אלקטרופיזיולוגיה התא כולו של ראשי Enterochromaffin מאתר בתרבית תאים

Katilyn Knutson; Peter R. Strege; Joyce Li; Andrew B. Leiter; Gianrico Farrugia; Arthur Beyder

doi:10.3791/58112

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

תאים Enterochromaffin (EC) מהווים תת קבוצה קטנה של מערכת העיכול תאים אפיתל. תאים EC חשמלית טמפרמנט, לשחרר סרוטונין, אך קשיים culturing זיהוי תאים EC מוגבלת מחקרים פיזיולוגיים. השיטה המוצגת כאן יוצר מודל תרבות ראשי לבצע בדיקה של תאים בודדים EC מאת אלקטרופיזיולוגיה.

Abstract

Enterochromaffin (EC) בתאי האפיתל במערכת העיכול (GI) מהווים את subpopulation הגדול של תאים enteroendocrine. כמו תאים חושית מיוחדים, EC התאים לחוש בגירויים luminal, להמיר אותם לתוך האירועים שחרור סרוטונין (5-hyroxytryptamine, 5-HT). עם זאת, אלקטרופיזיולוגיה של תאים אלה ממעטים להבין כי הם קשים לתרבות, וכן לזיהוי. השיטה המובאת הזה תרבויות של נייר מתאר תא EC העיקרי ממוטב אלקטרופיזיולוגיה תא בודד. פרוטוקול זה מנצל כתב מהונדס חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) כדי לזהות תאים EC עכבר בתרבויות העיקרי מעורבת, קידום הגישה להשגת הקלטות באיכות גבוהה של כל התא אלקטרופיזיולוגיה במצבי מתח, זרם-מלחציים צולבים.

Introduction

מערכת העיכול (GI) האפיתל היא קהילה מגוונת בהיקף של מספר סוגי תאים. תאים Enteroendocrine מהווים בערך 1% של כל תאי אפיתל, תאים enterochromaffin (EC) הגדול enteroendocrine תא האוכלוסייה¹. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי enteroendocrine² ו EC³^,⁴ תאים חשמלית להתרגש. אנו מעוניינים בהבנת אלקטרופיזיולוגיה העיקרי של התא EC. לפיכך, מטרת מחקר זה היה להקים ראשי תרביות תאים של EC, אופטימיזציה עבור התא כולו אלקטרופיזיולוגיה.

תא EC קיימים קווים לייצר ו להפריש 5-HT (למשל, QGP-1⁵, בון⁶, KRJ-1-⁷), השתמשו כדי לבחון אלקטרופיזיולוגיה⁵^,⁸ נוצרות בדרך כלל מן מונצחים אמצעים רקמות. בעוד המידע שנרכש שורות תאים אלה הוא בעל ערך⁵^,⁸, מחקרים של התא הראשי אלקטרופיזיולוגיה נחוצים להבין כראוי פיזיולוגיה של התא EC. אלקטרופיזיולוגיה התאים EC הראשי דורש את הבידוד והתרבות של תאי אפיתל יחיד, אשר היה מוגבל על ידי הכדאיות נמוכה של תרבויות אפיתל.

שיטת תרבות שהוצגו במחקר זה מסתמך על העכברים הטרנסגניים עם תאי EC fluorescently שכותרתו, כמו Tph1-CFP⁹, השתמשו במחקר זה. השיטה מייעל יסודי מעורב תרבויות אפיתל שפותחו בעבר²^,¹⁰ עבור תא בודד אלקטרופיזיולוגיה³. שיטות קודמות שימשו שילובים של טריפסין/EDTA פלוס Collagenase A או EDTA ו- DTT עיכול אנזימטי, נהגה צפיפות מעברי צבע במיוחד לבודד, תרבות שפן¹¹ ועכברוש EC תאים¹². לאחרונה, organoids מעיים היו שהופקו, מכנית שיבשו עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות⁴. תרבויות בשיטות אלה מתאימים היטב עבור סרוטונין לשחרר ניסויים, ניתוח RT-qPCR, בעוד הם יכולים לשמש אלקטרופיזיולוגיה, הם מסתמך על ההצלחה של תא צורב זמן רב דור, צפיפות מעברי צבע כדי לזהות תאים EC, ו תאית ההשפעות משובש של טריפסין EDTA. לעומת זאת, פרוטוקול המתוארים כאן משפר אנזימטי וטיפולי מכני מייעל תנאים culturing, מייעל את ההליכים כדי לייצר יחיד ובריא EC תאים מתאים הסטנדרטים הגבוהים הסלולר לצורך אלקטרופיזיולוגיה.

