스 콜라 A 또는 EDTA와 DTT의 조합을 사용 하 고 특히 격리 하 고 기니 돼지11 와 쥐 EC 셀12문화 밀도 그라디언트를 사용. 더 최근에, 장 organoids는 생성 하 고 기계적 electrophysiological 녹음4에 대 한 중단 했다. 이러한 방법을 사용 하 여 문화는 세로토닌 실험, 실시간 정량 분석을 발표 하 고, 그들은 전기 생리학, 사용 될 수 있는 동안은 시간이 걸리는 organoid 세대, EC 셀을 식별 하기 위해 밀도 기울기의 성공에 의존 하 고는 트립 신, EDTA의 세포 파괴 효과입니다. 대조적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 효소 및 기계적 치료, 자란 조건 최적화 향상과 전기 생리학에 필요한 높은 휴대 전화 표준에 대 한 적합 한 단일 하 고 건강 한 EC 전지를 생산 하는 절차를 간소화.
이 메서드는 과학자 들을 불멸 하 게 문화 보다는 오히려 혼합된 문화 주 EC 셀에 작동 하 고 단일 셀의 전기 생리학을 조사를 위해 유용할 것 이다. 그러나, 그것은 덜 필요로 정렬 또는 장기 문화 생존 과거 72 h를 필요로 하는 세포 인구를 공부에 대 한 적절 한 증명할 수 있습니다.
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 메이 요 클리닉에 의해 승인 되었습니다. 이 프로토콜의 기본 셀 문화 부분 이전에 게시 방법을 참조할 수 있는 추가 정보10을 기반으로 합니다. 모든 실험 절차 (IACUC)에 의해 찬성 되어야 한다 그리고 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 해야 합니다.
1. 문화 준비
2. 조직 분리
3. 효소 및 기계적 소화
4. 세포 배양
5. 전체 셀 전기 생리학에 대 한 EC 셀의 준비
6. 전체 셀 주 문화에서 EC 셀의 전기 생리학
문화:
기본 murine 상피 세포 유전자 변형 Tph1 CFP 모델에서 만든 4 시간 후 요리에 첨부 하 고 24 ~ 72 h 사이 생리 실험에 대 한 준비가 되어. 문화 조건 최적화 되지 했다 때 상피 세포 배양 세포 파편, 손상 된 세포 막, 및 약한 CFP 신호 EC 세포 (그림 1A)에 떠 있는 큰 덩어리의 구성 되어 있습니다. 전기 생리학에 대 한 최적화 된 ...
EC 세포 기능을 완벽 하 게 이해 전체 세포 생리학에 대 한 셀을 생성 하는 높은-품질 주 문화 메서드를 필요 합니다. GI 상피의 기본 문화 어려운 낮은 생존 때문에 전통적으로 했다. 경감이 혼동 요인, 현재 메서드는 며칠 동안 살아남을 수 있는 작은 또는 큰 창 자에서 단 수 EC 세포의 문화를 생성 합니다.
우리는 다음 문화 전기 생리학에 적합 하도록 품질 향상을 위한 중요 한...
없음
저자는 관리 지원에 대 한 부인을 Lyndsay 버스 비와 씨 로버트 Highet 메이 요 클리닉 부문 엔지니어링 설계 및 3D 인쇄 문화 접시 삽입의에서 감사합니다. 이 작품 AB와 NIH에 셀 위장 (NIH P30DK084567)와 2015 미국 Gastroenterological 협회 연구 학술 상 (AGA RSA) 신호에 대 한 NIH K08 AB (DK106456), 조종사와 메이 요 클리닉 센터에서 ab 타당성 부여에 의해 지원 되었다 GF (DK52766)을 R01입니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
R6101 | Dow Corning | ||
6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
Electrophysiology Equipment | |||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
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