שיטה זו יהיה שימושי עבור מדענים אשר רוצה לעבוד על ראשי תאים EC תרבויות מעורבים יותר מאשר תרבויות מונצחים ואני רוצה לחקור את אלקטרופיזיולוגיה של תאים בודדים. עם זאת, זה עשוי להתברר פחות מתאים ללמוד תא האוכלוסיות זקוקים תרבויות המיון או לטווח ארוך הדורשים הישרדות בעבר 72 h.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של מרפאת מאיו. החלק התרבות התא העיקרי של פרוטוקול זה מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר יכול להפנות עוד פרטים¹⁰. כל ההליכים ניסיוני תאושר ע י (IACUC), כל הניסויים חייב להתבצע בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות.

1. תרבות הכנה

מדיה.
1. להכין EC תא מדיה תרבות שלמה עם גלוקוז גבוהות [4500mg/L] Dulbecco של שינוי נשר בינוני (DMEM) בתוספת 5% עוברית שור סרום (FBS), 1%-גלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (טבלה 1).
  הערה: מדיה שניתן לאחסן ב 4 ° C עד לחודש אחד.
2. מסנן התקשורת תרבות EC מלאה תא ומניחים 25 מ של מדיה לתוך צינור 50 מ ל- 37 מעלות צלזיוס.
3. הכנת מערכת העיכול מדיה עם גלוקוז גבוהות [4,500 mg/L] DMEM בתוספת 0.1% שור אלבומין (BSA) (טבלה 1).
4. לסנן את המדיה עיכול למקם aliquots 4 10 מ"ל של מדיה לתוך צינורות נפרדת 50 מ ל, דגירה באמבט מים 37 º C.
  הערה: מדיה שניתן לאחסן ב 4 ° C עד לחודש אחד.
אנזים.
1. שוקלים לצאת מ ג (עבור מעי צם) או 24 מ ג (עבור המעי הגס) של שי Collagenase [≥800 יחידות/mg] צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  הערה: Collagenase הוא יציב ב-20 ° C עד שנה אחת.
2. Resuspend את collagenase aliquot. ב 1 מ"ל של PBS קר קרח עם Ca^{2 +} ו- Mg^{2 +}. מערבולת לפתרון יסודי לשלב, ומניחים על קרח.
ציפוי לוחות תרבות.
1. הפשרת 150 µL של מטריצה חוץ-תאית בן לילה-4 הלעפה תרוטרפמט על קרח.
2. הפוך פתרון מטריצה חוץ-תאית 5% w/v על ידי ערבוב 100 µL של מטריצה חוץ-תאית המופשרים עם 2 מ של DMEM גבוהה-גלוקוז ללא סרום קר כקרח.
  הערה: מטריצה חוץ-תאית עפור בטמפרטורת החדר, צריך להיות מטופל עם פיפטות טרום מקורר, צינורות התקשורת עד מוכן המעיל מנות.
3. מיד מעיל זכוכית מהמעגל הפנימי של מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון עם 250 µL של הפתרון מטריצה חוץ-תאית 5%. מתכון זה יכסה עד 8 מנות.
4. למקם את הכלים למטה זכוכית חממה 37 ° C במהלך השלבים הנותרים של בידוד התרבות תאים. מטריצות לוקח מינימום של 1 h לקביעת אך יכול להיות מודגרות עבור עד 2.5 שעות תוך כדי ביצוע צעדים בידוד אחרים.
  הערה: Incubations יותר 3 h ניתן ליצור שיצטברו מטריצה חוץ-תאית אשר יכול לעכב חותם היווצרות במהלך אלקטרופיזיולוגיה התא כולו.

2. רקמת בידוד

בהתאם להנחיות אתית, להקריב 3to 6 בת שבוע זכר או נקבה Tph1-CFP הטרנסגניים העכבר (מלאי מעבדה ג'קסון: 028366)⁹ או עוד מאמץ כתב.
הערה: אנו משתמשים מנה קטלנית של עולה רמות של פחמן דו-חמצני ו. תאמת צוואר הרחם כמו כמה נפגעים אומר להבטיח מוות. הוועדה AVAM על המתת חסד גם מחשיב נקע בצוואר הרחם שיטה המתת חסד העיקרי המותר על ידי אנשים מאומנים להשתמש בה אם בעלי החיים הם תחילה מורדמת.
להצמיד את העכבר לאללה בחוץ על הבמה חיתוך פוליסטירן מוקצף באמצעות מחטים 21 G. Decontaminate בבטן עכבר עם 70% אתנול.
משוך את העכבר העור מתוח באמצעות ניתוח מיקרו מלקחיים (#5) ולאחר מכן השתמש מספריים כירורגיים חדה לעשות חתך רוחבי בחלק התחתון של הבטן העכבר כדי לחשוף את חלל בקרום הבטן. לבצע חיתוך נוסף אנכית את הבטן עד הצלעות חשוף.
השתמש המלקחיים ניתוח מיקרו כדי לעבור את המעי האטום השמאלי של העכבר כדי להשיג תצוגה ברורה של המעי הגס.
להשתמש את המספריים ניתוח מיקרו כדי לחתוך את החלק הדיסטלי ביותר של המעי הגס (אך עדיין proximal פי הטבעת) ולהפוך רגע דיסטלי לחתוך הבטן. מקום המעיים חילוץ לתוך 100 x 15 מ מ² פטרי מלא עם 20 מ של פוספט כקרח buffered תמיסת מלח (PBS).
השתמש סרגל קטן כדי למדוד ולחתוך את 10 ס מ של או אמצע המעי הגס או המעי הריק. תמצית המעי הגס במדידת על קטע 10 ס מ של המעי הממוקם הציר הקרוב החתך הראשון לקח מעל פי הטבעת. לזהות מעי צם על-ידי קיפול המעי הדק כולו לחצי וביצוע חתך הראשונה באמצע, חתך השני 10 ס מ proximal הראשון לחתוך.
הערה: להמשיך לבצע את כל השלבים הבאים בידוד על קרח.
ממלאים מזרק 6 מ עם PBS קר קרח ומניחים את המחט מזרק לתוך לומן מקטע המעי שחולצו. להשתמש המלקחיים ניתוח מיקרו מלחציים. ואטמו את המעיים סביב המחט מזרק, ותוציאו בעדינות 10 מ"ל של PBS דרך לומן לשטוף את החומר הצואתי משם.
היפוך רקמת המעי בעדינות אריגה המלקחיים ניתוח מיקרו דרך לומן, צובט את דופן המעי ועל היציבה הרקמה קרובים לקצה של המלקחיים. חזור על תהליך זה עד שהמקטע מבפנים ומבחוץ עם לומן פונה החוצה.
השימוש ניתוח מיקרו מספריים לחתוך על קטע רקמה לחתיכות 1 ס מ.
להשתמש מלקחיים ניתוח מיקרו להעביר את מקטעי רקמת בתוך 50 מ ל מלא עם 5 מ"ל PBS סטרילי. השתמש את המספריים ניתוח מיקרו לרכך את חתיכות רקמה כדי עקביות liquified.
מקם את רקמת טחון ו-15 מיליליטר PBS קר קרח צינור נקי 50 מ על ידי העברת פיפטה. Triturate פי 2 עם פיפטה העברה, לחכות הרקמה כדי ליישב, להסיר 15 מ"ל של תגובת שיקוע PBS ולהחליף עם PBS טריים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים עד מגניב ברור.
במקום הצינור 50 מ עם חתיכות רקמה שטף על קרח, להביא דלי קרח לתוך ברדס תרביות רקמה.

3. עיכול אנזימטי ועל מכניים

עיכול הראשון
1. מ המים הרותחים, לאחזר שפופרת 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של עיכול מראש ומחוממת מדיה. כדי הצינור 50 מ ל, להוסיף 250 µL של PBS collagenase פתרון וחתיכות עוף טחון רקמת המעי.
  הערה: לטפל כדי למנוע כולל כל PBS מצעדי כביסה הקודם.
2. למקם את הצינור 50 מ ל אמבט מים במשך 5 דקות (המעי הגס או המעי הריק) ב 37 º C. לנער את הצינור 2 x לכל מין.
  הערה: אופטימלית התזמון והעוצמה של עיכול מכני משתנות, ויש צריך להיקבע על-ידי המשתמש. כדי לקבוע את התנאים לעיכול אופטימלי, ניתן להציג aliquot 10 µL תאים לאחר כל מערכת העיכול. במהלך העיכול 1, תגובת שיקוע צריכה להכיל גושים של תאים.
3. לאט לאט triturate את הרקמה פעם אחת עם פיפטה סרולוגית 10 מ. בקצרה תן הרקמה חתיכות להתיישב ולאחר מכן השתמש פיפטה של העברה כדי להסיר את כל 10 מ"ל של תגובת שיקוע.
שניה לעיכול: חזור על שלבים 3.1.1 ל 3.1.3. להאריך את זמן הדגירה כדי 10 דקות אם עיכול נקודתיים ולשמור זמן הדגירה ב 5 דקות עבור מעי צם.
הערה: בעת התבוננות, תגובת שיקוע צריכה עדיין להיות מורכבת גושים גדולים של תאים.
עיכול השלישי
1. חזור על שלב 3.1.1
2. מקם את הצינור 50-mL באמבט מים הלעפה תרוטרפמט 37 10 דקות (המעי הגס או המעי הריק קטנה). לנער הצינור x 2-3 כל דקות בעוצמה גבוהה יותר מאשר Digestions 1 ו-2.
3. לאט לאט pipette את הרקמה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית 10-mL. לאפשר את חתיכות רקמה להתיישב לזמן קצר.
  הערה: תגובת שיקוע צריכה להכיל שילוב של תאים בודדים גושים קטנים.
4. השתמש פיפטה של העברת מקום 10 מ"ל של תגובת שיקוע לתוך צינור 15 mL החדש, להוסיף 2 מיליליטר ומחוממת EC תא מלאה תרבות המדיה של היפוך פעם לערבב.
5. ספין-x 100 g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן השתמש פיפטה של העברה כדי להסיר את תגובת שיקוע. להשתמש על פיפטה העברה resuspend בגדר הנותרים ב 2.5 מ ל ומחוממת EC תא מלאה תרבות המדיה.
עיכול הרביעי: חזור על שלבים 3.3.1 ל 3.3.5. להגדיל את זמן הדגירה 15 דקות עבור המעי הגס ולהישאר ב 10 דקות עבור מעי צם.
הערה: תגובת שיקוע צריכה עכשיו להכיל תאים בודדים.

4. תרבית תאים

להשתמש על פיפטה העברה כדי לשלב את המתלים תא שנאסף Digestions 3 ו- 4 לתוך צינור 15מל (הנפח הכולל של 5 מ"ל).
הסר את aliquot 10 µL של תאים כדי למנות עם hemocytometer ספין התליה תא הנותרים ב 100 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: התליה תא הסופי יכלול גושים קטנים של תאים בודדים.
הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה העברה, resuspend בגדר EC תא מלאה תרבות בתקשורת על צפיפות של תאים 1,000,000 לכל mL.
הערה: הנפח הסופי של התא ההשעיה יהיה תלוי ספירת הסופי. בתא טיפוסי סופרת נעות בין 2,000,000 4,000,000.
הסר מנות תרבות מצופה זכוכית-התחתון של החממה. השתמש פיפטה P1000 כדי להחליף מטריצה חוץ-תאית של כל מנה תרבות µL 250 של התליה תא הסופי.
הערה: ציפוי מטריצה חוץ-תאית נוטה לדחוף את הקצוות של המנה זכוכית-התחתון. טיפול מיוחד יש לנקוט כדי להסיר את הציפוי מ לאורך הקצה כדי למנוע הצטברות ג'ל.
להפוך את פתרון מניות של רוק מעכב Y-27632-1 מ מ. להוסיף 2.5 µL של פתרון מניות כל מנה התחתון זכוכית כדי להשיג ריכוז עבודה של 10 מיקרומטר מעכב רוק בכל מנה.
הערה: שלב זה הוא קריטי להישרדותה של מעי צם תרבויות אך הוא אופציונלי עבור המעי הגס.
מקם כל מנה תרבות 37 ° C ו- 5% CO₂ מגשים עבור 24 עד 72 h (איור 1).

5. הכנה של EC תאים התא כולו אלקטרופיזיולוגיה

קו הקוטר הפנימי של השלב מיקרוסקופ עם שתי רצועות 5 x 0.5 ס מ של הסרט שעווה כדי ליצור o-ring. הר המנה תרבות תא 35 מ מ בתוך o-ring (איור 2א-ב).
לשטוף שתי פסולת צפים, כגון מטריצה חוץ-תאית כעיגולים בצבע או תאים מתים, תרבות המדיה סרום לחלוטין מן EC תאים כדי למנוע גם מלסכל את חותם היווצרות בין תא EC אלקטרודה. השימוש משלוש האפשרויות הבאות כדי להשיג תא יסודית כביסה מספיק עבור אלקטרופיזיולוגיה:
1. אפשרות 1: המרת פתרון יעיל יותר בחדר זמן רב יותר עגול קאמרית. מאז התאים EC היו תרבותי במנות עגול 35 מ מ, ליצור הכנס אליפטית פלסטיק עבור המנה.
  1. צור את תותב על-ידי הדפסת תלת-ממד או שיטות הטחינה המסורתית. תותב השתמשנו נגרס מ פלסטיק אקרילי בעל הממדים הבאים (במ מ): הקוטר החיצוני, 34.5; אליפסה הפנימי, 20 x 9; גובה חיצוני, 10; גובה פנימי, 1.5; גשר טווח, 3 x 3; גשר סיווג, 1.5; מפרץ צר, שקע, 4 x 4 כל אחד.
  2. הנמך את תותב לתוך המנה תרבות (איור 2א-ב) ואבטח אותו לחלק העליון של השלב מיקרוסקופ עם שתי חתיכות 0.15 ל 0.2 גרם של בפלסטלינה לחץ לתוך 1.2 x 0.3 x ס מ 0.1 מלבנים (איור 2A-C).
  3. באמצעות פיפטה העברת פלסטיק, לאט להוסיף פתרון חוץ-תאית לצד אחד של המנה (כניסה) תוך כ רפה בעברית מן הצד השני (עודפים).
2. אפשרות 2: בלי מוסף פלסטיק מהונדסים, להוסיף פתרון חוץ-תאית על ידי העברת פיפטה מצד אחד של המנה (כניסה) תוך כ רפה בעברית מן הצד הנגדי (עודפים). לאט לאט לסובב את המיקום של העברת פיפטה (למשל, N כדי E S) תוך שיקוף מיקום המחט השאיפה בצד הנגדי (למשל, S כדי W כדי N).
3. אפשרות 3: המעיל מטריצה חוץ-תאית על coverslips מלבני בשלב 1.3.3., ואת תרבות התליה תא על אלה coverslips בשלב 4.4. העבר הזה coverslip תא מלבני מלא עם פתרון חוץ-תאית, תוך השמטת שלב 5.1, דילוג על שלב 5.3. יש לשטוף את התא עם פתרון חוץ-תאי של פיפטה העברת פלסטיק, כפי שמתואר באפשרות 1 (5.2.1.3).
צרף מחדש את הבמה עם התרבות התא מעל המיקרוסקופ הפוכה (איור 2D). דגירה התרבות התא EC בפתרון ללא סרום חוץ-תאית בטמפרטורת החדר.
לאחר 4 שעות, שוטפים את התרבות שוב עם פתרון חוץ-תאית כמתואר לעיל. להמשיך עם אלקטרופיזיולוגיה התא כולו.

6. כל התא אלקטרופיזיולוגיה של EC תאים מתרבות ראשי

השגת כל התא גיגה-חותם
1. הצמד לתריסר אלקטרודות התנגדות של 1-5 MΩ.
  הערות: פיפטות של 1 – 2 MΩ התנגדות המניבים 10-100 GΩ חותמות לבצע בצורה הטובה ביותר. אש ליטוש את הטיפים אלקטרודה אין צורך להשיג אטמים GΩ.
2. מעיל באופן שווה את האף חרוט פיפטות כל עם פולימר. להחזיק פיפטה אופקי לקרקע בניצב בחזית אקדח חום. סובב את פיפטה לאט עד מחזק את הפולימר.
3. שופכים על aliquot של פתרון תאיים לתוך צינור חרוטי 15-mL. להעביר 1.2 מ של פתרון זה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL באמצעות מזרק 1-mL. לסגת מ ל 0.7 נוסף של פתרון תאיים לתוך המזרק. לסלק את האוויר מהקצה של המזרק. להצמיד G 34 גמיש, 67 מ מ המחט אל המזרק, ואין לשטוף כל האוויר שנותרו מן את המחט.
4. זיהוי של Tph1-CFP + תא שאינו במגע עם תאים או פסולת אחרים.
5. למלא את הטיפ אלקטרודה עם פתרון תאיים. מילוי פיפטה על ידי מזרק. קפיצי בקפידה על פיפטה עם ציפורן להפריך את הממשק בועות אוויר.
6. עם הבוכנה רב-שנתית עם mL 0.3 של אוויר, לצרף מזרק 6 מ ל שקע של בעל אבובים. בעיא האלקטרודה למחזיק.
  הערה: חבר את המזרק הצנרת לפני האלקטרודה חודר הפתרון לאמבטיה כדי לשמור על הלחץ נייטרלית או חיובית בתוך הפתרון תאיים לפני איטום.
7. לטעון את פרוטוקול מתח-קלאמפ שני שלבים רשומות זרמי הפעלת מצב יציב על ידי סולם מתח על המדרגה הראשונה ומתעדת את הזרמים זמינים על ידי מתח יחיד על המדרגה השנייה. תפתח את דפי הבחינה חותם (5 mV ב- 50 קילו-הרץ).
8. להוריד את האלקטרודה בתוך תמיסת אמבט. עם micromanipulators, לתמרן את האלקטרודה עצה בתוך המטוס עם ואופקיים ישירות מהתא. לגרש את mL 0.3 של אוויר במזרק.
9. הניעי בעדינות האלקטרודה אופקית לאורך ציר ה-x לגעת התא. Watch עבור גומת חן יופיעו התא EC ו/או עלייה בהתנגדות ממברנה בבחינה חותם. במידת הצורך, להסתגל האלקטרודה למטה לאורך ציר z ו/או אופקית לאורך ציר ה-x, לא עוברת דרך האמצע של התא.
10. החלת 0.1-0.2 מ"ל שאיבה על המזרק 6-mL. החזק על הבוכנה יציב עד 100 MΩ מושגת, ואז לשחרר את האחיזה של הבוכנה. המתן עד לתא גיגה-חותם. בעדינות נתק את המזרק עם תנועה unscrewing.
  הערה: אם תא EC לא לאטום תחילה, אולי אפשר לאטום אותו מחדש עם הנסיון הבא. כדי לעשות זאת, משוך בעדינות את האלקטרודה מן תא EC עם < 20 MΩ חותם ההתנגדות. היגוי האלקטרודה בילה עם micromanipulators, להקיף את התא EC יישוב מטריקס ידנית ברור משם או פסולת. לאחר מכן, לנסות לסגור את התא EC עם אלקטרודה טריים.
כל התא תקליטים ממותגת מתח Na⁺ הנוכחית.
1. לצרף מזרק 3 מ"ל רב-שנתית עם 0.5-1.0 מ"ל אוויר. להחיל האזנה מהירה של שאיבה (0.1-0.5 מ"ל) במזרק 3 מ ל. חזור עד סלולרי כל גישה מושגת, ואז בעדינות לנתק את המזרק.
  הערה: ככל הביצועים של מזרק יכול להשתנות בתחילה לשנות בהדרגה עם הזמן והשימוש, תרגול מראש עם המזרק 3 מ"ל (איטום הסוף עם אצבע קלה על אינדקס) כדי להבטיח כי הבוכנה יירתע בתוך 0.1-0.2 מ ל שלה מתחיל למקם. אם לא, אז להחליף את המזרק אחד חדש.
2. הפעל את כל התא קיבוליות פיצוי. להתאים את התנגדות קיבול וסדרות. הפעל את סדרת ההתנגדות פיצוי. עם השהיה שוכן בגובה 60 ms, להתאים החזוי ואז המתוקן סדרת ההתנגדות פיצוי. סגור את המבחן חותם.
3. שיא ממוצע של 5 ריצות של זרם Na⁺ ממותגת מתח של תאים שלמים (איור 3א).
4. מהר לרשום שני פרמטרים של ממותגת מתח זרם Na⁺ : המתח על החלון הנוכחי (איור 3B, סמלים אדום, הצומת של מצב יציב הפעלה, איון עקומות) והזרם Na⁺ שיא צפיפות.
  הערה: EC תאים עם זרמים Na⁺ שיא יותר מ-50 הרשות במצב מתח קלאמפ נפוץ תמשיך לירות פוטנציאל elicited במצב הנוכחי של קלאמפ. בנוסף, זרמים גדול מ-200 הרשות קלאמפ מתח (איור 3א) אזי בדרך כלל אש פוטנציאל פעולה באופן ספונטני בתוך מלחציים הנוכחי של פוטנציאל הממברנה (הקו האדום, איור 3ד') ליד וולטאג החלון הנוכחי (סימנים אדומים, איור 3ב).
שיא elicited פוטנציאל פעולה.
1. לבטל את הפיצוי התנגדות סדרה. בטל את הפקודה חיצוניים. לעבור את המצב של V-קלאמפ-קלאמפ. להתאים את הרווח. לטעון את פרוטוקול קלאמפ הנוכחי אפיזודי. התאימו את כמות המעצר הנוכחי ל- 0 הפלסטינית. הפעל את הפקודה חיצוניים.
  התראה: אל תכבו מ- V-קלאמפ-קלאמפ (או להיפך) ללא הראשון כיבוי הפקודה חיצוניים.
2. הערה פוטנציאל ממברנה מנוחתו. התאם את המעצר הנוכחי קלט כך פוטנציאל ממברנה קורא מתחת לחלון הנוכחי (למשל -80 ל-100 mV). להתאים את הפרוטוקול קלאמפ הנוכחי אפיזודי כך המרווח שלב של הקלט הנוכחי הוא קטן מהערך של החזקת הנוכחי (איור 3C שיבוץ, +2 שלבים הרשות עבור הרשות הפלסטינית-3, מחזיקה הנוכחי).
3. שיא elicited פוטנציאל פעולה. הערה הסכום של נוכחי הזרקת לפטר את פוטנציאל הפעולה של לפחות (איור 3C, לטאטא 3 מתוך 5, צעד +4 הרשות מן הרשות הפלסטינית-3, מחזיקה = +1 הרשות הפלסטינית).
שיא פוטנציאל פעולה ספונטנית.
1. בטל את הפקודה חיצוניים. טען קלאמפ פרוטוקול הנוכחי הפער ללא (שאינם אפיזודי).
  הערה: לא להדליק את הפקודה חיצוני עד כמות מחזיק הנוכחי בפרוטוקול קלאמפ נטולת הפער הנוכחי אומת להיות מתאים עבור התא.
2. לשנות את המעצר הנוכחי יהיה הסכום של זרם מזריקים את ניקיון אחרון בפרוטוקול elicited זה לא ירו של פוטנציאל הפעולה (איור 3D, הקלט הנוכחי במהלך לטאטא את השני, צעד +2 הרשות מן הרשות הפלסטינית-3, מחזיקה =-1 הרשות הפלסטינית).
3. הפעל את הפקודה חיצוניים. בדוק כי החזקת החזוי הנוכחי מביא קרום פוטנציאליים מתחת לסף לירי של פוטנציאל הפעולה. התאם את המעצר הנוכחי במידת הצורך. פעילות ספונטנית הרשומה.

תוצאות

תרבויות:
העיקרי בתאי אפיתל מאתר זני דגם Tph1-CFP הטרנסגניים לצרף מאכלים לאחר 4 שעות, מוכנה לניסיונות פיזיולוגי בין 24 עד 72 שעות. כאשר לא היה כבר מותאם לתנאים תרבות, התרבות תאים אפיתל כללה גושים גדולים, צף פסולת הסלולר ממברנות פגום, האות חלש CFP בתאים EC (איור 1...

Discussion

ההבנה המלאה EC תפקוד התא מחייב שיטה תרבות ראשי באיכות גבוהה כדי ליצור תאים עבור כל התא אלקטרופיזיולוגיה. תרבויות העיקרי של האפיתל GI באופן מסורתי היתה קשה, בגלל הישרדות נמוך. להקלה גורם מבלבלים זה, השיטה הנוכחית מניבה תרביות של תאים EC יחיד מן המעי קטנה או גדולה, כי הם מסוגלים לשרוד במשך מספר י...

Disclosures

אף אחד

Acknowledgements

המחברים תודה גברת באזבי Lyndsay לסיוע מינהלי מר רוברט Highet מ מאיו קליניק חטיבת להנדסה עיצוב והדפסה תלת-ממד של תרבות מאכל הקדמי. עבודה זו נתמך על ידי NIH K08 AB (DK106456), טייס, מענק היתכנות AB ממרכז מרפאת מאיו עבור איתות התא בגסטרואנטרולוגיה (NIH P30DK084567) ופרס 2015 אמריקאי Gastroenterological האגודה מחקר מלומד (AGA RSA) AB ו- NIH R01 ל GF (DK52766).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm x 15 mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip	Monoject
3 mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6

References

Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 Gastrointestinal enterochromaffin

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: